Cinetica enzimatica

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Cinetica enzimatica
Secondo il modello cinetico all'aumentare della concentrazione del substrato, la velocità della reazione
aumenta fino ad un massimo, detto Vmax che non è possibile superare perché il substrato ha saturato
tutto l'enzima presente. Si dice che è stato raggiunto lo stato stazionario.
Rappresentando una reazione enzimatica si ha:
E + S
ES1
ES2
……
ESn
E + P
Che si può riassumere in:
k1
E + S
ES
k2
E + P
k-1
La velocità di reazione è regolata dalla costante specifica per il tipo di reazione secondo la formula già
nota per cui la velocità della prima reazione sarà
V =
k1 [ E ] [ S ]
Di una reazione enzimatica si definisce il numero di turnover caratteristico di ogni enzima, che equivale
alla costante k e rappresenta il numero di moli di substrato S convertite nel prodotto P da una mole di
enzima nell’unità di tempo. La costante di velocità dipende inoltre dalla temperatura.
Allo stato stazionario la velocità di formazione di ES è uguale alla velocità di scomposizione in E + P.
Sulla base di questo ragionamento Michaelis e Menten elaborarono un’equazione che ingloba in un’unica
costante detta KM le numerose costanti e mette quindi in relazione la velocità di formazione del prodotto
V con la concentrazione del substrato [S].
La costante di Michaelis-Menten rappresenta la quantità di substrato necessaria
affinché la reazione avvenga a velocità pari a metà della velocità massima.
Essa equivale al seguente rapporto:
K M = (k-1 + k2 ) / k1
La costante di Michaelis-Menten è una grandezza tipica di ciascun enzima e indica l'affinità (cioè la
capacità di agire) di un enzima verso il substrato: più basso è il valore di KM e più bassa sarà la
concentrazione di substrato che permette di raggiungere un valore di velocità di reazione pari alla metà
della velocità massima, il che indica un’alta affinità dell'enzima per il substrato. Viceversa un alto
valore di KM indica che sarà necessario più substrato per raggiungere una velocità di reazione pari alla
metà della velocità massima, il che significa una minore affinità dell'enzima per il substrato.
Rappresentando graficamente la velocità di reazione e la costante si ha:
La curva che descrive l’andamento della velocità di
reazione può essere ottenuta sperimentalmente
misurando la concentrazione del substrato a distasnza
di brevi intervalli di tempo. Si ricorda che si definisce
velocità di reazione il rapporto fra la variazione di
concentrazione, del substrato o del prodotto, nel tempo
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Dal grafico si nota che la velocità di una reazione catalizzata non è costante nel tempo ma
a seconda del momento e del tipo enzimatico, può essere di ordine O, I o II (corrispondenza quadratica).
L’ordine di reazione è rappresentato da un grafico del tipo:
in una reazione di ordine 0 la velocità iniziale è uguale alla
velocità massima a qualsiasi concentrazione di substrato, in
una di ordine 1 la velocità raddoppia al raddoppiare della
concentrazione del substrato, in quella di ordine 2 la velocità
e la concentrazione del substrato sono legate da una relazione
quadratica.
In una reazione enzimatica, dove l’enzima sia a basse
concentrazioni, a seconda della concentrazione del substrato si
hanno tutti e tre i tipi di velocità.
Se si trasforma il grafico
dell’andamento di una reazione in una retta utilizzando in ordinata
l'inverso della velocità massima si avrà nell'intersezione con le ordinate
la velocità massima raggiungibile e nell'intersezione con le ascisse la
costante di Michaelis-Menten in negativo. Il coefficiente angolare della
retta sarà KM/Vmax
Inibizioni
Come inibizione enzimatica si intende un malfunzionamento dell’enzima, sia che causi un blocco
permanente o temporaneo, sia che rallenti la sua velocità, sia che ne diminuisca l’affinità verso il suo
substrato.
Un enzima può essere inibito da diversi fattori e in modo differente a seconda del meccanismo d’azione
dell’inibitore.
Inibizione irreversibile o avvelenamento dell'enzima
Sono causate da alcune sostanze tossiche quali gas nervini, sali di
asbesto, piombo, mercurio,… che si legano ai radicali -SH della
cisteina.
