Erosione genetica e biodiversità
Caratteri qualitativi e quantitativi
50
40
30
20
10
0
VF = VG + VA
h2 = VG/VF
QTL (Quantitative trait loci)
Locus genetico in corrispondenza del
quale alleli diversi da un punto di vista
funzionale segregano e causano effetti
significativi sul carattere quantitativo
QTL mapping
Localizzare ed identificare
il locus che regola il QTL
-­‐ Iden'ficare il QTL che regola il cara4ere studiato -­‐localizzare la regione del genoma dove un QTL che regola il cara4ere è ospitato Locus: posizione fisica del gene sul cromosoma
Mappa genetica: serve per determinare la posizione del locus
Caratteri quantitativi e postulati di Mendel
Ø Più geni responsabili del carattere
fenotipico (poligeni)
Ø Alleli plus & minus
Ø Geni associati
Ø Geni su uno stesso cromosoma vengono
ereditati insieme (linkage)
Caratteri quantitativi e postulati di Mendel
Legge della dominanza gli individui nati dall'incrocio tra due
individui omozigoti che differiscono per una coppia allelica,
avranno il fenotipo dato dall'allele dominante
Legge della segregazione alleli differenti di uno stesso gene
segregano a meiosi
Legge dell'assortimento indipendente (o legge di indipendenza
dei caratteri): gli alleli posizionati su cromosomi non
omologhi si distribuiscono in modo casuale nei gameti.
Deviazione rapporti mendeliani
Esperimento Bateson &
Punnet
Incrocio diibrido tra una linea pura con fiori viola e granuli pollinici allungati ed
un’altra linea pura con fiori rossi e granuli pollinici rotondi
Si concluse che gli alleli parentali erano accoppiati e non andavano incontro
assortimento indipendente
Esperimenti di Morgan
geni sullo stesso
cromosoma
possono essere
ereditati in
maniera accoppiata
Biologia.blu, D.Sadava G.Heller G.Orians W.Purves D.Hillis M.Pignocchino, Zanichelli
Gli studi di Morgan hanno dimostrato che
nella drosofila i geni responsabili del colore
del corpo e delle dimensioni delle ali sono
associati, cosicché i rispettivi alleli non
seguono un assortimento indipendente.
Questa associazione è responsabile della
discordanza dei fenotipi osservati rispetto a
quelli attesi in base alla legge mendeliana
dell’assortimento indipendente
Calcolo chi2
Analisi dei rapporti di segregazioni a ciascun locus per vedere se i valori
osservati differiscono da attesi
Geni concatenati hanno rapporti atipici
Osservati
Attesi
(575-965)2/965
(575-944)2/944
(575-206)2/206
(575-185)2/185
156,81
144,24
660,97
822,16
1784.18
I valori di χ2 elevati indicano che le differenze osservate sono
statisticamente significative, e che quindi l’ipotesi che i geni si
assortiscano in modo indipendente deve essere rigettata
4 classi fenotipiche -> 3 gradi di libertà valore χ2 1784,18
Se p>0.05, la deviazione tra Osservati ed Attesi non è
significativa
Se p<=0.05, la deviazione è statisticamente significativa;
ciò significa che i geni possono essere legati
Geni indipendenti
Seguono le leggi di Mendel
sull’assortimento indipendente
Sono su cromosomi diversi
Geni in linkage
Geni fisicamente uniti sugli
stessi cromosomi
Linkage
Si analizza la frequenza allelica di ricombinazione
nella progenie di un incrocio
§ Nuove associazioni di alleli parentali si
ottengono a seguito della ricombinazione
genetica
§ Tests crosses determinano quali geni sono
legati, e la mappa genetica si contruisce per
ogni cromosoma
Ricombinazione
Grazie alla ricombinazione risulta possibile mappare i geni
Alla meiosi:
Segmenti di DNA che sono su diversi cromosomi si
distribuiscono a caso nei gameti
