”
o
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B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
CORSO DIPiGENETICA
o
n
i
o rb
t
r
U
e
i
b
d
o
CONTROLLO
DELL’ATTIVITÀ
R tà
i
GENICA
NEI PROCARIOTI
s
r
e
v
i
n
U
Trascrizione e traduzione
”
o
i
B
l
i
o
t rlereditaria
La trascrizione è il processo con cui l’informazione
viene
n
e èCila processo con cui
trasferita dal DNA all’RNA. La traduzione
g
l’informazione viene trasferitaerdall’RNA“ alle proteine. La
i
P dallainoRNA polimerasi. Nei
trascrizione viene effettuata
o polimerasi
b
procarioti esiste solo unatRNA
che trascrive tutti i
r
r
U
geni, mentre negli eucarioti
ci sono
3 diverse RNA polimerasi:
e
i
b
d
o
à
• RNA polimerasi R
I per latsintesi
dell’RNA ribosomale (rRNA)
i
s la sintesi dell’RNA messaggero (mRNA)
• RNA polimerasi II per
r
e
v
• RNA polimerasii III per la sintesi dell’RNA transfer (tRNA)
n
U
Il messaggero
”
o
i
B
l
i
t rlo
n
La struttura finale del mRNA, pronta
per laatraduzione, è
e
g
C
uguale sia nei procariotirche negli“eucarioti.
e o
i
P in
o rb
t
r
U
e
i
b
d
o
R tà
i
s
r
e
v
i il messaggero codifica per la proteina!
Non tutto
n
U
Riassunto della traduzione
Inizio della traduzione
”
o
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
b
Entra il tRNA corrispondenteto
al secondo
codone e si forma il legame
r
r eU
peptidico tra la metionina e
iniziale
il secondo amminoacido. Il ribosoma
i
b
si sposta sull’mRNA permettendo
che una sola tripletta alla volta sia
d
o
R col tRNA
à
disponibile all’attacco
specifico. Man mano che il ribosoma si
t
i
sposta si ha l’allungamento
della catena proteica.
s
r
e
v Termine della traduzione
i
n
Quando il ribosoma
U raggiunge le triplette di stop (UAG,UAA,UGA) si
Un ribosoma si attacca alla molecola di mRNA in corrispondenza della
tripletta di inizio AUG. Su questo codone AUG si lega il tRNA con
l’anticodone corrispondente che porta la metionina (N-formil metionina
nei procarioti).
Sintesi della proteina
stacca dall’mRNA.
Il tRNA
Esistono men o di 64
tRNA perché in alcuni
casi lo stesso tRNA può
leggere più di un codone
che codifica per lo stesso
amminoacido.
”
o
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
Ciò
è possibile per il
e
i
o
P in vacillamento (wobbling) o
o rb oscillazione della terza
t
r
U
e
base dell’anticodone.
i
b
d
o
R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
Accoppiamento della trascrizione
”
e della traduzione neili procarioti
o
B
i lo
t
n
r
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a
g “C
r
e o
i
P in
o rb
t
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U
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s
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Regolazione genica nei procarioti
”
o
i
B
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P ino
o rb
t
r
U
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b
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n
U
Il metabolismo
del lattosio
i
B
l
i
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n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
e
i
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i
s
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e
v
i
n
U
”
o
Il metabolismo
”
del lattosio è
o
i
B
l
i
t rlo
n
inducibile in
e Ca
g
r
“
e
i
E. coli
P ino
o
b
t
r
Si parla di induzione se,r
U
e
i
b
aggiungendo il substrato,
d
o
R sità
la sintesi enzimatica
i
innalza.
s
r
Si parla di repressione
e
v
i
se,
aggiungendo
il
n
substrato, U
la
sintesi
enzimatica si abbassa.
I geni inducibili
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
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s
r
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v
i
n
U
”
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Controllo positivo e negativo
i
B
l
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“
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i
P ino
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t
r
U
e
i
b
d
o
R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
”
o
Ci sono tre enzimi che vengono
coespressi in presenza di lattosio
”
o
i
B
l
i
ambiente esterno
ambienteo
t
ldella
n
interno
r
e cellula
a
g
C
r
galattosio
“
e oglucosio
i
galattosio
P
n
glucosio
i
o rb
t
r
lattosi
U
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i
b
o
d
o
R tà
i
s
r
e
lattosio permeasi
v
transacetilasi
bi
n
galattosidasi
U
In assenza di lattosio sono presenti circa 3 molecole di ciascun enzima nella cellula. In
seguito all’aggiunta di lattosio il numero delle molecole dei tre enzimi arriva a circa 3000.