L'inibitore agisce nel sito attivo e modifica permanentemente
l'enzima. La velocità di reazione diminuisce con l'aumentare
dell'inibitore secondo il grafico a lato.
Le reazioni coinvolte sono:
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Inibizioni reversibili
Gli inibitori reversibili possono essere isosterici se si legano nel sito attivo dell'enzima, allosterici se
si legano fuori dal sito attivo e si possono sempre allontanare per dialisi.
L'inibizione reversibile si manifesta in tre modi:
a) Inibizione competitiva
Fra questi alcuni antibiotici quali penicilline e cefalosporine che nei batteri ostacolano la sintesi della
parete cellulare.
Le reazioni coinvolte sono:
La velocità viene modificata secondo grafico a lato.
La velocità massima viene raggiunta con concentrazioni
maggiori di substrato perciò la Km aumenta in presenza
dell’inibitore competitivo. L’affinità dell’enzima verso il
substrato appare diminuita e si hanno le seguenti
caratteristiche
• l'inibitore é simile al substrato
• La Vmax viene raggiunta comunque ma dopo con una quantità maggiore di substrato
• decresce con l'aumentare della concentrazione del substrato
• La costante di Micaelis dell'enzima non inibito (Km ) é minore
1
di quella (Km ) dell'enzima inibito
2
Il grafico con l'inverso della velocità sarà quello a lato.
Gli inibitori competitivi aumentano quindi il coefficiente angolare
della retta (la pendenza) ma con uguale Vmax (uguale intersezione
con l’asse delle ordinate)
b) Inibizione incompetitiva
Le reazioni coinvolte sono:
Ha le seguenti caratteristiche
• La Vmax raggiunta é inferiore a quella dell'enzima non inibito
• l'inibizione aumenta con l'aumentare della concentrazione del substrato
• La costante di Micaelis dell'enzima non inibito (Km ) é minore di quella (Km ) dell'enzima inibito
1
2
La velocità viene modificata quindi come illustrato nel grafico sotto. A lato il grafico con l'inverso della
velocità.
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c) Inibizione non competitiva
E’ determinata da inibitori che si legano reversibilmente all’enzima in un punto diverso dal sito attivo.
La loro azione non viene influenzata dalla concentrazione del substrato. Fra questi i metalli pesanti che si
combinano ai gruppi -SH della cisteina, alcuni fluoruri e l’EDTA che complessano molti metalli. Una
parte dell’enzima resta inattivo a causa della loro presenza per cui la velocità di reazione massima
diminuisce.
Le reazioni coinvolte sono:
Questi inibitori tuttavia non agiscono sull’affinità
dell’enzima verso il substrato e una parte
dell’enzima quindi resta inattivo conferendo quindi le seguenti caratteristiche alla reazione:
• La Vmax raggiunta é inferiore a quella dell'enzima non inibito
• La costante di Micaelis dell'enzima non inibito (Km ) é uguale a quella (Km ) dell'enzima inibito
1
2
• l'inibizione non é influenzata dalla concentrazione del substrato
La velocità viene modificata quindi come illustrato nel grafico seguente. A lato il grafico con l'inverso
della velocità dove le rette convergono verso -1/ Km e la pendenza aumenta con la concentrazione
dell’inibitore.
Inibizione da substrato
E' un tipo di inibizione caratteristica degli enzimi autoregolantisi per cui in eccesso di substrato si
blocca la reazione e vengono attivati meccanismi o cicli alternativi.
La reazione coinvolta é:
e le velocità di reazione sono come indicato dai grafici. La velocità massima non viene mai raggiunta.
Inibizione da
prodotto
Esistono inibitori
reversibili
fisiologici che
hanno grande
importanza nel
regolare le reazioni intracellulari, che devono essere coordinate in modo che nella cellula si trovino
sempre le concentrazioni ottimali di ATP, coenzimi e dei più importanti intermedi metabolici.
Poiché tutte le reazioni cellulari sono catalizzate da enzimi, la velocità con cui esse decorrono
producendo o consumando intermedi metabolici piò essere bilanciata regolando l’attività di certi enzimi
chiave. L’inibizione a cui si fa riferimento viene detta inibizione da prodotto ed ha funzione regolatrice.
Questo tipo di inibizione riguarda quindi enzimi detti autoregolantisi