Il ciclo dell’acido citrico Il catabolismo di proteine, grassi e carboidrati avviene nelle tre fasi della respirazione cellulare Il piruvato viene ossidato ad acetil-CoA e CO2 La decarbossilazione ossidativa del piruvato per formare acetil-CoA, che avviene nei mitocondri delle cellule eucariotiche, è il legame tra la glicolisi ed il ciclo dell’acido citrico. La reazione è catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi. La deidrogenazione e la decarbossilazione del piruvato ad acetil-CoA coinvolgono l’azione sequenziale di 3 enzimi diversi (ciascuno formato da più catene polipeptidiche) e di 5 coenzimi: tiamina pirofosfato (TPP), flavin adenin dinucleotide (FAD), coenzima A (CoA), nicotinamide adenin dinucleotide (NAD) e lipoato Struttura del coenzima A Acido lipoico unito da un legame amidico alla catena laterale di un residuo di Lys. Tiamina pirofosfato Fotografia al microscopio elettronico del complesso della piruvato deidrogenasi di E. coli. La conversione del piruvato in acetil CoA è costituita da tre tappe Queste tappe devono essere accoppiate per conservare l’energia libera derivata dalla tappa di decarbossilazione che rende possibile la formazione di NADH e di acetil CoA. 1) Il piruvato si combina con il TPP e poi viene decarbossilato Enzima: componente piruvato deidrogenasi (E1) del complesso multienzimatico. L’atomo di C tra l’N e lo S dell’anello tiazolico della TPP è più acido della maggior parte dei gruppi =CH- Questo gruppo si ionizza per formare un carbanione, che si addiziona facilmente al gruppo carbonilico del piruvato. 1) Meccanismo della reazione di decarbossilazione di E1, il componente piruvato deidrogenasi del complesso della piruvato deidrogenasi 1) Il carbanione del TPP si addiziona al gruppo carbonilico del piruvato 2) Questa addizione è seguita dalla decarbossilazione del piruvato L’anello carico positivamente del TPP agisce da trappola di elettroni che stabilizza la carica negativa generata dalla decarbossilazione. Tale carica viene trasferita all’anello. 3) La protonazione forma idrossietil-TPP Il gruppo idrossietilico legato alla TPP viene ossidato a formare un gruppo acetile ed è trasferito alla lipoamide, un derivato dell’acido lipoico legato ad un residuo di lisina dell’enzima L’ossidante è il gruppo disolfuro della lipoamide Questa reazione è catalizzata ancora dalla componente piruvato deidrogenasi E1. Il gruppo acetile viene trasferito dalla acetillipoamide al CoA per formare Acetil CoA Questa reazione è catalizzata dalla diidrolipoil transacetilasi E2. Il legame tioestere ricco di energia viene conservato. La forma ossidata della lipoamide viene rigenerata dalla diidrolipoil deidrogenasi (E3) Il complesso della piruvato deidrogenasi non è in grado di portare a termine un altro ciclo catalitico finchè la diidrolipoamide non è riossidata a lipoamide Due elettroni vengono trasferiti a un gruppo prostetico FAD dell’enzima e poi al NAD+ (trasferimento insolito ?) Il potenziale di trasferimento di un elettrone del FAD viene modificato dalla sua associazione all’enzima e gli permette di trasferire elettroni al NAD+. Tappe della decarbossilazione ossidativa del piruvato ad acetil-CoA da parte del complesso della piruvato deidrogenasi E1= piruvato deidrogenasi E2= diidrolipoil transacetilasi E3= diidrolipoil deidrogenasi Reazioni del ciclo dell’acido citrico 1) Formazione del citrato L’atomo di carbonio metilico del gruppo acetilico si lega al gruppo carbonilico (C2) dell’ossalacetato. La reazione catalizzata dalla citrato sintasi è una condensazione aldolica seguita da un’idrolisi L’idrolisi del citril CoA fa procedere la reazione verso la sintesi del citrato La citrato sintasi deve l’idrolisi di acetil CoA impedire Modificazioni conformazionali della citrato sintasi in seguito al legame dell’ossalacetato Il legame dell’ossalacetato, che avviene per primo, induce un importante riarrangiamento strutturale che determina la creazione di un sito di