La scoperta
dell’operone
Grazie all’uso sistematico di mutanti
incapaci di metabolizzare il lattosio
e al loro studio tramite creazione di
diploidi parziali (sfruttando le
proprietà di ceppi F’) tra il 1960 e il
1964 F. Jacob, J. Monod e A. Lwoff
identificarono tre categorie di
mutanti: o non producevano la b-gal,
oppure la permeasi, oppure la
”
o
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o transacetilasi
b
t
. Esistevano inoltre
r
r
U
e
due
tipi di mutazioni: quelle missenso
i
b
d
o
carico di ciscun gene che non
R tà adavano
un prodotto funzionale del
i
s
gene mutato, e quelle nonsenso che
r
e
compromettevano la sintesi delle
v
i
n
proteine a valle (mostravano effetti
U
polari), suggerendo che il mRNA
From left to right: Francois Jacob (1920- ), Jacques
Monod (1910-1976) and André Lwoff (1902-1994),
awarded the Nobel Prize for Physiology or Medicine
in 1965. Jacques Monod was director of the Pasteur
Institute in Paris from 1971 to 1976.
fosse policistronico.
mRNA policistronici
”
o
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
e
i
b
d
o
R tà
Una mutazione non-senso
i
s
ha effetto polare perché
r
e
giunto al primo codone di
v
i
n
stop il ribosoma si stacca e
U
non procede nella traduzione dei geni a valle.
Le
mutazioni
polari
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
Un individuo che
r
“
e
i
sia eterozigote in
o
P
n
i
trans viene anche
o rb
t
detto transr
U
e
i
eterozigote. Una
b
d
o
cellula batterica
R tà
i
contenente un
s
r
esogenote è un
e
v
diploide parziale, i
n
o merozigote. U
”
o
Altre mutazioni del
”
o
metabolismo del lattosio
i
B
il
t rlo
n
e geni Cchea influenzavano la
Furono trovate anche mutazioni in altri
g
r
sintesi delle proteine b-galattosidasi
(gene “lacZ), permeasi (gene
e
i no che queste mutazioni
lacY) e transacetilasi (gene P
lacA). Dato
i
o dei
alteravano la modalità di t
sintesi
tre enzimi, Jacob Monod e
b
r
r
Lwoff supposero che fossero
mutazioni
in geni regolativi (i geni
U
e
i
b
lacZ, lacY e lacA sono
invece
detti
geni strutturali).
d
o
à
La caratteristicaRdi questi
geni regolativi consisteva nel fatto
t
i
che, quando immessi nel
ricevente tramite un F’, alcuni erano in
s
rin trans, mentre altri potevano esplicare la
e
grado di agire anche
v
i
loro funzione nsoltanto in cis. Le mutazioni regolative furono
U
mappate in due gruppi di complementazione che definiscono i geni
O ed I.
La genetica dei geni regolatori
Sintesi di b-galattosidasi,
permeasi e transacetilasi
i
B
l
i
t rlo
n
mutante
induttore e
induttore
a
g
C
assente
presente
r
“
e o
i
P + in
O
+
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b
t
I
+
+
r
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e
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i
b
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+
+
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i
s
I
+*
r
e
I iv
+*
n
P
U c
-
s
-d
Q
SQ
lac
* indotti da alte concentrazioni di lattosio
”
o
Organizzazione dell’operone lac
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
e
i
b
d
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R tà
i
s
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e
v
i
n
U
”
o
La definizione di operone
”
o
i
B
l
L’operone
è un
i
t rloinsieme di geni
n
e Ca metabolicamente
g
r
“
e
correlati che
i
o
P in
vengono
o
b
t
coespressi e
r
r
U
e
tradotti a
i
b
d
o
partire da un
R tà
unico mRNA
i
s
policistronico; i
r
e
geni regolatori
v
i
n
non fanno parte
U
dell’operone.
La regolazione dell’operone
”
lac: il gene lacI
o
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
e
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b
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o
R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
lacI è dominante su lacI
+
sia in cis che in trans!
-
La regolazione dell’operone
lac: il gene lacOc - 1 o”
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
e
i
b
d
o
R tà
i
s
r
e
Il gene lacO è dominante
sul
v
isolo in cis!
gene lacI , ma
n
U
Nel caso a destra, il metabolismo
c
+
del lattosio è ancora inducibile.