Segmenti che sono sullo stesso cromosoma vanno
soggetti a ricombinazione. Questa è tanto più frequente
quanto più distanti sono i due segmenti di DNA sul
cromosoma
DISTANZA DI MAPPA è misurata dalla % di
RICOMBINAZIONE
I geni associati sul cromosoma possono avere
duplice destino:
1) Non si trasmettono insieme a causa della
ricombinazione, quindi si separano per l’avvento
del CROSSINGOVER nel tratto di cromosoma
compreso tra i due geni. (assortimento
indipendente)
2) Si trasmettono insieme, ciò accade quando sono
molto vicini tra di loro
Crossing over
scambio fisico reciproco di parti tra i due cromosomi omologhi (tra cromatidi
non fratelli) con la formazione di nuove combinazioni alleliche
Frequenze di Ricombinazione
Progenie ricombinante
%
Totale progenie
0%
Geni associati
50%
Geni non associati
Geni con frequenza di ricombinazione minore del 50% si
trovano sullo stesso cromosoma => linked
(ricombinazione intracromosomica) crossing over
Geni che si sottopongono ad assortimento indipendente
hanno una FR del 50 % e sono posizionati in cromosomi
non-omologhi oppuri di lontani e sullo stesso
cromosoma=> unlinked (ricombinazione
intercromosomica)
Tipologie di mappe
§ Mappe genetiche o di linkage
§ Distanza che separa i geni basata su rapporti di
ricombinazione
§ Citogenetiche
§ Visulizzazione al microscopio dei cromosomi
§ Mappe fisiche
§ Posizione fisica di una sequenza di DNA o di un
gene
§ “Nucleotide Sequence Maps”
§ Genomi sequenziati
Tipologie di mappe
www.genome.gov
Mappe genetiche
§ La mappa genetica determina l’ordine di geni
§ Le frequenze di ricombinazione tra alleli
determinano le distanze tra essi
§ Le distanze tra geni si misurano in termini di unità
di mappa
§ 1 unità di mappa = 1 cM (centimorgan) (1%
fenotipi ricombinanti)
§ Tali frequenze sono inveramente proporzionali alla
distanza tra alleli
Calcolo distanza mappa
206+185
206+185 + 965 + 944
X 100 =
17% = 17 cM
NB: Caso semplice
Associazione Cis e Trans
Alleli dominanti
in uno degli
omologhi
Alleli dominanti
sui due omologhi
Calcolo distanza mappa
§ Calcolare ricombinazioni in cis ed in trans
§ Calcolare crossing over multipli
A1
B1
C1
A1
B2
C2
A1
B2
C1
A2
B2
C2
A2
B1
C1
A2
B1
C2
Singolo CO
Doppio CO
ABC
abc
Abc
aBC
ABc
st+
A
e+
B
ss+
C
st
a
e
b
s
c
Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
abC
AbC
aBc
Vogliamo stabilire l’ordine dei geni sul cromosoma e stimare le distanze tra questi
ABC
283
abc
278
Genotipi più frequenti sono i parentali
Abc
50
Genotipi meno frequenti sono i doppi ricombinanti
aBC
52
ABc
5
Calcolo dell’ordine dei geni
abC
3
AbC
43
aBc
41
A-B-C?
C-B-A?
B-A-C?
ecc….
A
C
B
ABC
283
ACB
a
c
b
abc
278
acb
A
c
b
Abc
50
Acb
aBC
52
aCB
a
C
B
ABc
5
AcB
A
c
B
abC
3
aCb
AbC
43
ACb
a
C
b
aBc
41
acB
A
C
b
a
c
B
Il doppio crossing over sposta l’allele centrale
da un cromatidio fratello all’altro
A questo punto bisogna calcolare la distanza tra A - C e C - B
283
ACB
278
acb
50
Acb
52
aCB
5
AcB
3
aCb
43
ACb
41
acB
A –C = (5+3+50+52)/755 * 100 =
14.6
C –B = (5+3+43+41)/755 * 100 = 12.2
A –B = [50+52+43+41+ (5*2) + (3*2)]/755 * 100 =
26,8
28,8 cM
A
C
14,6 cM
B
12,2 cM
Distanza genetica
Esempio Drosophila distanza Additiva (14,6 + 12,2 = 28,8)
CROSSOVER MULTIPLI
Aumentando la distanza tra due loci, aumenta la
probabilità di crossing over doppi o multipli
A
B
a
b
A
b
B
b
B
a
B
b
B
b
Gli effetti del crossing-over multiplo sono annullati, pertanto la
frequenza di ricombinazione, sottostima la distanza genetica
Interferenza
Il Crossover in una
