CENTRO GRANDI STRUMENTI Università degli Studi di Pavia Image Restoration e Deconvoluzione Quantitativa delle Immagini 17 Febbraio 2011 Immagini & Computer S.n.c. Via Don Carlo Riva 4 20010 Bareggio (Mi) Image Restoration Quando? Quando serve una rappresentazione fedele all’originale. Quando vogliamo massimizzare la risoluzione, il contrasto ed il contenuto informativo delle immagini. Quando vogliamo effettuare una analisi quantitativa dei nostri campioni. Quando …. Image Restoration La creazione dell’immagine digitale Image Restoration Il percorso ideale Misura Trattamento dell’immagine Raccolta delle immagini Marcatura adeguata delle strutture Preparazione del campione Image Restoration Principali sorgenti di errore Sistema Ottico e di acquisizione Rumore Campione Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Decadimento delle caratteristiche del segnale. Spessore del campione Errata marcatura Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Degrado delle caratteristiche dell’immagine originale. Alterazione del contenuto informativo •Rumore segnale (distribuzione di Poisson) •Rumore digitale (distribuzione Gaussiana) •Photobleaching •Quencing • etc. •Autofluorescenza. •Luce estranea •Disomogeneità di illuminazione •Acquisizione •Diffrazione luce •Aberrazioni sferiche e cromatiche •Artefatti •Fuori fuoco Errata scelta dei processi di manipolazione delle immagini Background Fattore Umano Image Restoration Risulta quindi basilare 1. Prendere consapevolezza dei punti critici insiti nel processo. 2. Studiare e definire i metodi di preparazione del campione più idonei 3. Studiare e definire i metodi ed i processi di acquisizione e trattamento delle immagini. (Protocolli di acquisizione ed analisi). 4. Preservare il patrimonio informativo presente nell’immagine Image Restoration Gli ostacoli sul percorso Image Restoration Formazione delle immagini Raccolta delle immagini Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini. Rimozione del rumore Rilocazione della luce fuori fuoco Correzione degli artefatti Decadimento (Photobleaching,ect) Correzione disomogeneità fondo Instabilità di illuminazione Registrazione Mosaicatura Pubblicazione Identificazione delle strutture Segmentazione Distinzione da altre strutture Codifica dei confini e misura Classificazione Evoluzione e comportamento delle strutture Tracking Cinetica RatioImaging Image Restoration Formazione dell’immagine ottica – sorgenti di errore Preparazione del campione Sistema Ottico Rumore Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Il segnale deve risultare significativamente più elevato del rumore. •Rumore Poisson (campione) •Rumore ottico Background Degrado delle caratteristiche dell’immagine originale. Introduzione di aberrazioni ottiche e di fenomeni di diffrazione. •Funzione di diffusione luce •Aberrazioni sferiche e cromatiche •Fuori fuoco •Artefatti Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Deve essere sottratto al valore del segnale. •Autofluorescenza.. •Luce estranea Image Restoration Come si forma una immagine ottica Il piano di fuoco selezionato viene, attraverso il sistema ottico (obiettivo), proiettato su un piano focale secondario (posteriore). Quello che noi osserviamo attraverso gli oculari non è il campione originale ma la sua trasposizione ottica generata attraverso il processo di convoluzione. Obiettivo Lunghezza di camera 18 - 25 cm Piano di fuoco del campione Oculare Piano di Fuoco Oculare Piano di Fuoco posteriore Piano di Fuoco osservato ∞ Image Restoration Come si forma una immagine ottica Considerate il campione come un insieme di infiniti punti di emissione luminosa con dimensioni inferiori al limite di risoluzione ottica Quando la luce che arriva dai vari punti che compongono il campione attraversa il sistema ottico (obiettivo) essi appaiono come piccoli pattern e non come punti (Airy pattern) nell’immagine ricostruita . La parte centrale del pattern è conosciuta come Airy Disk e contiene > 80% dell’intensità totale del punto. Image Restoration Formazione dell’immagine ottica Piano di Fuoco posteriore Tutta la luce presente nelle strutture comprese entro la DoF viene proiettata sul piano do fuoco posteriore Ottica