Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea in Fisica STUDIO DI EFFETTI MUTAGENI DOVUTI A CAMPI MAGNETICI A FREQUENZA DI RETE (50 Hz) SU CELLULE VEGETALI Candidato: Francesco Baldacchini Relatore: Giovanni Carboni Tor Vergata, Aula Umberto Grassano, 22 Maggio 2009 Anno Accademico 2007‐2008 Schema della presentazione 1 ‐ INTRODUZIONE 2 – PARTE SPERIMENTALE 3 – RISULTATI SPERIMENTALI 4 – DISCUSSIONE 5 – CONCLUSIONI 6 ‐ RINGRAZIAMENTI INTRODUZIONE La radiazione elettromagnetica (em) può essere: • ionizzante (ri), in massima parte di origine naturale. Effetti ben conosciuti e generalmente nocivi ai viventi Assorbita dall’atmosfera Î sviluppo della vita nella biosfera • non ionizzante (rni). Importanti le sorgenti artificiali in uso sempre più diffuso dal secolo scorso. Finalità della Tesi Tra i campi em non ionizzanti, hanno assunto una particolare importanza a causa della loro diffusione sul territorio quelli a frequenza estremamente bassa (0‐300 Hz), che sono noti con l’acronimo ELF (extremely low frequency). Poiché al momento ci sono studi epidemiologici limitati o inadeguati ed evidenze di laboratorio insufficienti o sufficienti, rispettivamente, i campi em ELF sono stati classificati in via cautelativa dalla IARC (Agenzia Internazionale per la Ricerca nel Cancro) come “possibili cancerogeni” di categoria 2B per l’uomo. In particolare i campi magnetici alternati a 50 Hz sono prodotti dalle linee di trasmissione ed apparecchiature domestiche in modo continuo e pervasivo, per cui il loro impatto con la materia vivente è ancora più importante e quindi meritevole di ulteriori studi. Questa tesi è finalizzata allo studio dei campi magnetici alternati a 50 Hz e ai loro eventuali effetti su organismi biologici, in particolare cellule di Vicia Faba. Classificazione IARC degli agenti cancerogeni ÎEpidemiologia: studio statistico di malattie e di eventi di rilevanza sanitaria nella popolazione. ÎTest di laboratorio: studio degli effetti su animali e su cellule in vitro (evidenza) Gruppo di agenti 1: cancerogeno Classificazione epidemiologia sufficiente, evidenza qualsiasi Esempi Bevande alcoliche, amianto, benzene, radon, raggi X, luce solare, tabacco, fumo passivo, infezione da Helicobacter pylori 2A: probabilmente cancerogeno epidemiologia limitata, evidenza sufficiente Emissioni Diesel, formaldeide, PCB, lampade solari, emissioni da combustione di biomasse (principalmente legno) 2B: possibilmente cancerogeno epidemiologia limitata o inadeguata, evidenza insufficiente o sufficiente 3: non classificabile come cancerogeno epidemiologia inadeguata o assente, evidenza inadeguata o assente Emissioni benzina, cloroformio, caffè, fibre di vetro e di ceramica, sottaceti, campi magnetici ELF Caffeina, te, saccarina, polvere di carbone, lampade fluorescenti, campi elettrici statici e ELF, campi magnetici statici, 4: probabilmente non cancerogeno assenza di carcinogenesi negli umani Caprolattame (irritante e tossico) Valori tipici di campi magnetici ELF Condizioni di esposizione μT 50 G 0.5 Campo elettrico V/m 130 - 40.000 Sotto una linea a 380 kV Entro una tipica abitazione 20 0-1 0.2 0-0.01 5000 0.10 In aree urbane In aree rurali A da un frigorifero A da un frullatore A da un televisore a colori A da un aspirapolvere A da un fornello elettrico A da un asciugacapelli A da un trapano elettrico 0-0.1 0.1-1 100-500 100-500 10-100 50-100 1000-2500 100-500 0-0.001 0.001-0.01 1-5 1-5 0.1-1 0.5-1 10-25 1-5 0.50 0.005 60 50 30 16 4 40 - Valore medio del campo statico sulla superficie della Terra (per confronto) Induzione magnetica Campi magnetici presenti nell’ambiente espressi in unità Gauss e Tesla. I campi elettrici vengono riportati per completezza d’informazione, ma non sono stati presi in considerazione in questo studio (tra l’altro non sono classificati come cancerogeni e sono facilmente schermabili). Stato della ricerca Numerosi progetti