La
”
o
i
regolazione
B
l
i
t rlo
n
e Ca
dell’
g
r
“
e
i
o
P
operone lac: to bin
r
r
U
e
il gene ob di
R
à
t
lacOc - 2 rsi
e
v
i
n
U
Il metabolismo del lattosio questa volta NON è inducibile!
Conclusioni
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
e
i
b
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R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
”
o
Da tutti questi dati si dedusse che I+ è trans dominante e si
ipotizzò che codificasse per una proteina diffusibile nel citoplasma
in grado di influenzare anche i geni in trans, mentre per Oc si
dedusse che era una mutazione cis dominante (in grado di
influenzare solo i geni in cis) e che il gene O non producesse una
proteina diffusibile ma che fosse una sequenza di regolazione, che
venne chiamata operatore. Oc è un operatore costitutivo. Jacob,
Monod e Lwoff ipotizzarono anche che il gene O fosse una sequenza
di DNA alla quale si lega il prodotto del gene I (la proteina
repressore). Il lattosio, legandosi al repressore, favorisce il suo
distacco dal gene O consentendo alla polimerasi di legarsi al
promotore per iniziare la trascrizione dei geni a valle. L’operone lac
è un modello di controllo negativo.
Il
”
m
o
i
B
l
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n
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C
r
“
ed o
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P in
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e
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b
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s
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v
l
i
n
U
o
lacI è una proteina allosterica
i
B
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e Ca
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“
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i
P ino
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t
r
U
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s
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e
v
i
n
U
”
o
La mutazione lacIS o”
i
B
l
i
t Sintesirlodi b-galattosidasi,
n
È anche detta super
e Cpermeasi
a
e transacetilasi
g
repressore. In questo
r
“
e
mutante
induttore
induttore
o
caso il repressore è Pi
n assente presente
i
mutato nel sito di legameo
b
O
+
+
t
r
con il lattosio, ma non r
nel
U
e
I
+
+
sito
di
legameb con i
d
o
I
l’operatore: il repressore
R tà
I
+
+
i
è quindi insensibile
al
s
I
+*
r
lattosio, per cui e
l’operone
v
I
+*
i
è sempre “spento”.
n
P I è dominante
U su I .
* indotti da alte
concentrazioni di
lattosio
c
-
s
-d
Q
SQ
s
+
lac
La mutazione lacI-d
Nelle cellule aploidi le mutazioni I-d hanno fenotipo costitutivo. Nei
diploidi parziali I+/I-d le mutazioni I-d sono trans dominanti su I+. Il
repressore selvatico è un tetramero. La mutazione I-d produce una
proteina alterata che nei diploidi parziali I+/I-d si lega alle molecole
“buone” impedendone il legame all’
operatore.
* indotti da alte
Sintesi di b-galattosidasi,
”
o
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino permeasi e transacetilasi
o rb mutante induttore induttore
t
r
assente
presente
U
e
i
b
O
+
+
d
o
R tà
I
+
+
i
s
I
r
e
I
+
+
v
i
n
I
+*
U
I
+*
concentrazioni di
lattosio
c
-
s
-d
Q
SQ
Plac-
-
-
Le mutazioni IQ e ISQo”
i
B
l
i
t rlo
n
Sono mutazioni a carico del
e CSintesi
a di b-galattosidasi,
g
promotore del gene I e
r
permeasi e transacetilasi
“
e o induttore induttore
determinano la produzione Pi mutante
n
i
di un gran numero dio
assente
presente
b
t
r
r
molecole
di
repressore.
O
+
+
U
e
b
Riducono
l’efficienza
di i
I
+
+
d
o
R tsolo
induzione e sono indotti
à
I
i
da alte concentrazioni
di
I
+
+
s
r
lattosio.
e
I
+*
v
i
I
+*
n
U
P * indotti da alte
concentrazioni di
lattosio
c
-
s
-d
Q
SQ
lac
Le mutazioni P
”
o
Le mutazioni in P, sia nell’operone che nell’induttore, regolano il legame
della RNA polimerasi. Quindi se un operone è P- comunque non funziona,
anche se tutto il resto è a posto.
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
Sintesi di b-galattosidasi,
“
e
i
P ino permeasi e transacetilasi
o rb mutante induttore induttore
t
assente
presente
r
U
e i
b
O
+
+
d
o
R tà
I
+
+
i
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s
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I
+
+
e
v
i
I
+*
n
U
I
+*
* indotti da alte
concentrazioni di
lattosio
c
-
s
-d
Q
SQ
Plac-
-
-
Controllo positivo dell’operone lac
”
o
I geni lacZ, lacY e lacA sono espressi solo se nel terreno non è presente
il glucosio. Altrimenti questo zucchero viene usato preferenzialmente
anche in presenza di lattosio. In presenza di glucosio si ha la
repressione da catabolita: il glucosio mantiene basso il livello di cAMP
(AMP ciclico) impedendo la formazione del complesso CAP-cAMP.