Campione Piano Focale Profondità di campo (DoF) Image Restoration Diffusione della luce A causa della profondità di campo dell’obiettivo utilizzato, la luce proveniente dai piani di fuoco adiacenti a quello principale fornisce il proprio contributo nella formazione dell’immagine. La profondità di campo identifica la porzione (o spessore) del campione i cui estremi rimangono simultaneamente a fuoco all’interno della stessa immagine. La profondità di campo è funzione principalmente della apertura numerica della lente e della lunghezza d’onda di emissione della luce utilizzata. Image Restoration Diffusione della luce Il processo fisico che rappresenta il modello di diffusione della luce è descritto dalla funzione che prende il nome di PSF (Point Spread Function) Campione PSF Proiezione ottica La Point Spread Function (PSF) rappresenta “il mattone” sul quale l’immagine viene costruita. Image Restoration Processo di costruzione dell’immagine ottica G(x) F(x) G = Proiezione ottica F = Immagine Ideale H = Point Spread Function N = Rumore (quantico ed elettronico) H(x) N(x) Image Restoration Aberrazione Sferica L’aberrazione sferica rappresenta una distorsione ottica generata dalla differente posizione di focalizzazione dei raggi oblicui (periferici) rispetto ai raggi centrali che attraversano la lente. L’aberrazione sferica è generata da una imperfezione del percorso ottico. La causa può essere identificata sia nella qualità costruttiva dell’obiettivo, sia nelle differenze esistenti tra gli indici di riflessione dei media utilizzati per interfacciare gli obiettivi (aria, olio, acqua, ect) e quelli dei media utilizzati per fissare il campione. Lo spessore del campione stesso può contribuire alla sua generazione. Image Restoration Aberrazione Sferica L’aberrazione sferica introduce asimmetria nella distribuzione della luce, aggiunge componenti fuori fuoco e riduce il livello del segnale. Image Restoration Disallineamento cromatico Errore sistematico caratteristico dei sistemi ottici (obiettivi). La luce monocromatica viene focalizzata su piani diversi in funzione della sua lunghezza d’onda. Errore più consistente lungo asse Z. Risente delle condizioni meccaniche ed ambientali (temperatura) Utilizzo di obiettivi corretti cromaticamente. Misura sperimentale del disallineamento attraverso sfere fluorescenti. Correzione con ricalcolo dello stack Image Restoration La raccolta delle immagini Image Restoration La raccolta delle immagini richiede una serie di accorgimenti quali : Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z Adeguata considerazione della dinamica del segnale (rappresentazione dell’evento) Corretta definizione dei parametri operativi (potenza del laser, esposizione della telecamera, impostazione PMT, livello di illuminazione del campione) Qualità della ripresa Corretta (e strutturata) memorizzazione delle immagini Standardizzazione del processo [Protocollo di acquisizione] Image Restoration Dinamica del segnale Il range dinamico descrive l’escursione relativa della intensità del segnale (fluorescente) in osservazione Espresso come “Flusso di Fotoni “(fotoni / unità di sup. / Sec.) La dinamica dell’immagine digitale è determinata dalle caratteristiche del dispositivo di acquisizione utilizzato. (PMT o CCD) Essa rappresenta il numero di valori discreti che compongono la scala numerica utilizzata per descrivere il segnale analogico nella sua forma digitale (Livelli di Grigio). Continuo Discreto Image Restoration Dinamica del segnale La scala numerica (scala dei grigi) ha dimensioni standardizzate (256 GL, 4096 GL, 16384 GL, 65356 GL) Per i sensori CCD la scala numerica è determinata dal rapporto tra la capacità di immagazzinamento dei fotoni (FWC) propria delle singole celle ed il contributo dei rumori intrinseci da esso generati. (Read Noise, Termal noise, ect) Consideriamo un CCD con FWC pari a 40.000 e con un Noise di 12 e . Il relativo RDD risulta : GrayLevels = 40.000 / 12 = 3.333 -> [12 bit (4.096 GrayLevels)] L’efficienza di conversione definisce il numero di fotoni descritto dal singolo livello di grigio. EC = FWC / GL (- Offset) EC = 40.000 / 4096 = 9.7656 f FWC inversamente proporzionale alle dimensioni della