Diapositiva 1 - www.immaginiecomputer.it

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CENTRO GRANDI STRUMENTI
Università degli Studi di Pavia
Image Restoration e
Deconvoluzione Quantitativa delle Immagini
17 Febbraio 2011
Immagini & Computer S.n.c.
Via Don Carlo Riva 4
20010 Bareggio (Mi)
Image Restoration
Quando?
 Quando serve una rappresentazione fedele all’originale.
 Quando vogliamo massimizzare la risoluzione, il contrasto ed il contenuto
informativo delle immagini.
 Quando vogliamo effettuare una analisi quantitativa dei nostri campioni.
 Quando ….
Image Restoration
La creazione dell’immagine digitale
Image Restoration
Il percorso ideale
Misura
Trattamento
dell’immagine
Raccolta delle immagini
Marcatura adeguata delle strutture
Preparazione del campione
Image Restoration
Principali sorgenti di errore
Sistema Ottico e di
acquisizione
Rumore
Campione
Causa una
variazione
(fluttuazione) del
segnale intorno al
suo valore reale.
Decadimento delle
caratteristiche del
segnale.
Spessore del
campione
Errata marcatura
Si aggiunge al
reale segnale e ne
compromette la
quantificazione.
Degrado delle
caratteristiche
dell’immagine
originale.
Alterazione del
contenuto
informativo
•Rumore segnale
(distribuzione di
Poisson)
•Rumore digitale
(distribuzione
Gaussiana)
•Photobleaching
•Quencing
• etc.
•Autofluorescenza.
•Luce estranea
•Disomogeneità di
illuminazione
•Acquisizione
•Diffrazione luce
•Aberrazioni
sferiche e
cromatiche
•Artefatti
•Fuori fuoco
Errata scelta
dei processi di
manipolazione
delle immagini
Background
Fattore Umano
Image Restoration
Risulta quindi basilare
1. Prendere consapevolezza dei punti critici insiti nel processo.
2. Studiare e definire i metodi di preparazione del campione più idonei
3. Studiare e definire i metodi ed i processi di acquisizione e trattamento delle immagini.
(Protocolli di acquisizione ed analisi).
4. Preservare il patrimonio informativo presente nell’immagine
Image Restoration
Gli ostacoli sul percorso
Image Restoration
Formazione delle immagini
Raccolta delle immagini
Ripristino delle caratteristiche
originali delle immagini.
Rimozione del rumore
Rilocazione della luce fuori
fuoco
Correzione degli artefatti
Decadimento (Photobleaching,ect)
Correzione disomogeneità fondo
Instabilità di illuminazione
Registrazione
Mosaicatura
Pubblicazione
Identificazione delle strutture
Segmentazione
Distinzione da altre strutture
Codifica dei confini e misura
Classificazione
Evoluzione e comportamento
delle strutture
Tracking
Cinetica
RatioImaging
Image Restoration
Formazione dell’immagine ottica – sorgenti di errore
Preparazione del campione
Sistema Ottico
Rumore
Causa una variazione
(fluttuazione) del segnale
intorno al suo valore reale.
Il segnale deve risultare
significativamente più
elevato del rumore.
•Rumore Poisson (campione)
•Rumore ottico
Background
Degrado delle caratteristiche
dell’immagine originale.
Introduzione di aberrazioni
ottiche e di fenomeni di
diffrazione.
•Funzione di diffusione luce
•Aberrazioni sferiche e cromatiche
•Fuori fuoco
•Artefatti
Si aggiunge al reale segnale
e ne compromette la
quantificazione.
Deve essere sottratto al
valore del segnale.
•Autofluorescenza..
•Luce estranea
Image Restoration
Come si forma una immagine ottica
Il piano di fuoco selezionato viene, attraverso il sistema ottico (obiettivo), proiettato su un piano focale
secondario (posteriore). Quello che noi osserviamo attraverso gli oculari non è il campione originale
ma la sua trasposizione ottica generata attraverso il processo di convoluzione.
