Sviluppo di metodiche di mutagenesi a breve termine applicate a

Allegato n. 7
Dottorato di Ricerca in Metodologie di Biomonitoraggio dell’Alterazione ambientale
Presentazione Progetto di Ricerca
Dottorando: Annabella Russo
Ciclo: XXII
Tutore: Prof. Mauro Tretiach
Titolo: Sviluppo di metodiche di mutagenesi ambientale a breve termine applicate a materiale vegetale
Il crescente inquinamento ambientale sta deteriorando sempre più il mondo in cui viviamo. Al fine di studiare le
alterazioni dell’ambiente in modo completo non è sufficiente analizzare le emissioni da un punto di vista chimico-fisico,
ma è necessario valutare il danno arrecato all’intero ecosistema. Tuttavia ciò presenta difficoltà di ordine pratico poiché
i parametri da individuare e analizzare sono tanti e non è sempre possibile risalire agli effetti sinergici degli inquinanti
sui diversi organismi. Per tali motivi vengono impiegati sempre più spesso gli esseri viventi per valutare la qualità
dell’ambiente. L’inquinamento, infatti, è un fenomeno complesso che non può essere ridotto al numero limitato di
sostanze rilevate dalle tradizionali centraline. La possibilità che ha un organismo vivente di reagire a stimoli complessi,
talvolta sconosciuti, dà informazioni più complete sulla qualità di un ambiente rispetto a quelle fornite dai metodi
tradizionali. Rilevando però solo l’effetto complessivo le analisi biologiche non sono in grado di risalire alle singole
cause. Perciò non si deve ritenere che una tecnica escluda l’altra bensì le due metodologie dovrebbero essere usate
sinergicamente per ottenere un quadro completo della compromissione ambientale al fine di intervenire in modo efficace
ed efficiente.
Tra le emissioni inquinanti un ruolo particolare è occupato dalle sostanze mutagene. La mutagenesi è un processo
biologico nel quale l’azione di determinati agenti genotossici conduce alla modificazione stabile dell’informazione
genetica sia a livello di geni che di struttura e numero di cromosomi. L’aria, l’acqua ed il suolo sono spesso contaminati
da sostanze chimiche potenzialmente mutagene e studiare questo tipo di alterazione ambientale assume particolare
rilevanza poiché i composti mutageni sono spesso alla base di numerose patologie compreso il cancro. A tale scopo
vengono condotte indagini epidemiologiche e studi di cancerogenesi utilizzando i mammiferi. Si tratta però di analisi
piuttosto lunghe e costose che possono essere precedute da test di mutagenesi a breve termine capaci di identificare
rapidamente mutazioni geniche e cromosomiche. Attualmente esistono diversi saggi a breve termine che presentano
alcune importanti caratteristiche quali l’elevata praticità, l’alta predittività del potere cancerogeno, la rapidità della
risposta e l’economicità. Questi test utilizzano differenti sistemi biologici come cellule coltivate in vitro o organismi
interi. In particolare i saggi più utilizzati e per i quali esistono protocolli convalidati sono quelli che studiano le
aberrazioni cromosomiche, i micronuclei e gli scambi tra cromatidi fratelli in cellule radicali di Allium cepa e Vicia faba
e i saggi che analizzano le mutazioni geniche in peli staminali o la presenza di micronuclei come indice di avvenuto
danno al DNA nelle cellule del polline di alcune specie del genere Tradescantia. La morfologia dei cromosomi vegetali,
simile a quella dei mammiferi, e la buona correlazione con altri test sono fattori che rendono particolarmente
interessante l’utilizzo di questi bioindicatori (Grant, 1994). Un altro importante vantaggio risiede nella possibilità di
usare questi organismi in situ consentendo monitoraggi in condizioni reali.
Nell’arco dei tre anni di dottorato vorrei occuparmi delle tematiche citate sperimentando l’applicazione di metodiche
diverse che, per il loro carattere innovativo, hanno bisogno ancora di un certo grado di approfondimento metodologico e
che rappresenterebbero comunque un’implementazione di quelle correntemente applicate dai ricercatori del
Dipartimento di Biologia di Trieste. In particolare, nei tre anni di attività di ricerca, si propone di approfondire le
tematiche relative all’applicabilità di Comet test o Elettroforesi su Gel a Singola Cellula (SCGE) e di Tradescantia
micronuclei test (Trad-MCN).
Il Comet test consente di studiare gli effetti causati da agenti mutageni su materiale genetico, permettendo di valutare il
danno al DNA rilevato come rotture dirette dello scheletro fosfodiesterico in cellule eucariotiche sia in vivo che in vitro.
Tramite una corsa elettroforetica si mette in evidenza la disgregazione del DNA che assume la tipica forma di una
cometa. La lunghezza della coda della cometa è proporzionale al danno subito dalla cellula. Tale test può essere
effettuato su un numero basso di cellule (da alcune centinaia a poche migliaia) e con tempi di esecuzione ed analisi di
poche ore. Si può utilizzare per saggiare varie matrici e, nello studio che intendo intraprendere, si prevede di
sperimentarne l’attendibilità analizzando cellule radicali di diverse specie vegetali, coltivate su suoli prelevati in siti già
caratterizzati dal punto di vista degli inquinanti. In un secondo momento l’esame verrà esteso su siti potenzialmente
compromessi del Friuli Venezia Giulia ma non ancora caratterizzati dal punto di vista degli inquinanti. Si ritiene utile
scegliere proprio le cellule radicali poiché sono le prime ad essere coinvolte nell’assorbimento e nel trasporto degli ioni.