singola cella CCD. Analisi quantitativa delle immagini Dinamica del segnale Ottimizziamo la dinamica digitale dell’immagine durante l’acquisizione Segnale sovraesposto Bilanciando adeguatamente guadagno PMT e potenza del laser 80 %o Utilizzando tempi di esposizione adeguati (CCD) 20 %o Segnale sottoesposto Isolare le zone sovraesposte Aumentando l’intensità di illuminazione del campione Utilizzando le funzioni di binning (CCD) Image Restoration Il Campionamento La densità di campionamento stabilisce il numero di unità digitali di base (pixel o voxel) chedevono essere acquisite per unità di superfice / volume. In pratica definisce le dimensioni ideali del pixel / voxel nelle specifiche condizioni operative allo scopo di salvaguardare il contenuto informativo del campione. Z Y X Image Restoration Il Campionamento La dimensione ideale del pixel / voxel, al di fuori del quale il processo di acquisizione può produrre artefatti, viene calcolata secondo il teorema di Nyquist-Shannon. “La frequenza di campionamento di un segnale (Analogico ->Digitale) deve risultare più grande del doppio della bandapassante del segnale originale in modo da garantirne la perfetta ricostruzione digitale.” Voxel Struttura La massima dimensione del pixel / voxel deve risultare inferiore alla metà del più piccolo oggetto o struttura presente nell’immagine. Image Restoration La dimensione del più piccolo oggetto o struttura presente nell’immagine è equivalente al limite risolutivo del sistema ottico (e digitale) in uso. Calcolo Z secondo Nyquist Δz = λem / (2 N (1- cos α)) Λem = emission wavelenght N = medium index α = ½ angolo apertura obiettivo Calcolo XY secondo Nyquist Δxy = λem / (4 N sen α) In pratica Λem = 520nm N = 1.515 NA = 1.3 α = αrcsen(NA/N) Δz = 520 /(2*1.515*(1-cos α)) Δz = 353 nm Calcolatore Nyquist Un densità di campionamento inferiore al valore calcolato non è accettabile. Un minimo sovracampionamento non influisce sulla qualità delle informazioni. Un eccessivo sovracampionamento è inutile e spesso deleterio. Image Restoration Il Campionamento Spessore lettura in Z Spessore campione Campionare lungo asse Z aumentando lo spessore reale del campione di circa il 40/50% per lato (esempio : spessore campione 10um – campionare 20um totali). Image Restoration Archiviazione delle immagini I danni introdotti dai sistemi di compressione ad alta efficienza (Jpeg, Jpeg2000, ect) non sono immediatamente percettibili. Essi si manifestano sotto forma di “pixellatura” artificiale dell’immagine. Image Restoration Archiviazione delle immagini I singoli pixel subiscono una modifica in termini di contenuto cromatico e/o di intensità/densità. Tale variazione può introdurre un errore di valutazione importante (5% - 10%) direttamente rapportato al coefficiente di compressione utilizzato. TIFF JPEG Differenza assoluta Image Restoration Risoluzione Analisi quantitativa delle immagini Le molteplici risoluzioni di un sistema A. Risoluzione Ottica : limite di discriminazione tra due oggetti adiacenti. Determinato dalla apertura numerica dell’obiettivo e dalla lunghezza d’onda di emissione della luce. B. Risoluzione spaziale : limite di discriminazione del sensore CCD. Determinato dalle dimensioni della singola cella del sensore e dall’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato. C. Risoluzione Immagine : caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine. Analisi quantitativa delle immagini La risoluzione Ottica. La risoluzione ottica del microscopio è funzione della : • lunghezza d’onda della luce utilizzata. • apertura numerica (N.A.) dell’obiettivo. La risoluzione ottica del microscopio NON dipende dall’ ingrandimento dell’obiettivo. La seguente formula, conosciuta come criterio di Rayleigh, calcola il limite di risoluzione assoluto . R laterale = 0,61 λem/ N.A. (N.A.