Obiettivo
Lunghezza di camera  18 - 25 cm
Piano di
fuoco del
campione
Oculare
Piano di
Fuoco
Oculare

Piano di
Fuoco
posteriore
Piano di Fuoco
osservato
∞
Image Restoration
Come si forma una immagine ottica
Considerate il campione come un insieme di infiniti punti di emissione luminosa con dimensioni
inferiori al limite di risoluzione ottica
Quando la luce che arriva dai vari punti che compongono il campione attraversa
il sistema ottico (obiettivo) essi appaiono come piccoli pattern e non come punti
(Airy pattern) nell’immagine ricostruita .
La parte centrale del pattern è conosciuta come Airy Disk e contiene > 80%
dell’intensità totale del punto.
Image Restoration
Formazione dell’immagine ottica
Piano di Fuoco posteriore
Tutta la luce presente nelle strutture
comprese entro la DoF viene proiettata
sul piano do fuoco posteriore
Ottica
Campione
Piano Focale
Profondità di campo (DoF)
Image Restoration
Diffusione della luce
A causa della profondità di campo dell’obiettivo utilizzato, la luce proveniente dai piani di fuoco
adiacenti a quello principale fornisce il proprio contributo nella formazione dell’immagine.
La profondità di campo identifica la porzione (o spessore) del
campione i cui estremi rimangono simultaneamente a fuoco
all’interno della stessa immagine.
La profondità di campo è funzione principalmente della apertura
numerica della lente e della lunghezza d’onda di emissione della luce
utilizzata.
Image Restoration
Diffusione della luce
Il processo fisico che rappresenta il modello di diffusione della luce è descritto dalla funzione che
prende il nome di PSF (Point Spread Function)
Campione
PSF
Proiezione ottica
La Point Spread Function (PSF) rappresenta “il mattone” sul quale l’immagine viene costruita.
Image Restoration
Processo di costruzione dell’immagine ottica
G(x)
F(x)
G = Proiezione ottica
F = Immagine Ideale
H = Point Spread Function
N = Rumore (quantico ed elettronico)
H(x)
N(x)
Image Restoration
Aberrazione Sferica
L’aberrazione sferica rappresenta una distorsione ottica generata dalla differente posizione di
focalizzazione dei raggi oblicui (periferici) rispetto ai raggi centrali che attraversano la lente.
L’aberrazione sferica è generata da una imperfezione del percorso ottico.
La causa può essere identificata sia nella qualità costruttiva dell’obiettivo, sia nelle differenze
esistenti tra gli indici di riflessione dei media utilizzati per interfacciare gli obiettivi (aria, olio,
acqua, ect) e quelli dei media utilizzati per fissare il campione.
Lo spessore del campione stesso può contribuire alla sua generazione.
Image Restoration
Aberrazione Sferica
L’aberrazione sferica introduce asimmetria nella distribuzione della luce, aggiunge componenti fuori
fuoco e riduce il livello del segnale.
Image Restoration
Disallineamento cromatico
Errore sistematico caratteristico dei sistemi ottici
(obiettivi).
La luce monocromatica viene focalizzata su piani
diversi in funzione della sua lunghezza d’onda.
Errore più consistente lungo asse Z.
Risente delle condizioni meccaniche ed ambientali
(temperatura)
Utilizzo di obiettivi corretti cromaticamente.
Misura sperimentale del disallineamento
attraverso sfere fluorescenti.
Correzione con ricalcolo dello stack
Image Restoration
La raccolta delle immagini
Image Restoration
La raccolta delle immagini richiede una serie di accorgimenti quali :
 Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z
 Adeguata considerazione della dinamica del segnale (rappresentazione dell’evento)
 Corretta definizione dei parametri operativi (potenza del laser, esposizione della
telecamera, impostazione PMT, livello di illuminazione del campione)
 Qualità della ripresa
 Corretta (e strutturata) memorizzazione delle immagini
Standardizzazione del processo
[Protocollo di acquisizione]
Image Restoration
Dinamica del segnale
Il range dinamico descrive l’escursione relativa della
intensità del segnale (fluorescente) in osservazione
Espresso come “Flusso di Fotoni “(fotoni / unità di sup. / Sec.)