Per quanto riguarda il Tradescantia micronuclei test (Trad-MCN) è stato proposto quale utile strumento per analizzare
la compromissione di diverse matrici quali aria, acque potabili o reflue, suoli, emissioni di inceneritori (Monarca et al.,
2001; Cabrera et al.,1999). Il protocollo standard (Ma et al. 1994) rileva la presenza di micronuclei come indice di
avvenuto danno al DNA nelle cellule del polline in piante del genere Tradescantia. Si tratta di un test veloce, di facile
esecuzione e poco costoso che utilizza il clone # 4430 ottenuto dall’incrocio di Tradescantia hirsutiflora e Tradescantia
subacaulis. Si preferisce usare il genere Tradescantia poiché presenta una bassa frequenza di mutazioni spontanee e una
elevata sensibilità a varie classi di mutageni (Ma et al., 1984). Inoltre il clone citato è incapace di riprodursi
sessualmente e le giovani infiorescenze, contenenti cellule polliniche nella Profase I della meiosi, possono essere
LA FACCIATA POSTERIORE E’ PRIVA DI SCRITTURAZIONI
I:\wvarie\Verbale TR8 23 Feb 2007/17
esposte direttamente alla matrice ambientale. I risultati ottenuti vengono espressi come numero di micronuclei per ogni
100 tetradi osservate (MCN/100 tetradi).
Nello specifico si prevede di testare la sensibilità di risposta di questo metodo a diverse tipologie di inquinanti
aerodispersi mediante una serie di esperimenti condotti in condizioni controllate in siti caratterizzati da diverse tipologie
di inquinamento ambientale delle zone urbane e industriali del Friuli Venezia Giulia. Inizialmente si procederà con una
ricerca bibliografica atta a verificare lo stato dell’arte e a stabilire i protocolli migliori da adottare, e
contemporaneamente si procederà con la coltivazione, in serra, del clone # 4430 di Tradescantia, a partire dalle piante
già disponibili, gentilmente messe a nostra disposizione dalla dott.ssa Maddalena Casera del Laboratorio Biologico
dell’Agenzia Provinciale per la Protezione dell’Ambiente e la Tutela del Lavoro di Laives (BZ). Tale operazione
richiederà alcuni mesi poiché sarà necessario predisporre la serra per la coltivazione di almeno un centinaio di piante.
Inoltre non è facile prevedere i tempi di moltiplicazione e crescita delle piante, senza contare che potrebbero verificarsi
delle aggressioni da parassiti o patogeni che rallenterebbero il lavoro. Una volta ottenuti gli esemplari di Tradescantia in
numero sufficiente si procederà con una serie di esposizioni del materiale vegetale nei siti che saranno stati selezionati in
base a diversi parametri topologici (tipo di fonte inquinante, disponibilità di dati analitici accurati, facilità di accesso,
ecc.) e alla possibilità di ottenere le necessarie autorizzazioni. Sarà inoltre opportuno programmare delle esposizioni
anche in corrispondenza di alcune centraline di rilevamento gestite da ARPA Friuli Venezia Giulia, al fine di ottenere un
riscontro diretto tra dati chimico-fisici e quelli ottenuti con il Trad-MCN. Saranno saggiate sia aree lontane dal traffico
veicolare che aree interessate da gas di scarico e riscaldamento domestico. Inoltre si esamineranno siti vicini ad impianti
industriali e zone verdi cittadine, per verificare l’esistenza di possibili differenze quantitative e qualitative nelle sostanze
mutagene. Le infiorescenze verranno sistemate a diverse altezze da terra per verificare un eventuale gradiente di
concentrazione di sostanze mutagene nella colonna d’aria.
Si dovranno inoltre esaminare preventivamente i tempi di esposizione dei campioni, anche in relazione alla stagionalità,
e il “recovery time “ cioè il tempo necessario alle cellule per passare dalla Profase I allo stadio di tetrade (Falistocco et
al., 2000). Dato che il “recovery time” subisce delle variazioni in relazione alla stagione di esposizione, per stabilirlo
sarà necessario effettuare delle prove simulando le diverse temperature esterne.
Bibliografia
FALISTOCCO E., TORRICELLI R., FERETTI D., ZERBINI I., ZANI C. and MONARCA S. (2000): Enhancement of
micronuclei frequency in the Tradescantia micronuclei test using a long recovery time-Hereditas 133:171-174;
GRANT W. (1994): The present status of higher plant bioassays for the detection of environmental mutagens-Mutation
Research 310:175-185;
MA T.H., CABRERA G.L., CHEN R., GILL B.S., SANDHU S.S., VANDENBERG A.L. and SALAMONE M.F.
(1994): Tradescantia micronucleus bioassay- Mutation Research 310:221-230;
MA T.H., HARRIS M.M., ANDERSON V.A., AHMED I., MOHAMMAD K., BARE J.L. and LIN G. (1984):
Mutation Research 138: 157-167;
MONARCA S., FERETTI D., ZANARDINI A., MORETTI M., VILLARINI M., SPIEGELHALDER B., ZERBIBI I.,
GELATTI U. and LEBBOLO E. (2001): Monitoring airborne genotoxicants in the rubber industry using genotoxicity
tests and chemical analyses-Mutation Research 490:159-169.
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