” o i B l i t rlo n e Ca g r “ e CORSO DIPi GENETICA o n i o rb t r U e i b d o COSTRUZIONE DI MAPPE GENICHE R tà i s r e v i n U Rapporto fenotipico tra diibridi Mendel ” o altri caratteri… Frequenza dei gameti: 1:1:1:1 i B l i AaBb x AaBb t rlo n e Ca g r “ e PPLL x ppll i o A-B- 9 P in o rb t A-bb 3 r PpLl x PpLl U e i b aaB- 3 d o R tà 4831 porpora allungato (P-L-) aabb 1 i s r 390 porpora rotondo (P-ll) e Anche Batesonive Punnett 393 rosso allungato (ppL-) n (1905) lavorarono sul Pisum Mendel, ma con sativum di U Colore fiore : porpora (P) o rosso (p) Forma del granello di polline: allungato (L) o rotondo (l) 1338 rosso rotondo (ppll) Gli esperimenti di Bateson e Punnett i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o Accoppiamento (coupling ) ” o i B l i t rlo n e Ca g Tendenza dei doppi dominanti e dei doppi r “ einsiemeo nei gameti. i recessivi a rimanere P in o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U Ancora Morgan… ” o i +pr + vg+vg+ B l x pr i Colore dell’occhio: t rlo n porpora (pr) o e Ca g r “ rosso (pr+) e + x pr-pr- vg-vgo -ipr+ vg-vg pr F1 P n Ali: vestigiali (vg) i o b t o lunghe (vg+) r r U e + vg+ i b pr 1339 d o R tà pr- vg1195 i + vgs pr 151 r II due due dominanti dominantie ee ii - vg+ pr 154 v i due recessivi stanno due recessivi stanno n inin accoppiamento. U accoppiamento. Totale 2839 pr-pr- vg-vg- Se ciascuno dei genitori è omozigote per un recessivo i rapporti cambiano: ” o i B l i t rlo n e Ca g r “ + + e pr pr vg vg xi pr pro vg-vg- F1 P in o + t prr vg+ rb157 e - vg- U 146 pr i b d o + R prtà vg- 965 i - vg+ pr 1067 s r e v Totale 2335 i n U pr+pr+ vg-vg- x pr-pr- vg+vg+ I due dominanti e i due recessivi stanno in repulsione. Ricombinanti ” o i B l i Anche in questi esperimenti era possibilet recuperare i fenotipi o l n r ricombinanti, quelli cioè in cui i geni e si erano ariassortiti, ma la g C loro frequenza rispetto ai parentalirnon era“più 50%, bensì molto e o i meno. P in o rb t r Morgani intuì che i due geni prUe vg fossero localizzati sullo e i stesso cromosoma. b d o R tà i s A seconda della disposizione degli alleli (accoppiamento o r e repulsione) i genitori trasmettono o cromosomi con pr vg e prvg, v i n oppure cromosomi con pr vg e prvg+ con frequenza diversa da U quanto atteso in base agli esperimenti di Mendel. + + + Accoppiamento (coupling) i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e I gameti più frequenti formati dagli v i n +vg+ e pr-vg-. individui F saranno pr 1 U ” o Repulsione (repulsion) i B l i t rlo + n e Ca g + r “ e i o P n + i o rb t r U e i b + d o R tà i s r e v i più frequenti formati dagli I gameti n Uindividui F1 saranno pr+vg- e pr-vg+. ” o Come si originano le ” o classi meno frequenti? il B i lo t n r e a g “C r e o i P in o rb t r U e i b d o R tà i s si originano in seguito a crossing over, cioè Le classi meno frequenti r e in seguito a uno scambio fisico tra i due omologhi. v i n a quelli dei genitori vengono chiamati parentali; I cromosomi U identici quelli diversi dai genitori vengono chiamati ricombinanti. Il crossing over avviene in ” o i B l profase di meiosi I i t lo n r e a g “C r e o i P in o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U I chiasmi sono la manifestazione visibile del crossing over” o i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U Il crossing over ” o i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U Questo è l’unico momento in cui i due cromatidi fratelli sono diversi! Associazione genica ” o i B l i t