La dinamica dell’immagine digitale è determinata dalle
caratteristiche del dispositivo di acquisizione utilizzato. (PMT o
CCD)
Essa rappresenta il numero di valori discreti che compongono la
scala numerica utilizzata per descrivere il segnale analogico nella
sua forma digitale (Livelli di Grigio).
Continuo
Discreto
Image Restoration
Dinamica del segnale
La scala numerica (scala dei grigi) ha dimensioni standardizzate
(256 GL, 4096 GL, 16384 GL, 65356 GL)
Per i sensori CCD la scala numerica è determinata dal rapporto
tra la capacità di immagazzinamento dei fotoni (FWC) propria
delle singole celle ed il contributo dei rumori intrinseci da esso
generati. (Read Noise, Termal noise, ect)
Consideriamo un CCD con FWC pari a 40.000 e con un Noise di 12 e .
Il relativo RDD risulta :
GrayLevels = 40.000 / 12 = 3.333 -> [12 bit (4.096 GrayLevels)]
L’efficienza di conversione definisce il numero di fotoni descritto
dal singolo livello di grigio.
EC = FWC / GL (- Offset)
EC = 40.000 / 4096 = 9.7656 f
FWC inversamente
proporzionale alle dimensioni
della singola cella CCD.
Analisi quantitativa delle immagini
Dinamica del segnale
Ottimizziamo la dinamica digitale dell’immagine durante l’acquisizione
Segnale sovraesposto
Bilanciando adeguatamente
guadagno PMT e potenza del
laser
80 %o
Utilizzando tempi di
esposizione adeguati (CCD)
20 %o
Segnale sottoesposto
Isolare le zone sovraesposte
Aumentando l’intensità di
illuminazione del campione
Utilizzando le funzioni di
binning (CCD)
Image Restoration
Il Campionamento
La densità di campionamento stabilisce il numero di unità digitali di base (pixel o voxel)
chedevono essere acquisite per unità di superfice / volume.
In pratica definisce le dimensioni ideali del pixel / voxel nelle specifiche condizioni
operative allo scopo di salvaguardare il contenuto informativo del campione.
Z
Y
X
Image Restoration
Il Campionamento
La dimensione ideale del pixel / voxel, al di fuori del quale il processo di acquisizione può
produrre artefatti, viene calcolata secondo il teorema di Nyquist-Shannon.
“La frequenza di campionamento di un segnale (Analogico ->Digitale) deve risultare più
grande del doppio della bandapassante del segnale originale in modo da garantirne la
perfetta ricostruzione digitale.”
Voxel
Struttura
La massima dimensione del pixel / voxel deve risultare inferiore alla metà del più piccolo
oggetto o struttura presente nell’immagine.
Image Restoration
La dimensione del più piccolo oggetto o struttura presente nell’immagine è equivalente al
limite risolutivo del sistema ottico (e digitale) in uso.
Calcolo Z secondo Nyquist
Δz = λem / (2 N (1- cos α))
Λem = emission wavelenght
N = medium index
α = ½ angolo apertura obiettivo
Calcolo XY secondo Nyquist
Δxy = λem / (4 N sen α)
In pratica
Λem = 520nm
N = 1.515
NA = 1.3
α = αrcsen(NA/N)
Δz = 520 /(2*1.515*(1-cos α))
Δz = 353 nm
Calcolatore Nyquist
Un densità di campionamento inferiore al valore calcolato non è accettabile.
Un minimo sovracampionamento non influisce sulla qualità delle informazioni.
Un eccessivo sovracampionamento è inutile e spesso deleterio.
Image Restoration
Il Campionamento
Spessore lettura in Z
Spessore campione
Campionare lungo asse Z aumentando lo spessore reale del campione di circa il 40/50% per lato
(esempio : spessore campione 10um – campionare 20um totali).