internazionali sono stati effettuati negli ultimi anni per studiare gli effetti dei campi ELF sulla materia biologica con risultati contrastanti. Tra questi, è stato ultimato in Europa nel 2003 uno studio chiamato REFLEX (Risk Evaluation of Potential Environmental Hazards From Low Energy Electromagnetic Field Exposure Using Sensitive In Vitro Methods), che ha dimostrato in alcuni casi (esposizione di cellule umane, fibroblasti, a campi em a 1.800 MHz e 50 Hz, e misura degli effetti utilizzando il Test della Cometa e il Test del Micronucleo) la esistenza di effetti genotossici, che però non sono stati confermati da studi successivi. In sintesi, a cinque anni dalla fine del progetto REFLEX, nessuno dei risultati indicanti un’azione genotossica è stato confermato in modo univoco da altri laboratori indipendenti. Frequenza di micronuclei in fibroblasti umani esposti a campi ELF e controlli negativi e positivi. Esempio di risultato da REFLEX PARTE SPERIMENTALE Allo scopo di verificare gli effetti dei campi magnetici alternati a 50 Hz su organismi viventi, abbiamo utilizzato delle bobine di Helmholtz per generare il campo magnetico e delle piantine di Vicia Faba, comune pianta di favino. Le misure sono state effettuate a 2 e 4 mT (valori efficaci), campi magnetici ben superiori a quelli a cui si è sottoposti quotidianamente. Le cellule di Vicia Faba sono state scelte per la loro sensibilità agli agenti mutageni chimici, come è stato accertato nel caso dell’analisi dell’inquinamento di acque fluviali [Rizzoni, 1998]. Gli effetti del campo magnetico sulla mitosi e formazione di micronuclei nelle cellule di Vicia Faba sono stati misurati attraverso l’osservazione diretta con un microscopio ottico. Le esperienze sono state svolte nel Laboratorio di Biologia del Prof Rizzoni. Cellule e mitosi La cellula è il minimo componente di ogni organismo pluricellulare La cellula qui rappresentata è vegetale e si differenzia da quella animale per la presenza dei vacuoli, del cloroplasto e della parete cellulare rigida, ed in genere è di dimensioni maggiori. La riproduzione cellulare avviene tramite il processo della mitosi durante il quale avviene la duplicazione del DNA, che è il costituente del nucleolo. Micronuclei Durante la mitosi, il materiale citoplasmatico viene diviso in due parti eguali, mentre il DNA viene duplicato. Questo processo non è esente da errori naturali, e a volte oltre ai due nuclei finali può essere generato un micronucleo nel citoplasma di una delle due cellule, che è costituito da cromosomi. In particolare si possono avere i seguenti casi: ‐ perdita di un cromosoma, come in figura, o di un cromatidio, ‐ scissione cromosomica precedente alla divisione, ‐ disfunzione del fuso mitotico. La formazione dei micronuclei può essere stimolata da agenti chimici e fisici esterni. Effetti della radiazione ionizzante Numero di micronuclei (MN) per 1000 cellule binucleate (BNC) in funzione della dose di esposizione a una sorgente di radiazione ionizzante [Wojcik, 2000]. 1 gray (Gy) equivale all’assorbimento energetico di 1 J/kg di materia. E’ interessante osservare che anche in assenza di dose di radiazione assorbita vengono prodotti micronuclei. Inoltre, si osserva anche che l’andamento con la dose assorbita non è lineare, un dato di fatto che rivela la complessità dei sistemi biologici. Bobine di Helmholtz Il campo magnetico è stato generato da bobine di Helmholtz (<R> = 10 cm), scelte a causa del maggiore volume di uniformità del campo magnetico ed anche della facilità di inserire campioni rispetto a un solenoide semplice. La corrente alternata è stata regolata tramite un trasformatore disaccoppiante ed un autotrasformatore VARIAC. Il campo magnetico è stato tarato tramite una sonda di Hall, e si è ottenuto B(mT) = 73,11· I(A), per cui i campi usati in questo lavoro richiedono pochi mA di corrente. Crescita delle piantine I semi sono stati