rlo n e Ca prvgg r “ accoppiamento e i pr+ vg+ P ino o rb t r U e + i b pr vg d o repulsione R tà + pr vg i s r e v iè un evento comunque raro, quindi solo una parte Il crossing over n U ricombina; questo spiega perché prevalgono i degli omologhi I geni che si trovano sullo stesso cromosoma vengono definiti associati o concatenati. cromosomi parentali. Il test cross ” o L’incrocio con l’omozigote recessivo (test cross) consente di analizzare la meiosi di un solo genitore. i B l i t rlo n e a + + vg+vg + g pr pr vg vg x pr pr C r “ e i P ino o rb t r + pr pre vg-vg+Ux pr-pr- vg-vgF1 i b d o R tàpr+ vg+ 1339 i s pr- vg- 1195 r e + vgv pr 151 i n pr- vg+ 154 U Totale 2839 Associazione genica ” o i B l i o t indipendente l ¸ in conseguenza dell’assortimento n r e a g over C ¸ in seguito a crossing r “ e o i P in o e rgeni b Geni indipendenti associati t r U e i b AaBbx aabb AaBbx aabb ABo 25% d AB 35% R tà Ab 25% i Ab 15% s aBer25% A e B sono geni A e B sono geni aB 15% v i indipendenti n ab 25% associati ab 35% U I ricombinanti si possono generare quindi: L’associazione dei geni sull’X P y- w+/ y- w+ x y+w-/Y ” o i B l i t rlo F1 n e Ca g r “ y-w+/y+w- x y-w+/Y e si considera solo la i o P in progenie maschile o rb t r U e i b maschi: yw+ d o à y- w43Rricombinanti t i yw+ s y+ X wr y+ w2146 parentali e v i y+ wn y- w+ 2302 U parentali y+ w+ 22 ricombinanti non serve il reincrocio con l’omozigote recessivo La distanza di mappa o” i B l i t rlo n e Ca g Morgan osservò che r le frequenze dei “ e o i P inper differenti ricombinanti variavano o rb t r coppie di geni considerati; dedusse U e i b pertanto Rocheà d la frequenza dei t i ricombinantirs riflettesse l’effettiva e v distanzanidei geni. U i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o Definizione della distanza di mappa o” B li i lo t n Sturtevant elaborò un metodo per calcolare r e a g di“C la distanza dei geni associati: propose r e o utilizzare la percentuale di iricombinanti Pdue coppie n i come indice della distanza tra di o b t r geni in una mappa genetica. r U e i b o La distanza di mappa viene d misurata in unità R tà (cM). di mappa (um) o centimorgan i s r Una unità di mappa corrisponde ad una e v i frequenza di ricombinazione dell’1%. n U Calcolo della distanza di mappa ” o i B l i t rlo n e Ca g r “ e Distanza di i o X 100 di ricombinazione = frequenza P n i mappa o b t r r U e i b d numero dei ricombinanti Frequenza R dio = à t ricombinazione si numero totale della progenie r e v i n U Esempio di calcolo della distanza di mappa o” i B l i o t pr-vg-/pr+vg+ x pr-nvg-/prr-lvge Ca g r “ e i o pr- vg-/ pr- vg- 165 P n parentali i + + pr vg / pr vg to 191 b r r + U pr vg / pr vg 23 e i ricombinanti b + d pr vg / pro vg 21 R tà 400 i s r e d pr/vg = (23+21)/400 x 100 = 0.11 x 100= 11 um v i n U 11.0 pr vg La mappa è la ” o percentuale di i B l i t rlo n ricombinanti ge Ca r “ e o i P in o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U Una unità di mappa corrisponde alla frequenza di ricombinazione dell’uno per cento; nell’esempio a lato, significa che il 18% della progenie sarà ricombinante, ovvero che i ricombinanti saranno per il 9% vg+,b- e per il 9% vg-,b+. Analogamente, i parentali (82%) saranno per il 41% vg+, b+ e per il 41% vg-, b-. Associazione a due punti ” o i B l i t rlo n e Ca g Se in un reincrocio si osserva una “frequenza di r e o che i due ricombinazione del 50%, isi può inferire P n i geni assortiscono in o modo indipendente. Questo è b t r r dovuto o a geni