legame per l’acetil CoA La citrato sintasi catalizza la reazione di condensazione portando i substrati molto vicini, orientandoli e polarizzando specifici legami. Meccanismo di sintesi del citril CoA ad opera della citrato sintasi Il residuo His 274 dona un protone all’ossigeno carbonilico dell’acetil CoA per promuovere la rimozione del protone metilico da parte dell’Asp 375 L’ossalacetato viene attivato dal trasferimento di un protone dall’His 320 al suo atomo di carbonio carbonilico Il concomitante attacco dell’enolo dell’acetil CoA al carbonio carbonilico dell’ossalacetato determina la formazione di un legame C-C Meccanismo di sintesi del citril CoA ad opera della citrato sintasi Il citril CoA neoformato induce altre modificazioni strutturali dell’enzima. Il sito attivo viene racchiuso completamente e His 274 partecipa nuovamente come donatore di protoni per idrolizzare il tioestere Il CoA abbandona l’enzima seguito dal citrato e l’enzima torna nella conformazione aperta Citrato sintasi L’enzima dopo aver legato l’ossalacetato (in giallo) va incontro a una grande modificazione conformazionale. In rosso un analogo stabile dell’acetil-CoA L’enzima è in grado di idrolizzare il citril CoA ma non l’acetil CoA: a) l’acetil CoA non si lega all’enzima finchè l’ossalacetato non è legato e pronto alla condensazione; b) I residui catalitici cruciali per l’idrolisi del tioestere non sono posizionati in modo appropriato finchè non si forma il citril CoA 2) Il citrato viene isomerizzato a isocitrato L’isomerizzazione avviene attraverso una reazione di deidratazione seguita da una di idratazione. Il centro Fe-S è importante sia nel legame col substrato sia nel processo catalitico 3) Ossidazione dell’isocitrato ad α-chetoglutarato e CO2. Decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato catalizzata dalla isocitrato deidrogenasi Si produce NADH β-chetoacido instabile 4) Ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA e CO2. L’energia dell’ossidazione dell’α-chetoglutarato viene conservata mediante la formazione del legame tioestere del succinil-CoA. Questa reazione è praticamente identica alla reazione della piruvato deidrogenasi; il complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi è molto simile al complesso della piruvato deidrogenasi sia come struttura che come funzione (3 Enzimi, E1, E2 e E3 e 5 coenzimi). 5) Conversione del Succinil-CoA a succinato e formazione di un legame fosforico ad alta energia. GTP + ADP ' GDP + ATP Reazione catalizzata dalla nucleoside difosfochinasi Reazione della succinil-CoA sintetasi 1) Un gruppo fosforico sostituisce il CoA nel succinil-CoA legato all’enzima, formando un acil fosfato ad alta energia. 2) Il succinil fosfato dona il gruppo fosforico a un residuo di His dell’enzima, producendo un fosfoistidil-enzima ad alta energia 3) Il gruppo fosforico viene trasferito dal residuo di His al gruppo fosforico terminale del GDP generando GTP. Meccanismo di reazione della succinil-CoA sintetasi Succinil fosfato L’enzima succinil-CoA sintetasi di E. coli. La sequenza amminoacidica di questo enzima nei batteri e nei mammiferi è simile e presumibilmente è molto simile anche la struttura tridimensionale. Il sito attivo include parte della subunità α (in blu) e parte della subunità β (in marrone). Le “eliche potenti” (in blu scuro e in marrone scuro) avvicinano le loro parziali cariche positive al gruppo fosforico (in arancione) che si trova sull’His246 della catena α, stabilizzando il fosfoenzima intermedio. In rosso è rappresentato il CoA …rigenerazione dell’ossalacetato per ossidazione del succinato (6, 7 e 8), 6) Ossidazione del succinato a fumarato Il FAD è l’accettore di atomi di idrogeno in questa reazione in quanto la variazione di energia libera è troppo piccola per ridurre il NAD+. Il FAD è strettamente legato alla succinato deidrogenasi. La succinato deidrogenasi è il solo enzima del ciclo dell’acido citrico a essere legato alla membrana. Gli