regione diminuisce la
probabilità di altri nella
medesima regione
cromosomica
Tendenza a non vedere
doppi crossover in
piccole regioni
cromosomiche
Coincidenza
Numero di doppi
ricombinanti osservati
diviso il numero di attesi
28,8 cM
A
C
14,6 cM
B
12,2 cM
• Probabilità di doppi CO tra A e B = frAC x frCB
283
ACB
278
acb
50
Acb
52
aCB
5
AcB
3
aCb
43
ACb
41
acB
0,146 X 0,122 = 0,0178
• Numero di doppi CO attesi = 0,0178 X 755 (progenie totale) = 13,4
• Numero di doppi CO osservati = 5 + 3 = 8
Coefficiente di coincidenza = doppi CO oss./ doppi CO att. = 8/13,4 = 0,6
Coefficiente di coincidenza = 0,6
Interferenza = 1 - coefficiente di coincidenza => 1 – 0,6 = 0,4
Il 40% della progenie attesa e derivante da doppio
crossing over non sarà osservata
Interferenza
0
No doppi crossing over
0>1
doppi crossing over
Crossing over più frequenti in regioni subtelomeriche
rispetto le centromeriche, quindi ad una piccola distanza
nella mappa genetica può corrispondere una grande
distanza in quella fisica
Mappe genetiche
Costruzione mappa genetica
• Si scelgono due parentali distanti dal punto di
vista genetico con caratteri agronomici utili
• Incrocio e sviluppo popolazione segregante
• Genotipizzazione con marcatori molecolari
q Associazione del fenotipoà Alleli di interesse
COSTRUZIONE DI UNA MAPPA GENETICA CON MARCATORI
MOLECOLARI
RICERCA DI MARCATORI MOLECOLARI
Trovare marcatori polimorfici tra i due parentali
Analizzare la segregazione di tali marcatori nella popolazione segregante
Ricercare l’associazione tra i diversi marcatori
Calcolare la % di ricombinazione tra i marcatori associati
Costruzione mappa genetica
Cultivated
Wild
X
Segregant population
Marker1
Marker analysis
Mappa
Linkage mapping
Associazione di un marcatore ad un gene di resistenza
§ Progenie da incrocio Resistente X Suscettibile
§ Testare la progenie con marcatori equamente distribuiti
sul genoma (~ogni 10cM)
§ Lod score (“log of the odds”) – punteggio risultante da un
test statistico che confronta la probabilità di osservare
due marcatori, legati o meno. Punteggi LOD positivi
favoriscono la presenza di linkage, mentre i punteggi LOD
negativi indicano che il legame è meno probabile
Mapping function
1. LOD >3.0 evidenza del legame
2. LOD <-2.0 non legati
3. Intermedi – dati inconclusivi, collezionare maggiori individui
• Formule matematiche per definire le relazioni tra
ricombinazione e distanza di mappa
• Tali formule mettono in relazione la frequenza dei CO e la
distanza tra I geni
Associazione del fenotipo
Genotipo
1 3 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 1 2 2 2 2 1 1 1 1 2 2 1
Fenotipo
S R R R R R R R R R R R S R R R R S S S S R R S
1
0
0
1
5
0
8
0
7
0
4
0
5
0
0
4
5
0
3
0
0
2
5
0
2
8
0
2
9
0
3
1
0
2
4
0
5
4
0
3
2
0
3
1
0
1
6
0
1
8
0
2
3
0
4
4
0
3
1
0
4
2
0
4
0
0
2
5
0
Linkage = Co-segregazione
A3A4
A1A2
A1A3
A1A2
A1A4
A2A4
A3A4
A2A3
A3A2
Marker allele A1
cosegrega con un
Carattere dominante per
resistenza
Mappatura di geni agronomicamente
interessati
Elevato n° di markers = consentirà la saturazione delle mappe genetiche,
ottenendo distanze di mappa tanto ridotte da consentire la dissezione di
caratteri quantitativi nelle diverse componenti geniche.
Vantaggi = possibilità di trovare una stretta associazione tra il marcatore ed
i geni di interesse.
L’associazione tra il marcatore molecolare ed il gene permette di inferire
la presenza del gene in un individuo o in un gruppo di individui mediante
l’identificazione del marcatore ad esso legato.