posti in coltura in argilla espansa umidificata con acqua di fonte per 4‐5 giorni alla temperatura di 20 °C, il tutto in ambiente sterile per evitare la formazione di muffe e spore. Taglio apice primario (circa 5 mm) e mantenimento dei secondari in coltura in una soluzione acquosa salina (soluzione di Hoaglands). E’ stato scelto di operare sugli apici secondari perché presenti in maggior numero per piantina e per la loro dimensione minore che rende più facile la preparazione dei vetrini. Dopo 3‐4 giorni dal taglio dell’apice primario, gli apici secondari hanno raggiunto le dimensioni necessarie e sono pronti per essere esposti ai vari agenti esterni, sempre con gli apici immersi nella soluzione salina per permettere alle piante di continuare il loro ciclo vitale durante l’esposizione. Preparazione dei campioni Le piantine sono state esposte per un certo tempo ai seguenti agenti esterni Campo magnetico alternato a 50 Hz di 2 e 4 mT (rms) Soluzione 10‐4M di Idrazide maleica (controllo positivo) Nessun agente (controllo negativo) Alla fine della esposizione e del tempo necessario ad uno o più cicli cellulari (uno completo richiede 24 h), le piantine ancora vive vengono sottoposte al fissaggio, ovvero le cellule muoiono e vengono stabilizzate per evitare ogni forma di deterioramento. In seguito, gli apici secondari sono colorati con il metodo Feulgen per marcare il DNA che altrimenti rimarrebbe invisibile come il resto della cellula, e poi schiacciati su un vetrino e coperti opportunamente per la osservazione al microscopio ottico. I vari campioni o vetrini sono catalogati nel seguente modo: VF‐ agente esterno‐tempo di esposizione‐tempo di fissaggio Vetrini e osservazione al microscopio In alto a destra è riportata la foto di un vetrino con 6 apici secondari schiacciati ed un righello per le dimensioni. Ogni apice, macchia colorata, contiene circa 10.000 cellule di Vicia faba, La barra orizzontale indica 10 μm. Sono presenti alcune cellule in fase mitotica (3 metafasi, 2 anafasi e 1 telofase) e 3 micronuclei su un totale nell’intero campo di circa 500 nuclei. Il vetrino è classificato come: VF‐IM‐4‐72‐2, che significa Vicia Faba sottoposta alla Idrazide Maleica per 4 h e fissaggio a 72 h, campione N. 2. LEICA 400X RISULTATI SPERIMENTALI Sono stati misurati per diversi tempi di esposizione e cicli cellulari: - 4 vetrini per il controllo negativo, - 2 vetrini per il controllo positivo, - 16 vetrini per esposizione al campo magnetico, 8 a 2 mT e 8 a 4 mT. I dati sperimentali non mostrano alcuna correlazione con il numero dei cicli cellulari e con i tempi di esposizione, e quindi essi sono stati accorpati opportunamente per una analisi su una base statistica numericamente più significativa come nel seguito. Campione N. mitosi/8.000 cellule N. micronuclei/40.000 cellule VF‐0 508 18 VF‐IM 592 124 VF‐B2 473 24 VF‐B4 483 16 DISCUSSIONE 140 Idrazide Maleica Campo Magnetico 120 Numero di micronuclei Numero di mitosi 600 Idrazide Maleica Campo Magnetico 400 200 100 80 60 40 20 0 0 -1 0 1 2 3 Campo magnetico (mT) 4 5 -1 0 1 2 3 4 5 Campo magnetico (mT) Il grafico a sinistra si riferisce ad una colonia di 8.000 cellule, mentre quella di destra a 40.000. I dati sperimentali relativi al controllo negativo, positivo e all’esposizione al campo magnetico mostrano che l’idrazide maleica aumenta di poco il numero delle mitosi e in modo considerevole quello dei micronuclei. Invece il campo magnetico non sembra produrre variazioni significative in entrambi i casi. Significanza delle misure I dati sperimentali ottenuti possono essere analizzati in dettaglio per verificare l’esistenza di effetti del campo magnetico in particolare per i micronuclei. Avendo definito n0 il valore del controllo negativo e ni il valore dell’esposizione al campo magnetico possiamo calcolare il χ2(n0,ni) e la probabilità a 1 coda P(n0,ni) di osservare almeno ni quando ci si attende