Image Restoration
Archiviazione delle immagini
I danni introdotti dai sistemi di compressione ad alta efficienza (Jpeg, Jpeg2000, ect) non sono
immediatamente percettibili. Essi si manifestano sotto forma di “pixellatura” artificiale
dell’immagine.
Image Restoration
Archiviazione delle immagini
I singoli pixel subiscono una modifica in termini di contenuto cromatico e/o di
intensità/densità. Tale variazione può introdurre un errore di valutazione importante
(5% - 10%) direttamente rapportato al coefficiente di compressione utilizzato.
TIFF
JPEG
Differenza
assoluta
Image Restoration
Risoluzione
Analisi quantitativa delle immagini
Le molteplici risoluzioni di un sistema
A. Risoluzione Ottica : limite di discriminazione tra due oggetti adiacenti. Determinato
dalla apertura numerica dell’obiettivo e dalla lunghezza d’onda di emissione della luce.
B. Risoluzione spaziale : limite di discriminazione del sensore CCD. Determinato dalle
dimensioni della singola cella del sensore e dall’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato.
C. Risoluzione Immagine : caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero
di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine.
Analisi quantitativa delle immagini
La risoluzione Ottica.
La risoluzione ottica del microscopio è funzione della :
• lunghezza d’onda della luce utilizzata.
• apertura numerica (N.A.) dell’obiettivo.
La risoluzione ottica del microscopio NON dipende
dall’ ingrandimento dell’obiettivo.
La seguente formula, conosciuta come criterio di Rayleigh, calcola il limite
di risoluzione assoluto .
R laterale = 0,61 λem/ N.A. (N.A.= n sen a )
R assiale = 2 λem * n / N.A. 2
Profondità di campo = R assiale/2 = λem * n / N.A. 2
Si consideri che:
• Maggiore e’ l’angolo (N.A.) con cui l’obiettivo è in grado di
raccogliere la luce maggiore è il potere di risoluzione
•Maggiore è N.A. minore è la distanza di lavoro
•Per obiettivi in aria a è sempre minore di 90°
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione spaziale & Risoluzione discriminante
La risoluzione spaziale
rappresenta la dimensione,
espressa in unità metriche, del più
piccolo oggetto, proiettato sul
piano di fuoco, identificabile come
tale dal sistema di acquisizione.
La risoluzione discriminante rappresenta
la distanza minima, espressa in unità
metriche, che deve intercorrere tra due
oggetti proiettati sul piano di fuoco, e ben
contrastati tra loro, per poter essere
identificati come tali dal sistema di
acquisizione.
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione spaziale
In presenza di un dispositivo CCD, la risoluzione spaziale risulta
funzione delle dimensioni della singola cella del sensore (pixel
size) e del’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato secondo la
formula:Rs= (Pixel size / Ingrandimento obiettivo)
In presenza di un dispositivo PMT confocale, la risoluzione
spaziale risulta funzione delle dimensioni Pin Hole
utilizzato (Airy unit), dal fattore di ingrandimento (zoom) e
dal numero di pixels utilizzati per la matrice di
acquisizione.
L’impostazione di questi parametri è strettamente
dipendenti dai valori di densità di campionamento calcolati
utilizzando la formula di Nyquist.
4.6 um
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione discriminante
A causa delle caratteristiche fisiche del sensore CCD, due oggetti devono distare almeno di un pixel tra
loro per poter essere discriminati come tali.
Rd = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3)
Esempio : Pixel size = 6.4 um, Ingrandimento = 100x
Risoluzione spaziale = (6.4 / 100) = 0.064 um ->(Pixel size / Ingrandimento)
Risoluzione Discriminante = ((6.4 / 100) * 2.3) = 0.147 um ->(Pixel size / Ingrandimento) * 2.3
Analisi quantitativa delle immagini
Risoluzione Immagine
Caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che
formano l’immagine.
Da non confondere con i DPI.
1024 x 768 pixel
2048 x 1536 pixel
Image Restoration
Artefatti & affini
Image Restoration
Principali sorgenti di errore
Artefatti
Sistema Ottico e di
acquisizione
Rumore
Campione
Causa una
variazione
(fluttuazione) del
segnale intorno al
suo valore reale.
Decadimento delle
caratteristiche del
segnale.
Spessore del
campione
Errata marcatura
Si aggiunge al
reale segnale e ne
compromette la
quantificazione.
Degrado delle
caratteristiche
dell’immagine
originale.
Alterazione del
contenuto
informativo
•Rumore segnale
(distribuzione di
Poisson)
•Rumore digitale
(distribuzione
Gaussiana)
•Photobleaching
•Quencing
• etc.
•Autofluorescenza.
•Fuori fuoco.
•Luce estranea
•Disomogeneità di
illuminazione
•Acquisizione
•Valutazione PSF
•Aberrazioni
sferiche e
cromatiche
•Disallineamento
•Artefatti
Errata scelta
dei processi di
manipolazione
delle immagini
SNR
Rapporto segnale
rumore
Background
Fattore Umano
Errori sistematici
Errori casuali
Image Restoration
Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR)
Rappresenta il rapporto tra i disturbi presente nell’immagine e l’effettivo segnale.
Image Restoration
In un sistema di acquisizione basato su telecamera CCD
il Rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come:
SNR = PQet / [PQet + Dt + Nr2] 1/2
Dove P rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Qe l’efficienza quantica del sensore, t il
tempo di integrazione (Secondi), D la Dark Noise (Elettroni/pixel/Secondo) e Nr il Read Out Noise.
Il segnale proveniente dal Background (Scatter o Riflessione) influisce sulla qualità del valore di SNR e
deve di conseguenza essere tenuto in considerazione nel calcolo.
SNR = PQet / [(P+B)Qet + Dt + Nr2] 1/2
In un sistema confocale il rapporto Segnale / Rumore (SNR) è calcolato come:
Dove N rappresenta il flusso di Fotoni (Fotoni/pixel/Secondo), Q il noise generato dal laser, S il Noise
secondario generato dalla moltiplicazione degli elettroni e D la dark current del PMT.
Image Restoration
Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR)
Bkg
Segnale
S/N
801
1394
1.74
189
1318
6.97
Un rapporto segnale/rumore basso od insufficiente comporta una riduzione della risoluzione e del
contrasto all’interno dell’immagine.
Image Restoration
Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR)
Il valore SNR può essere migliorato agendo su :
Tecniche di riduzione del
rumore
Aumentando l’intensità di
illuminazione del campione
Adeguata gestione del range
dinamico
Effettuando medie sulle
immagini
Tecniche di Image
Restoration
Utilizzando tempi di
esposizione adeguati (CCD)
Utilizzando le funzioni di
binning (CCD)
Image Restoration
Il Rapporto Segnale/Rumore (SNR)
Filtri spaziali lineari e non
Filtri in dominio di frequenza (FFT)
I filtri operano trasformazioni (semplici o
complesse) che modificano il contenuto
informativo dei singoli pixel/voxel.
I filtri lineari rimpiazzano il valore di ogni
pixel con un valore ottenuto dalla
valutazione dei pixel adiacenti (es. valore
medio).
Il filtro Gaussiano rappresenta il filtro
lineare più utilizzato.
Esso migliora l’immagine riducendo il
rumore casuale senza modificare il
contenuto informativo.
I parametri operativi dei filtri sono spesso
richiesti in unità reali (micrometri) -> PSF
Image Restoration
Deconvoluzione
Image Restoration
Image restoration e deconvoluzione
Image Restoration
insieme di procedure e funzioni atte al recupero di un
segnale (immagine) nella sua forma originale.
Deconvoluzione
Funzione matematica complessa utilizzata per
recuperare un segnale degradato da un processo
fisico.
Deblur
Filtri spaziali lineari e non
Filtri in domini di frequenza (FFT)
Image Restoration
Image restoration ed Image enhancement
Le funzioni di Image enhancement enfatizzano le caratteristiche visive di una immagine
allo scopo di renderla più piacevole e comprensibile all’osservatore senza introdurre
migliorie dal punto quantitativo ma spesso alterandone (ed in qualche caso
degradandone) il contenuto informativo.
Le funzioni di Image restoration ricostruiscono, utilizzando un modello conosciuto a
priori (teorico o misurato), le caratteristiche originali di una immagine allo scopo
incrementarne la risoluzione, il contrasto ed il rapporto segnale / rumore.
Image restoration non è una alternativa al confocale ma un complemento al suo impiego
Image Restoration
Deconvoluzione & Deblur
Deconvoluzione
Deblur
Funzione matematica applicata nello spazio 3D
Funzione matematica applicata nello spazio 2D.
Effettua il riposizionamento della componente
fuori fuoco all’interno dello stack
Effettua la rimozione della componente fuori
fuoco da ogni piano focale
Il risultato mantiene il contenuto informativo
inalterato (metodo quantitativo)
Il risultato non assicura il mantenimento del
contenuto informativo (metodo qualitativo)
Image Restoration
Algoritmi Deblur
Deblur
•Nearest Neighbor
•Multi Neighbor
•No Neighbor
•Unsharp Mask
Calcola il contributo del fuori
fuoco sui piani Z +/- 1 (filtro
digitale) e lo sottrae al piano Z
Piano Z +1
Piano Z
Piano Z -1
Migliora il contrasto dell’immagine ma riduce il valore di
SNR e può introdurre artefatti.
Il contributo del noise dei vari piani viene sommato
La sottrazione del fuori fuoco riduce il livello del segnale
Evidenzia eventuali artefatti presenti nei piani adiacenti
Image Restoration
Algoritmi di Deconvoluzione
Filtro Inverso
Calcola FFT dell’immagine e la
divide per la FFT della funzione
PSF.
Conosciuto anche come:
•Wenier Deconvolution Filter
•Regulariez Least Squares
•Tikhonov-Miller Deconvolution Filter
Immagine
1
PSF
Efficienza limitata dal contributo del rumore (amplificato dal processo)
Introduce artefatti derivanti dai processi di diffrazione
Necessità di regolazioni basate sulla conoscenza a priori delle strutture presenti nell’immagine.
Risultato
Image Restoration
PSF (Point Spread Function)
Come si calcola
• Teoricamente – Utilizzando il modello
matematico della diffrazione
•Sperimentalmente – Misurandola sul sistema
ottico/digitale
• Derivandola - Estraendola direttamente dal
campione
Simmetrica in X,Y,Z – Non tiene conto delle
aberrazioni specifiche del sistema
Asimmetrica in X,Y,Z – contiene le
aberrazioni specifiche del sistema
Asimmetrica in X,Y,Z – contiene le
aberrazioni specifiche del sistema e del
campione
Si tenga presente che:
- La PSF Sperimentale fornisce la migliore rappresentazione del sistema ma richiede
una certa esperienza per essere estratta (beads fluorescenti).
- La PSF derivata (Blind ) può introdurre soluzioni indeterminate nel calcolo delle equazioni
utilizzate per la deconvoluzione ma offre un approccio più facile per l’utente.
- La PSF Teorica si basa su un modello generico del sistema ed è quindi la soluzione
meno vicina alla realtà (ma pur sempre valida)
Image Restoration
PSF Sperimentale
La PSF sperimentale si misura utilizzando
speciali sfere (beads) fluorescenti di piccole
dimensioni (175nm).
Le sfere fluorescenti vengono campionate lungo
gli assi X Y Z con distanze calcolate secondo il
criterio di Shannon-Nyquist.
La campionatura delle sfere deve avvenire nelle
stesse condizioni nelle quali verrà ripreso il
campione reale (Ex/Em Wavelenght, obiettivo,
impostazioni sistema digitale, ect) .
Image Restoration
Algoritmi di Deconvoluzione
Constrained Iterative algorithm
Operano cicli di iterazione sull’immagine con l’applicazione di regole di vario genere (constrain) al fine di avvicinarsi il
più possibile al risultato ideale.
Immagine
PSF
Nuova
Immagine
Immagine stimata
-
Aggiornamento
Errore
Tipica regola consiste nel forzare tutti i valori calcolati come positivi.
Immagine
Image Restoration
Algoritmi di Deconvoluzione
Constrained Iterative algorithm
Soluzione classica
Criteri di modifica od adattamento aritmetico
dell’errore (somma o moltiplicazione)
LSM – Least Square Minimization method
Soluzione statistica
Criteri di calcolo probabilistico dell’errore
MLE – Maximum likelihood estimation
EM – Expectation maximization
ME – maximum entropy
Image Restoration
Algoritmi di Deconvoluzione
Blind algorithm
Immagine iniziale deconvoluta con PSF teorica.
Aggiornamento e stima degli errori con creazione di
una nuova PSF.
Ripetizione del ciclo fino al raggiungimento del
minimo errore
MLE – Maximum likelihood estimation
Immagine
Stimata
Immagine
PSF
Stimata
Aggiorna
Immagine
Aggiorna
PSF
Image Restoration
I benefici
Image Restoration
Aumento della risoluzione
Immagine reale
deconvoluzione
Image Restoration
Aumento del rapporto segnale rumore
Widefield
PSF Teotica
3D Blind
Background
Segnale
S/N
Widefield
801
1394
1.74
PSF Teorica
750
1449
1.9
3D Blind
189
1318
6.97
Image Restoration
Aumento del contrasto
Widefield
3D Blind
Image Restoration
Mantenimento delle informazioni
Gli algoritmi di deconvoluzione mantengono le informazioni di intensità integrata del volume. Il
concetto di riposizionamento della luce sul piano di origine preserva i dati del campione e garantisce
che il valore misurato sull’immagine elaborata sia lo stesso dell’immagine di partenza.
( la PSF ha un valore di intensità integrata pari a 1)
Questo non vale per le informazioni
contenute nel singolo piano.
≠
=
Image Restoration
Distorsione assiale
Image Restoration
Distorsione assiale
Le beads fluorescenti utilizzate per la misura della PSF sono prodotte sotto rigidi controlli di qualità e
possono essere considerate a tutti gli effetti delle sfere reali.
Per quale ragione esse appaiono visualizzate in 3D come degli ovoidi?
Beads fluorescenti (Widefield)
Beads fluorescenti (deconvolute)
PSF
Image Restoration
Distorsione assiale
Le ragioni sono molteplici e dipendono dalle dimensioni delle strutture in osservazione
1. Piccoli oggetti (vicini al limite fisico di risoluzione)
La risoluzione assiale (Z) di un microscopio ottico è normalmente dalle 3 alle 4 volte inferiore
rispetto alla sua risoluzione laterale (XY). Si consideri che il più piccolo oggetto risolvibile
lateralmente (XY) è di circa 80 nm mentre assialmente (Z) non si scende sotto i 200 nm.
In presenza di oggetti con dimensioni prossime al limite risolutivo il difetto diventa evidente e
non correggibile.
2. Grandi strutture (> 10um)
In questa situazione l’allungamento è causato dal differenza tra gli indici di riflessione dei media
(medium) in cui sono immersi i campioni ed il mezzo presente tra copri oggetto ed obiettivo.
Anche l’aberrazione sferica introdotta dagli obiettivi con grande apertura numerica contribuisce
all’allungamento delle strutture.
Image Restoration
Esempi
Image Restoration
PSF
Image Restoration
Esempi
Image Restoration
Esempi
Image Restoration
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La piattaforma di visualizzazione ed analisi 3D/4D IMARIS
Immagini & Computer Snc
Via Don Carlo Riva 4
Bareggio (Mi)
GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE !
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