effettivamente indipendenti, o a U ema cosìi distanti tra loro che la geni associati, b d o probabilità che avvenga R tà almeno un crossing over tra loro, ad ogniimeiosi, è molto elevata. s r e v i n U Mappe sull’X ” o Le mappe sul cromosoma X sono del tutto simili a quelle autosomiche, soltanto per il reincrocio si usa il maschio emizigote. i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n Notare che la somma delle mappe U parziali può essere superiore a 50cM! Mappa di geni a coppieo” i B l i t rlo n e Ca g r “ e Considerando i geni a due a due, è i o P possibile costruire mappe di in o b t associazione con le posizioni r r relative dei geni.be Esistonoi U però d o metodi più veloci… R tà i s r e v i n U I crossing over multipli i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o Maggiore è il numero dei crossing over, minore è la probabilità che avvengano! Il saggio a tre punti o” i B l i t rlo n e Ca g r “ e Il saggio a trePipuntinopermette i o b t l’ordine di determinare di tre r r U e i b geni sul cromosoma e le d o R tà distanzesdi i mappa. r e v i n U i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o Stabilire l’ordine dei geni ” o 1. 2. 3. i B l i t rlo n e deiCgeni? Come si stabilisce l’ordine a g r “ e i o P degli Determinare la disposizione alleli nei genitori n i b esaminando le classitoparentali (quelle che mostrano r r frequenza più alta); U e i b o à ddi progenie derivanti da doppi identificare Rle classi t crossing over (quelle che mostrano frequenza più bassa); i s r e stabilire l’ordine dei geni sul cromosoma in base alla v i degli alleli nelle classi dei doppi crossing over, disposizione n U ai parentali. paragonati i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o Che cos’è un doppio crossing over? ” o i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r L’esame dei doppi crossing e v i over permette di dedurre quale n gene si trova in mezzo: il gene U in mezzo si sposta! possibile ordine genico p+ p p+ p r+ r j+ r+ cromatidi doppi ricombinanti p+ j r+ ” o i B l i t rlo n p e j+ a r j r g C r “ e r+ j+ Pi p+ no r j+ i o b t r r U e i b r+ j r o j d p R tà i p+ j+ s r+ p j+ r e v i n Up r p+ j j L’ordine dei geni i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o Calcolo ” o delle i B l i t rlo n e Cadistanze g r “ e i P ino di mappa o b t r r U e i b d o R tà i r s r r+ e v i n U d p-j= (52+46+4+2) x100 =20,8um 500 d j-r= (22+22+4+2) x100 =10 um 500 d p-r attesa: 20,8+10=30,8 Calcolo della distanza tra p ” o i ed r ignorando j B il t rlo n e Ca g r d =“(52+46+22+22)x100=28,4um e i P ino 500 o rb t r d = (52+46+22+22+4+2+4+2)x100 U e i b 500 d o R tà i r s r 30,8um (20,8+10) r+ e v i n U bisogna aggiungere due p-j p-j volte i doppi scambi Interferenza e ” coefficiente di coincidenza o i B l i o tosservata l In alcuni casi la frequenza dei doppi scambi è inferiore n r eper vari a a quella attesa. Questo perché a volte, motivi (struttura g C r “ tridimensionale del cromosoma, ingombro dei complessi proteici e i o P l’avvenire coinvolti nella ricombinazione, ecc.) di un crossing over n i o rb con il fatto che esso in una zona cromosomicatinterferisce r U avvenga anche nelle zone immediatamente adiacenti; posso quindi e i b osservati misurare quanto datioattesi e d coincidano. R tà i Interferenza (I)rs = 1- coefficiente di coincidenza e v i Coefficientendi = frequenza dei doppi scambi osservati U frequenza dei doppi scambi attesi coincidenza (cc) Quindi i B l i t rlo n • doppi scambi osservati g=eattesi