elettroni estratti dal succinato passano attraverso il FAD ed entrano nella catena di trasporto degli elettroni della membrana mitocondriale interna 7) Idratazione del fumarato per produrre malato 8) Ossidazione del malato ad ossalacetato La reazione complessiva del ciclo dell’acido citrico è: Acetil CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + H2O Æ ¿ 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2 H+ + CoA Il ciclo di Krebs opera soltanto in condizioni aerobiche poiché il NAD+ e il FAD possono essere rigenerati nel mitocondrio soltanto dal trasferimento degli elettroni all’ossigeno molecolare. Il ciclo dell’acido citrico, come tutte le altre vie metaboliche, è il prodotto dell’evoluzione, la maggior parte della quale è avvenuta prima della comparsa degli organismi aerobici. Molto probabilmente i primi organismi anaerobici usavano alcune delle reazioni del ciclo dell’acido citrico in processi biosintetici lineari. Esistono moderni organismi anaerobici che mancano dell’ α-chetoglutarato deidrogenasi e pertanto non sono in grado di compiere un giro completo del ciclo dell’acido citrico. L’α-chetoglutarato e il succinil-CoA sono tuttavia precursori importanti di una varietà di vie biosintetiche. I componenti del ciclo dell’acido citrico sono importanti intermedi biosintetici Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo dell’acido citrico di intermedi Ruolo della biotina nella reazione della piruvato carbossilasi Regolazione del ciclo dell’acido citrico Il complesso della piruvato deidrogenasi è regolato allostericamente e per fosforilazione reversibile Il complesso della piruvato deidrogenasi è inibito dai suoi prodotti immediati, il NADH e l’acetil CoA. Il componente piruvato deidrogenasi è regolato anche dalla modificazione covalente; una chinasi specifica fosforila e inattiva la piruvato deidrogenasi, e una fosfatasi attiva la deidrogenasi rimuovendo il gruppo fosforico. L’aumento del rapporto NADH/NAD+, acetil CoA/CoA o ATP/ADP promuove la fosforilazione e quindi l’inattivazione del complesso. La piruvato deidrogenasi è inattiva quando la carica energetica è elevata e gli intermedi biosintetici sono abbondanti. Il ciclo dell’acido citrico è regolato in più punti. La velocità del ciclo dell’acido citrico è regolata con precisione in modo da soddisfare il fabbisogno di ATP di una cellula animale. I punti di regolazione primari sono gli enzimi allosterici isocitrato deidrogenasi e α-chetoglutarato deidrogenasi. Il ciclo del gliossilato Il ciclo del gliossilato Nelle piante ed in alcuni invertebrati e microorganismi l’acetato può servire sia come fonte di energia che come precursore per la sintesi dei carboidrati. La reazione complessiva del ciclo del gliossilato è: 2 Acetil CoA + NAD+ + 2 H2O Æ Succinato + 2 CoA + NADH + H+ PEP carbossichinasi Ossalacetato + GTP Æ Fosfoenolpiruvato + CO2 + GDP Via gluconeogenetica Nelle piante, gli enzimi del ciclo del gliossilato sono sequestrati all’interno di organelli circondati da membrana detti gliossisomi. Relazioni tra il ciclo del gliossilato e il ciclo dell’acido citrico Le reazioni del ciclo del gliossilato (nei gliossisomi) procedono simultaneamente con quelle del ciclo dell’acido citrico (nei mitocondri), e gli intermedi passano attraverso il citosol a questi due compartimenti. La conversione del succinato a ossalacetato è catalizzata dagli enzimi del ciclo dell’acido citrico. Mediante la combinazione di queste due vie metaboliche le piante in germinazione sono in grado di convertire gli atomi di carbonio dei lipidi dei semi in glucosio. Il ciclo del gliossilato e il ciclo dell’acido citrico sono regolati in modo coordinato Il ciclo dell’acido citrico e il ciclo del gliossilato competono per l’isocitrato. Quando i livelli di ATP sono elevati l’isocitrato deidrogenasi viene inattivata mediante fosforilazione e l’isocitrato viene incanalato nel ciclo del gliossilato per la formazione di intermedi per la biosintesi.