= n sen a ) R assiale = 2 λem * n / N.A. 2 Profondità di campo = R assiale/2 = λem * n / N.A. 2 Si consideri che: • Maggiore e’ l’angolo (N.A.) con cui l’obiettivo è in grado di raccogliere la luce maggiore è il potere di risoluzione •Maggiore è N.A. minore è la distanza di lavoro •Per obiettivi in aria a è sempre minore di 90° Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione spaziale & Risoluzione discriminante La risoluzione spaziale rappresenta la dimensione, espressa in unità metriche, del più piccolo oggetto, proiettato sul piano di fuoco, identificabile come tale dal sistema di acquisizione. La risoluzione discriminante rappresenta la distanza minima, espressa in unità metriche, che deve intercorrere tra due oggetti proiettati sul piano di fuoco, e ben contrastati tra loro, per poter essere identificati come tali dal sistema di acquisizione. Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione spaziale In presenza di un dispositivo CCD, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni della singola cella del sensore (pixel size) e del’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato secondo la formula:Rs= (Pixel size / Ingrandimento obiettivo) In presenza di un dispositivo PMT confocale, la risoluzione spaziale risulta funzione delle dimensioni Pin Hole utilizzato (Airy unit), dal fattore di ingrandimento (zoom) e dal numero di pixels utilizzati per la matrice di acquisizione. L’impostazione di questi parametri è strettamente dipendenti dai valori di densità di campionamento calcolati utilizzando la formula di Nyquist. 4.6 um Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione discriminante A causa delle caratteristiche fisiche del sensore CCD, due oggetti devono distare almeno di un pixel tra loro per poter essere discriminati come tali. Rd = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3) Esempio : Pixel size = 6.4 um, Ingrandimento = 100x Risoluzione spaziale = (6.4 / 100) = 0.064 um ->(Pixel size / Ingrandimento) Risoluzione Discriminante = ((6.4 / 100) * 2.3) = 0.147 um ->(Pixel size / Ingrandimento) * 2.3 Analisi quantitativa delle immagini Risoluzione Immagine Caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine. Da non confondere con i DPI. 1024 x 768 pixel 2048 x 1536 pixel Image Restoration Artefatti & affini Image Restoration Principali sorgenti di errore Artefatti Sistema Ottico e di acquisizione Rumore Campione Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Decadimento delle caratteristiche del segnale. Spessore del campione Errata marcatura Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Degrado delle caratteristiche dell’immagine originale. Alterazione del contenuto informativo •Rumore segnale (distribuzione di Poisson) •Rumore digitale (distribuzione Gaussiana) •Photobleaching •Quencing • etc. •Autofluorescenza. •Fuori fuoco. •Luce estranea •Disomogeneità di illuminazione •Acquisizione •Valutazione PSF •Aberrazioni sferiche e cromatiche •Disallineamento •Artefatti Errata scelta dei processi di manipolazione delle immagini SNR Rapporto segnale rumore Background Fattore Umano Errori sistematici Errori casuali Image Restoration Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR) Rappresenta il rapporto tra i disturbi presente nell’immagine e l’effettivo segnale. Image Restoration In un sistema di acquisizione basato su telecamera CCD il Rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come: SNR = PQet / [PQet + Dt + Nr2] 1/2 Dove P rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Qe l’efficienza quantica del sensore, t il tempo di integrazione (Secondi), D la Dark Noise (Elettroni/pixel/Secondo) e Nr il Read Out Noise. Il segnale proveniente dal Background (Scatter o Riflessione) influisce sulla qualità del valore di SNR e deve di conseguenza essere tenuto in considerazione nel calcolo. SNR = PQet / [(P+B)Qet + Dt + Nr2] 1/2 In un sistema confocale il rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come: Dove N rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Q il noise generato dal laser, S il Noise secondario generato dalla moltiplicazione degli elettroni e D la dark current del PMT. Image Restoration Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR) Bkg Segnale S/N 801 1394 1.74 189 1318 6.97 Un rapporto segnale/rumore basso od insufficiente comporta una riduzione della risoluzione e del contrasto all’interno dell’immagine. Image Restoration Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR) Il valore SNR può essere migliorato agendo su : Tecniche di riduzione del rumore Aumentando