a C r “ e o i P= 0 in c.c. = 1 I o rb t r U e i b d o • doppi scambi osservati < attesi R tà i s r c.c. < 1 ive I>0 n U ” o Calcolo della frequenza dei ” doppi scambi attesi o i B l i o t l n distanza di mappa della regione I distanza di r mappa regione II e a X rg C “ 100 e o 100 i P in o b t es: r r U e i b d o R à 0.208 x 0.100 = 0.0208 t Doppi scambi iattesi: s r e Doppi scambi osservati: 6/500= 0.012 v i n U cc= 0.012/0.0208=0.577 I= 1-0.577=0.423 NB: avrei ottenuto lo stesso risultato anche facendo il rapporto tra numeri anziché tra percentuali. Creighton e McClintock (1931) i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U Barbara McClintock e Harriet Creighton ” o La ricombinazione mitotica ” o i B l i Nel 1936 Curt Stern, lavorando su Drosophila, o t l n si accorse che anche ircromosomi mitotici, e a g occasionalmente, possono ricombinare, anche C r “ se in ie cellule mitotiche di norma non c’è o P n appaiamento itra omologhi. o b t r r U e i b d o R tà i s r e v i n U Il sistema analizzato da Stern i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o La mappa per delezione ” o Alcuni cromosomi possono perdere parte della loro informazione e quindi essere deleti. Se la delezione è sufficientemente grande, è possibile valutarne l’estensione a livello cromosomico ed eventualmente mapparla in base a parametri prefissati (per es., il bandeggio naturale dei cromosomi politenici di Drosophila melanogaster). In questo caso è possibile paragonare mappa statistica (genetica) e mappa citologica. Come? i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U La complementazione su delezione i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o La mappa per delezione i B l i Test di complementazione o t l n con cromosomi deleti, di r e a g “C cui è nota l’estensione di r e o ciascuna delezione a i P in livello citologico, danno la o b t r possibilità di mappare un r U e gene. i b o ha à d Nell’esempio a lato, R ciò reso possibile mappare ilit s r gene white di Drosophila e v in posizione 3A1-3C2 della i n mappa citologica. U ” o La mappa per duplicazione funziona in maniera analoga ” o i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U Mappa dei cromosomi umani i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t r U e i b d o R tà i s r e v i n U ” o Poiché (per ovvie ragioni) è complicato fare una mappa genetica dei cromosomi umani, la mappa citologica (e quella molecolare) rappresentano dei buoni strumenti per mappare i geni sui cromosomi. Altre tecniche di mappatura: gli ibridomi i B l i t rlo n e Ca g r “ e i o P n i Mediante vari mezzi (per esempio o b t r il virus Sendai) si induce la fusione r e Glii U tra cellule di topo e b uomo. d o ibridi ottenuti (ibridomi) vengono R tà seminati su terreno selettivo; le i s cellule di topo r perdono e v progressivamente ii cromosomi n umani fino a U mantenere almeno quello per cui sono selezionate. ” o La mappa ” o i B l i t rlo n e Ca g r “ e i P ino o rb t Se il prodotto genico in runa linea ibrida non è presente, tutti i U e cromosomi presenti b in quella i linea non contengono il gene di d o interesse; se invece una linea R tà contiene il gene di interesse, allora i almeno uno dei cromosomi presenti in essa contiene il gene. Dal s confronto dei dati, e è rpossibile mappare il gene su un cromosoma (o su parte di esso,iv se si usano frammenti ottenuti ad esempio con i n raggi X). In questo U caso il gene è sul cromosoma numero 9! (cioè quello con lo stesso schema dell’ultima colonna…)