n0 cioè la probabilità che il campo magnetico non abbia alcun effetto. I risultati sono riportati nella Tabella. Campo magnetico (mT) 2 4 n0 ni χ2 P (%) 18 18 24 16 0,857 0,118 35 73 Nel nostro caso le due probabilità escludono che ci sia un effetto del campo magnetico, e questo può essere visto anche dal fatto che i valori del χ2 sono molto inferiori al valore del quantile α0,05 = 3,841, P = 5%, per il quale la probabilità che il campo abbia un effetto comincia ad essere significativa. CONCLUSIONI Lo scopo di questo lavoro era quello di verificare gli eventuali effetti nocivi di un campo magnetico alternato a 50 Hz su cellule vegetali di Vicia Faba. A questo scopo sono stati utilizzati i fenomeni della mitosi e della generazione di micronuclei. Le misure sperimentali effettuate mostrano che in entrambi i casi i risultati ottenuti per due valori del campo magnetico, 2 e 4 mT, differiscono in media per meno del ±10% da quelli che si ottengono in assenza di campo magnetico. Questa piccola differenza non è statisticamente rilevante, anche perché l’effetto del campo magnetico non è monotono con la sua intensità. Inoltre, questa deduzione diretta è suffragata dal calcolo della probabilità a una coda del χ2 che è superiore per entrambi i campi magnetici al 35%, valore che esclude qualsiasi dipendenza dal campo stesso. In conclusione i fenomeni della mitosi e della generazione dei micronuclei non mostrano alcun effetto dei campi magnetici alternati a 50 Hz fino a un’intensità di 4 mT sulle cellule di Vicia Faba, e per estensione logica sulle cellule vegetali in generale e probabilmente anche su quelle animali, data la loro somiglianza strutturale. Questi risultati sono stati ottenuti su una base statistica di 8.000 e 40.000 cellule, che potrebbe essere aumentata opportunamente se si volessero risultati più significativi. RINGRAZIAMENTI Questa tesi non sarebbe stata possibile senza l’aiuto pratico e il sostegno morale di numerose persone che non è possibile elencare qui anche per il pericolo di dimenticarne alcune. Grazie a tutti anche per avermi ascoltato! APPENDICE Assorbimento dell’atmosfera Assorbimento spettrale dell’atmosfera terrestre. Curva superiore: Assorbimento spettrale della radiazione solare al livello del suolo. Curva inferiore: assorbimento spettrale della radiazione solare ad un’altezza di 11 km. In entrambe le curve si notano delle bande di assorbimento di alcuni gas atmosferici. [Zuev, 1976]. Produzione energia elettrica in Italia ‐La prima centrale termoelettrica entrò in funzione a Milano nel giugno 1883 ‐Inizia la diffusione di linee ad alta tensione con conseguente formazione di campi em A bassa frequenza, 50 Hz, chiamati ELF, Extra Low Frequency ‐ La IARC, Agenzia Internazionale per la Ricerca nel Cancro, inizia a studiare questi campi e verificarne la loro carcenogenicità. Il consumo di energia elettrica in Italia Crescita lineare Dal 1960 il consumo è sestuplicato Diffusione dei cellulari in Italia L’utilizzo dei cellulari ha portato all’esposizione a campi em dell’ordine dei 850‐1900 MHz Ma con potenze relativamente basse Cellule procariote e eucariota Rappresentazione schematica dei due tipi di cellule che compongono gli organismi biologici: cellula eucariota a sinistra e procariote a destra. Molte sono le differenze tra le due tipologie, ma la più importante è che nella cellula eucariota il DNA è contenuto da una membrana, assente invece nella cellula procariote. La pianta di Vicia Faba La fava (favino) è una pianta della famiglia delle leguminose con la seguente classificazione scientifica: Regno: Plantae Divisione: Magnoliophyta Classe: Magnoliopsida Ordine: Fabales Famiglia: Fabaceae Sottofamiglia: Faboideae Tribù: Vicieae Genere: Vicia Specie: Vicia faba, L. 1753 I fiori pentameri sono di colore bianco striato di nero e ali bianco o violacee con macchia nera. La fecondazione è autogama. Il frutto è un legume