l’intensità di illuminazione del campione Adeguata gestione del range dinamico Effettuando medie sulle immagini Tecniche di Image Restoration Utilizzando tempi di esposizione adeguati (CCD) Utilizzando le funzioni di binning (CCD) Image Restoration Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR) Filtri spaziali lineari e non Filtri in dominio di frequenza (FFT) I filtri operano trasformazioni (semplici o complesse) che modificano il contenuto informativo dei singoli pixel/voxel. I filtri lineari rimpiazzano il valore di ogni pixel con un valore ottenuto dalla valutazione dei pixel adiacenti (es. valore medio). Il filtro Gaussiano rappresenta il filtro lineare più utilizzato. Esso migliora l’immagine riducendo il rumore casuale senza modificare il contenuto informativo. I parametri operativi dei filtri sono spesso richiesti in unità reali (micrometri) -> PSF Image Restoration Deconvoluzione Image Restoration Image restoration e deconvoluzione Image Restoration insieme di procedure e funzioni atte al recupero di un segnale (immagine) nella sua forma originale. Deconvoluzione Funzione matematica complessa utilizzata per recuperare un segnale degradato da un processo fisico. Deblur Filtri spaziali lineari e non Filtri in domini di frequenza (FFT) Image Restoration Image restoration ed Image enhancement Le funzioni di Image enhancement enfatizzano le caratteristiche visive di una immagine allo scopo di renderla più piacevole e comprensibile all’osservatore senza introdurre migliorie dal punto quantitativo ma spesso alterandone (ed in qualche caso degradandone) il contenuto informativo. Le funzioni di Image restoration ricostruiscono, utilizzando un modello conosciuto a priori (teorico o misurato), le caratteristiche originali di una immagine allo scopo incrementarne la risoluzione, il contrasto ed il rapporto segnale / rumore. Image restoration non è una alternativa al confocale ma un complemento al suo impiego Image Restoration Deconvoluzione & Deblur Deconvoluzione Deblur Funzione matematica applicata nello spazio 3D Funzione matematica applicata nello spazio 2D. Effettua il riposizionamento della componente fuori fuoco all’interno dello stack Effettua la rimozione della componente fuori fuoco da ogni piano focale Il risultato mantiene il contenuto informativo inalterato (metodo quantitativo) Il risultato non assicura il mantenimento del contenuto informativo (metodo qualitativo) Image Restoration Algoritmi Deblur Deblur •Nearest Neighbor •Multi Neighbor •No Neighbor •Unsharp Mask Calcola il contributo del fuori fuoco sui piani Z +/- 1 (filtro digitale) e lo sottrae al piano Z Piano Z +1 Piano Z Piano Z -1 Migliora il contrasto dell’immagine ma riduce il valore di SNR e può introdurre artefatti. Il contributo del noise dei vari piani viene sommato La sottrazione del fuori fuoco riduce il livello del segnale Evidenzia eventuali artefatti presenti nei piani adiacenti Image Restoration Algoritmi di Deconvoluzione Filtro Inverso Calcola FFT dell’immagine e la divide per la FFT della funzione PSF. Conosciuto anche come: •Wenier Deconvolution Filter •Regulariez Least Squares •Tikhonov-Miller Deconvolution Filter Immagine 1 PSF Efficienza limitata dal contributo del rumore (amplificato dal processo) Introduce artefatti derivanti dai processi di diffrazione Necessità di regolazioni basate sulla conoscenza a priori delle strutture presenti nell’immagine. Risultato Image Restoration PSF (Point Spread Function) Come si calcola • Teoricamente – Utilizzando il modello matematico della diffrazione •Sperimentalmente – Misurandola sul sistema ottico/digitale • Derivandola - Estraendola direttamente dal campione Simmetrica in X,Y,Z – Non tiene conto delle aberrazioni specifiche del sistema Asimmetrica in X,Y,Z – contiene le aberrazioni specifiche del sistema Asimmetrica in X,Y,Z – contiene le aberrazioni specifiche del sistema e del campione Si tenga presente che: - La PSF Sperimentale fornisce la migliore rappresentazione del sistema ma richiede una certa esperienza per essere estratta (beads fluorescenti). - La PSF derivata (Blind ) può introdurre soluzioni indeterminate nel calcolo delle equazioni utilizzate per la deconvoluzione ma