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
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e Ca
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“
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Il
ruolo
del
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P in
o rb
t
cAMP
r
U
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b
d
o
Zuccheri nel
Quantità
R tà
terreno di
relativa di bi
s
coltura
galattosidasi
r
e
v
i
glucosio
1
n
U
glucosio+lattosio
50
lattosio
2500
L’operone
triptofano
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
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s
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”
o
Il peptide leader
i
B
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P ino
o rb
t
r
U
e
i
b
d
o
R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
”
o
Gli appaiamenti del
messaggero del gene trpL
”
o
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
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b
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R tà
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s
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e
v
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n
U
Le strutture a forcina
i
B
l
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g
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”
o
L’attenuazione - 1
i
B
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i
P ino
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t
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i
b
d
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R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
Il
cammino
del
ribosoma può alterare
la formazione delle
forcine. In assenza di
triptofano, il ribosoma
rallenta (o si ferma)
permettendo
quindi
l’appaiamento
delle
regioni 2 e 3 ed
impedendo di fatto
l’appaiamento 3-4 Ÿ la
trascrizione procede.
”
o
L’attenuazione - 2
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
o rb
t
r
U
e
i
b
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o
R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
In
presenza
di
triptofano, il ribosoma
non si ferma e procede
sulla zona 2 (da cui poi
si
stacca
per
la
presenza di un codone
di stop); in questo
modo permette quindi
l’appaiamento
3-4:
questa
forcina
destabilizza la RNA
polimerasi (ricordare
che nei procarioti la
trascrizione
e
la
traduzione
sono
accoppiate!)
e
la
trascrizione si ferma.
”
o
Il fago l
Il cromosoma di l esiste sia
nella forma lineare che
circolare. La forma lineare
(quella inattiva nel capside)
favorisce l’iniezione del DNA
nell’ospite.
Una
volta
iniettato, il DNA passa alla
forma
trascrizionalmente
attiva, quella circolare.
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
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P ino
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t
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v
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U
”
o
Ciclo litico
”
e ilisogenico
o
B
l
i
tIl fagorllopuò riprodursi
n
e Csia
a attraverso il
g
r
“
e
classico
ciclo litico, sia
i
o
P in passare al ciclo
o rb lisogenico. In questo
t
r
U
e
caso l’anello di DNA del
i
b
d
o
fago ricombina con il
R tà
cromosoma batterico
i
s
(un crossing over)
r
e
sempre nello stesso
v
i
n
punto (ricordare la
U
trasduzione
profago quiescente
specializzata!)
La repressione del ciclo litico
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
P ino
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t
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v
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n
U
operatore sinistro
”
o
operatore destro
Il mantenimento
del ciclo
lisogenico
i
B
l
i
t rlo
n
e Ca
g
r
“
e
i
o
Il repressore agisce in
P
n
i
trans e impedisce sia al
o rb
t
fago di innescare il
r
e iU
proprio ciclo litico, sia b
d
ad altri eventuali fagi l o
R tà
di
farlo
(effetto
i
dominante).
Inoltre, rs
come profago, un solo l e
v
i
è presente nella cellula
n
U sito
perché c’è un solo
d’inserzione.
”
o
L’innesco del ciclo litico
”
o
i
B
l
i
t rlo all’infinito.
Il repressore automantiene il sistema teoricamente
n
e è l’eliminazione
L’unico modo per uscire dal ciclo lisogenico
fisica del
a
g
C
r
repressore. Questo può avvenire tramite
taglio
proteolitico.
“
e
i
o
La proteina RecA è una proteina
che viene innescata dal
P batterica
n
i continuamente l’integrità
o
sistema SOS: questo sistema
monitorizza
b
t
r
r
del DNA batterico e e
se questoUviene danneggiato promuove la
i
b
sintesi di geni e l’attivazione
di
altri
tramite tagli proteolitici. I geni
d
o
à
attivati bloccano ilRciclo cellulare
e promuovono la riparazione del
t
i
DNA tramite (anche) ricombinazione
(da cui il nome di RecA).
s
r
e
Tra i bersagli degli enzimi proteolitici del sistema SOS c’è anche il
v
i
repressore di l:nquando la nave affonda, i topi scappano…
U
L’innesco del ciclo litico
i
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l
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