allungato terminante a punta che contiene da 2 a 10 semi. Campi elettromagnetici Onda elettromagnetica piana e monocromatica, con indicati i parametri E, H, λ e ν che la caratterizzano, e che si muove lungo l’asse Z con velocitaà c. la potenza trasportata dall’onda nel verso dell’asse Z è definita come l’energia che attraversa l’unità di superficie nell’unità di tempo, ed è data da: I = E⋅H Da un punto di vista quantistico un campo em di frequenza ν equivale ad uno o più quanti di luce, fotoni, ciascuno di energia: E = hν (J), dove h = 6.626 10‐34 J∙s è la costante di Planck. Se n è il numero di fotoni per secondo di un campo em monocromatico, allora la sua intensità è data da: I = nhν (W / m 2 ) Effetti della radiazione em Radiazione ionizzante: Questa radiazione inizia alla fine della parte visibile dello spettro, circa ν = 1015 Hz e hν = 5 eV, e si estende fino ai raggi gamma. Queste onde em hanno l’energia necessaria per rompere i legami elettronici degli atomi e delle molecole, ionizzare quindi la materia e provocare danni alla cellula stessa in tutti i suoi componenti. Ad esempio una radiazione ionizzante può colpire un’elica del DNA e romperla, ed in questo caso il messaggio genetico cellulare è interrotto, ma la cellula può facilmente riparare questo danno, perché la continuità del cromosoma è garantita dall’elica intatta. Invece la rottura di entrambe le eliche nello stesso punto della molecola di DNA può essere riparata con maggiore difficoltà; allora le cellule possono subire mutazioni, dare origine a crescite incontrollate come i tumori oppure muoiono. Tuttavia il danneggiamento avviene solamente ad alte intensità quando entrambi i filamenti vengono interrotti contemporaneamente e nella stessa zona del DNA. La probabilità P che un fotone possa rompere un filamento è proporzionale all’intensità della radiazione, mentre la probabilità che la stessa radiazione rompa un doppio filamento, essendo i due processi indipendenti, è data da P2. Poiché P<1, si ha che P2<<1. Effetti della radiazione em Radiazione non ionizzante: Nel caso in cui la energia della radiazione sia sotto la soglia della ionizzazione, allora essa viene assorbita dalle varie e possibili transizioni di assorbimento della materia che costituisce le cellule. Le radiazioni di confine come quelle UV con lunghezza d’onda tra 200 e 300 nm hanno l’energia sufficiente per fare “saltare” di livello energetico gli elettroni di risonanza delle pirimidine, in particolare della Timina; il risultato è la formazione di legami covalenti fra due molecole adiacenti di Timina sullo stesso filamento di DNA (dimeri di Timina); questo danno è incompatibile con la sopravvivenza delle cellule e necessita di riparazione; errori di riparazione possono portare a mutazioni e allo sviluppo di tumori. In generale ci possono essere assorbimenti in tutte le zone spettrali dal visibile alle microonde, ma poiché le cellule sono composte principalmente di acqua, il maggior assorbimento avviene nelle microonde, cioè per transizioni rotazionali della molecola di acqua. In genere questa energia em assorbita si trasforma per processi di rilassamento (trasferimento alle vibrazioni, cioè fononi) in calore, e le cellule si riscaldano. Nel caso in cui l’aumento di temperatura sia consistente, le cellule muoiono. In genere ciò accade a circa 100 °C, che nella scala delle energie corrisponde a 35 meV. Quindi l’effetto della radiazione non ionizzante è essenzialmente il riscaldamento delle cellule, ma in condizioni particolari è possibile anche il fenomeno della ionizzazione come conseguenza dell’assorbimento multifotonico. Effetti dei campi em ELF I campi em ELF sono un caso particolare della radiazione non ionizzante in cui anche il riscaldamento viene praticamente a mancare. Infatti dal punto di vista quantistico, a causa della bassissima frequenza, non ci sono interazioni apprezzabili a livello fotonico, e quindi la cellula attraversata dall’onda em subisce un campo elettrico e magnetico che varia con la frequenza dell’onda, e che equivale a tutti gli effetti ad un campo alternato alla stessa frequenza. Quindi studiare gli effetti di campi alternati su una cellula equivale a studiare gli stessi effetti di un’onda em alla stessa frequenza. Inoltre mentre un campo elettrico può essere facilmente schermato con materiale conduttore (per esempio una gabbia di Faraday), è molto più difficile se non impossibile schermare un campo magnetico. Allora è evidente che è importante studiare gli effetti di un campo magnetico alternato, come in questa tesi. Ricordiamo inoltre che per i campi ELF si ha: hν << kT a temperatura ambiente, Per cui l’eccitazione termica è molto maggiore della eccitazione della radiazione anche ad alta intensità. Generazione di campi em I campi em vengono generati di solito da dipoli elettrici nei quali si fa circolare una corrente alternata a frequenza ν, che produce un campo em della stessa frequenza. La potenza di questo campo em è data dalla formula: P ≈ I2∙d2∙ν2 In cui I è la intensità di corrente e d la lunghezza del dipolo o antenna. E’ chiaro allora che per frequenze molto basse, come per i campi ELF, e dipoli piccoli, la potenza del campo em diviene insignificante. Come consequenza, tutti gli apparati che assorbono correnti elettriche alternate a 50Hz in pratica non emettono campi em ma piuttosto generano bampi elettrici e magnetici oscillanti. Bobine di Helmhotz Campo magnetico assiale normalizzato per le bobine di Helmholtz e di un solenoide di uguali dimensioni in funzione della distanza dal centro geometrico normalizzate al raggio. Si osserva una uniformità spaziale molto maggiore nel caso delle bobine. Sonda di Hall Alimentatore bobine di Helmholtz Alimentatore sonda di Hall Bobina Voltmetro Sonda di Hall Bobina Schema dell’apparato sperimentale per l’alimentazione e calibrazione delle bobine di Helmholtz. La sonda di Hall è alimentata da un altro generatore di corrente e la sua tensione viene letta da un voltmetro di precisione. Questo dispositivo è un semiconduttore che percorso da una corrente continua costante, in presenza di un campo magnetico esterno, genera ai suoi capi una ddp, per effetto Hall, proporzionale al campo applicato. Il valore della corrente di funzionamento della sonda di Hall utilizzata è di 100 mA e il valore di conversione vale 795 μV/kG. Idrazide maleica Struttura chimica dell’idrazide maleica, C4H4N2O2. Appartiene a una famiglia di prodotti come il Cycocel, B‐9, Phosphon, Ancymidol. In particolare l'idrazide maleica è da tempo usata per il contenimento della taglia di alberi e di arbusti ornamentali impiegati come verde pubblico, in quanto inibisce l'attività meristematica in generale. Mitosi, micronuclei e campo magnetico 10 Numero micronuclei/10.000 cellule 140 Numero di mitosi/2.000 120 100 80 60 40 20 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 Numero d'ordine del campione 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Numero d'ordine del campione I primi 4 istogrammi si riferiscono al campo magnetico di 2 mT, mentre i secondi 4 a 4 mT. Inoltre i dati si riferiscono a diversi tempi di esposizione e fissaggio. Ad una prima osservazione visuale non ci sono correlazioni evidenti dei dati con le condizioni sperimentali. Quindi i dati possono essere cumulati tra loro. Microscopio confocale Immagine di un campione di VF esposto a 4 mT presa con un microscopio confocale. Sono state misurate anche le dimensioni di un nucleolo, 3.84 μm, e di un nucleo sferico, 10.67 μm. È probabile che alcune delle cellule oblunghe siano in uno stato intermedio del processo di mitosi Immagini con raggi X molli Un’immagine a raggi x molli della cellula Chlamydomonas dysosmos che sta effettuando il processo di mitosi. Si osservano alcuni organuli bianchi vicino il setto di divisione.