offre un approccio più facile per l’utente. - La PSF Teorica si basa su un modello generico del sistema ed è quindi la soluzione meno vicina alla realtà (ma pur sempre valida) Image Restoration PSF Sperimentale La PSF sperimentale si misura utilizzando speciali sfere (beads) fluorescenti di piccole dimensioni (175nm). Le sfere fluorescenti vengono campionate lungo gli assi X Y Z con distanze calcolate secondo il criterio di Shannon-Nyquist. La campionatura delle sfere deve avvenire nelle stesse condizioni nelle quali verrà ripreso il campione reale (Ex/Em Wavelenght, obiettivo, impostazioni sistema digitale, ect) . Image Restoration Algoritmi di Deconvoluzione Constrained Iterative algorithm Operano cicli di iterazione sull’immagine con l’applicazione di regole di vario genere (constrain) al fine di avvicinarsi il più possibile al risultato ideale. Immagine PSF Nuova Immagine Immagine stimata - Aggiornamento Errore Tipica regola consiste nel forzare tutti i valori calcolati come positivi. Immagine Image Restoration Algoritmi di Deconvoluzione Constrained Iterative algorithm Soluzione classica Criteri di modifica od adattamento aritmetico dell’errore (somma o moltiplicazione) LSM – Least Square Minimization method Soluzione statistica Criteri di calcolo probabilistico dell’errore MLE – Maximum likelihood estimation EM – Expectation maximization ME – maximum entropy Image Restoration Algoritmi di Deconvoluzione Blind algorithm Immagine iniziale deconvoluta con PSF teorica. Aggiornamento e stima degli errori con creazione di una nuova PSF. Ripetizione del ciclo fino al raggiungimento del minimo errore MLE – Maximum likelihood estimation Immagine Stimata Immagine PSF Stimata Aggiorna Immagine Aggiorna PSF Image Restoration I benefici Image Restoration Aumento della risoluzione Immagine reale deconvoluzione Image Restoration Aumento del rapporto segnale rumore Widefield PSF Teotica 3D Blind Background Segnale S/N Widefield 801 1394 1.74 PSF Teorica 750 1449 1.9 3D Blind 189 1318 6.97 Image Restoration Aumento del contrasto Widefield 3D Blind Image Restoration Mantenimento delle informazioni Gli algoritmi di deconvoluzione mantengono le informazioni di intensità integrata del volume. Il concetto di riposizionamento della luce sul piano di origine preserva i dati del campione e garantisce che il valore misurato sull’immagine elaborata sia lo stesso dell’immagine di partenza. ( la PSF ha un valore di intensità integrata pari a 1) Questo non vale per le informazioni contenute nel singolo piano. ≠ = Image Restoration Distorsione assiale Image Restoration Distorsione assiale Le beads fluorescenti utilizzate per la misura della PSF sono prodotte sotto rigidi controlli di qualità e possono essere considerate a tutti gli effetti delle sfere reali. Per quale ragione esse appaiono visualizzate in 3D come degli ovoidi? Beads fluorescenti (Widefield) Beads fluorescenti (deconvolute) PSF Image Restoration Distorsione assiale Le ragioni sono molteplici e dipendono dalle dimensioni delle strutture in osservazione 1. Piccoli oggetti (vicini al limite fisico di risoluzione) La risoluzione assiale (Z) di un microscopio ottico è normalmente dalle 3 alle 4 volte inferiore rispetto alla sua risoluzione laterale (XY). Si consideri che il più piccolo oggetto risolvibile lateralmente (XY) è di circa 80 nm mentre assialmente (Z) non si scende sotto i 200 nm. In presenza di oggetti con dimensioni prossime al limite risolutivo il difetto diventa evidente e non correggibile. 2. Grandi strutture (> 10um) In questa situazione l’allungamento è causato dal differenza tra gli indici di riflessione dei media (medium) in cui sono immersi i campioni ed il mezzo presente tra copri oggetto ed obiettivo. Anche l’aberrazione sferica introdotta dagli obiettivi con grande apertura numerica contribuisce all’allungamento delle strutture. Image Restoration Esempi Image Restoration PSF Image Restoration Esempi Image Restoration Esempi Image Restoration Alcuni lavori scientifici e testi interessanti La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D IMARIS Immagini & Computer Snc Via Don Carlo Riva 4 Bareggio (Mi) GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE !