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“DAGLI ESORDI DELLA MEDICINA MOLECOLARE ALL’EVOLUZIONE DELL’AUTOMAZIONE”
Dott.ssa Maria Antonietta Lozzi
Dipartimento di sanità Pubblica e Malattie Infettive
Sapienza Università di Roma
• La scoperta che il DNA è alla base di tutte le funzioni
della cellula ha aperto la strada allo sviluppo di una
disciplina denominata biologia molecolare
• Lo sviluppo delle metodologie e delle tecniche per
isolare, analizzare, manipolare e utilizzare gli acidi
nucleici ha determinato lo sviluppo di interessanti settori come le
biotecnologie, le mappature dei genomi, la medicina molecolare e la
terapia genica.
• Molte tecniche utilizzate in biologia molecolare
imitano le funzioni naturali degli acidi nucleici
Alla fine degli anni ‘70 e all’inizio degli anni ’80 le
tecnologie di clonaggio, sequenza di acidi nucleici e
di identificazione di sequenze specifiche del DNA
o di RNA erano appannaggio esclusivo di alcuni
laboratori attrezzati e impegnati esclusivamente
in progetti di ricerca.
Le tecniche, all’epoca, non erano standardizzate,
presentavano grande variabilità a seconda dei
laboratori con ovviamente risultati difformi.
Inoltre l’esecuzione richiedeva apparecchiature
sofisticate e competenze non sempre disponibili
nei laboratori di diagnostica
Le tecnologie allora disponibili erano le tecniche di ibridazione degli acidi
nucleici attraverso le quali si poteva determinare la presenza e la quantità
di acido nucleico, utilizzando una sequenza specifica (sonda) corrispondente
al DNA bersaglio nel campione biologico analizzato
La prima di queste tecniche, il Southern blot fu sviluppata da Edwin
Southern nel 1975.
La tecnica prevede, prima dell’ibridazione, la digestione del DNA
bersaglio mediante il taglio con enzimi di restrizione, separazione dei
frammenti di DNA attraverso una corsa elettroforetica su gel di
agarosio, trasferimento su membrana di nylon o nitrocellulosa che
costituisce il supporto per l’ibridazione, utilizzo quindi di una sonda
marcata.
Il metodo è diventato molto importante dopo lo sviluppo del clonaggio
molecolare, che ha reso possibile l’uso di una miriade di sonde specifiche
per i geni.
Il Northern blot variante del Southern inventata nel 1977 da alcuni
scienziati dell’Università di Stanford.
Il bersaglio è l’RNA, che viene separato tramite elettroforesi su
gel di agarosio in condizioni denaturanti
……nel corso degli anni
1952
Rosalind Franklin usa la diffrazione di raggi X per studiare la
struttura del DNA e suggerisce che la struttura portante è formata
da zuccheri e fosfati ed è situata all'esterno della molecola
1953
Dopo aver esaminato i risultati, non
pubblicati, di Rosalind Franklin, James
Watson e Francis Crick propongono la
struttura a doppia elica per il DNA
Nascita della
biologia molecolare
1955
Severo Ochoa scopre RNA polimerasi
Arthur Kornberg scopre DNA polimerasi
1960
Arthur Kornberg sintetizza DNA in vitro, dimostrando che un
enzima DNA polimerasi produce nuovi segmenti di DNA
utilizzando precursori, un fonte di energia e un "template" di DNA
1970
scoperta degli enzimi di restrizione
→ diventa possibile tagliare il DNA in siti specifici e riunire molecole di
DNA di diversa origine
elettroforesi su gel
→ diventa possibile separare DNA,RNA e proteine sfruttando un campo
elettrico
1975
•Edwin Southern inventa la tecnica del Southern blot
1977
•James Alwine, David Kemp e George Stark dell’Università di Stanford inventano
la tecnica del Northern blot
•Maxam e Gilbert introducono il sequenziamento con metodo chimico
Il DNA è tagliato chimicamente in corrispondenza di basi specifiche: i
prodotti di taglio sono analizzati su gel elettroforesi
•Sanger: introduce il sequenziamento con metodo a terminazione di catena
Il Dna da sequenziare è replicato a partire da un primer innesco con una
polimerasi; il filamento neosintetizzato è radiomarcato e la reazione è interrotta
per incorporazione di dideossi-nucleotidi.
Il metodo di Sanger è rimasto alla base dei protocolli di sequenziamento
automatico
1983
Kary Mullis inventa la reazione a catena della polimerasi(PCR)
La tecnologia ideata da Kary Mullis e sviluppata da un gruppo di scienziati
della Cetus Corporation, è stata pubblicata per la prima volta nel 1985 e
largamente utilizzata poi come uno degli strumenti più potenti della biologia
molecolare.
1985
Primo impiego dell’impronta genetica (fingerprinting) in una investigazione
criminale
1990
Lancio ufficiale del Progetto internazionale genoma umano (tempo previsto
15 anni)
2000
Pronta una bozza del genoma
2003
Annuncio completamento del genoma (2 anni prima del previsto!)
Cinquantesimo anniversario della scoperta della doppia elica da parte di
Watson e Crick
“Sometimes a good idea
comes to you when you are
not looking for it”
Kary B. Mullis
La PCR (Polymerase Chain Reaction) nasce da un’idea di Kary B.
Mullis in una notte di Aprile del 1983, mentre è alla guida della
sua auto
“Cominciando da una singola molecola di DNA, mediante una
reazione a catena, si possono generare 100 bilioni di molecole
simili in un solo pomeriggio.
La reazione è facile : non richiede altro che una provetta, pochi
semplici reagenti e una sorgente di calore”.
Dalla sua introduzione, nel 1985, la tecnologia PCR ha modificato il modo in cui
l’analisi del DNA viene condotta nei laboratori sia di ricerca che di diagnostica.
Per questa scoperta
rivoluzionaria, il Dr. Mullis ha ricevuto, nel
1993, il premio Nobel per la Chimica.
L’introduzione quindi di sistemi basati sulla rivelazione diretta di sequenze
genomiche specifiche in un campione biologico nasce dall’esigenza di avere a
disposizione,nel laboratorio diagnostico metodologie con un’elevata soglia di
sensibilità e specificità.
Sorprendentemente la PCR è in grado di soddisfare le più diverse necessità
analitiche.
APPLICAZIONI DELLA PCR
• Diagnostica clinica
ricerca di uno specifico virus o batterio
• Oncologia
diagnosi e prevenzione dei tumori
• Agricoltura
identificazione OGM
• Ricerche sul genoma
• Studio delle malattie ereditarie
• Medicina legale
• Archeologia
La reazione a catena della polimerasi (PCR) si basa sul principio
naturale della replicazione del DNA:
all’interno della cellula, i due filamenti di una doppia elica si svolgono e si separano
per permettere la sintesi di nuove catene. Ogni filamento originario agisce
da stampo per la formazione di un nuovo filamento complementare. In questo
modo, la replicazione del DNA è semiconservativa ed ogni molecola figlia riceve
un filamento dalla molecola madre
PER UNA REAZIONE DI PCR SONO NECESSARI:
 Una piccola quantità di DNA stampo ( Target )
 Due oligonucleotidi sintetici specifici ( Primers )
 Un enzima ( Taq Polimerasi )
 Una idonea concentrazione di Sali (MgCl2)
 Una miscela di nucleotidi
 Soluzione tampone
La PCR si può definire come :
una reazione di amplificazione in
vitro di un segmento specifico di
DNA,sequenza “Target”,
per mezzo di una DNA polimerasi.
Come il processo di replicazione naturale, il processo PCR
crea copie multiple della sequenza scelta:
Un ciclo PCR è composto dalle seguenti fasi:
1. Denaturazione
2. Ibridazione
3. Estensione
Questo processo ha luogo nel thermal
cycler, uno strumento che controlla
ed alterna in modo automatico le
temperature, per periodi di tempo
programmati e per il
numero di cicli di PCR adeguati (20-40)
PCR FASE PER FASE
PCR Fase 1: Denaturazione termica (94°C)
5’
PCR Fase 2: Ibridazione del primer
al bersaglio (annealing 55-65°C)
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
PCR Fase 3: Estensione (72°C)
5’
3’
5’
3’
5’
Formazione di DUE nuove catene e
ripetizione del ciclo
No. cicli
No. Ampliconi
copie del target
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
Cinetica della PCR: 3 fasi
Esponenziale
Dopo ogni ciclo si verifica un
raddoppiamento del prodotto
accumulato.
La reazione è molto specifica e
precisa
Lineare
Continua la crescita
esponenziale della reazione
espressa come una fase
logaritmica lineare.
Plateau (punto finale)
La reazione si arresta e non da
più luogo a prodotti di
reazione.
La rilevazione degli ampliconi
in questa fase è definita
rilevazione al punto finale.
Tecnica end-point
VANTAGGI DELLA PCR
1)
2)
3)
4)
Velocità
In poche ore si possono ottenere milioni di copie della sequenza di
DNA target
Sensibilità
Capacità di amplificare copie singole della sequenza bersaglio
Robustezza
Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di bassa qualità
Specificità
La selezione di primers idonei aumenta la specificità della reazione
SVANTAGGI-PROBLEMATICHE
Contaminazione
L’estrema sensibilità della PCR, in grado di generare una quantità enorme
di copie di DNA, a partire da una sequenza bersaglio, rappresenta il maggior
problema per la sua applicazione, soprattutto a fini diagnostici
Il saggio è pericolosamente sensibile alla presenza nell’ambiente,
sugli strumenti o sull’operatore stesso, di molecole di DNA
proveniente da amplificazioni precedenti.
CARRY-OVER!!!
Una fonte di contaminazione crociata può avvenire quando si
prepara un campione positivo che contamina un campione negativo
Un terzo tipo di contaminazione, che dà falsi positivi, si può
verificare durante la rilevazione
PRECAUZIONI
Il rischio di contaminazione è ridotto al minimo attraverso accorte
procedure di laboratorio
•Ambienti separati: preparazione campione, preparazione reagenti,
rivelazione prodotto
•Vetreria sterilizzata, materiale usa e getta
•Pulizia superfici lavoro e apparecchiature (Ipoclorito ed etanolo 70%)
•Utilizzo reagenti pre-aliquotati
•Uso di pipette distinte nelle varie aree di lavoro
•Uso di puntali con filtro
•Uso di controlli sia positivi che negativi per verifica dei reagenti ed
esecuzione corretta della procedura
• Controlli di estrazione e di amplificazione
La tecnica di PCR è stata la prima tecnica di
amplificazione di DNA riportata in letteratura e quella
più ampliamente sviluppata e applicata attualmente.
Dopo l’introduzione della PCR si sono sviluppati altri
metodi alternativi o complementari
METODI DI AMPLIFICAZIONE DEL “TARGET”
METODI DI AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE
ANNI ‘90
…ALTRE TECNICHE SVILUPPATE SULLA SCIA DELLA PCR
PCR NESTED
Amplificazione del
target
E’ una variante della tecnica di PCR end-point.
Prevede due distinte e successive reazioni di amplificazione:
1) Nella prima amplificazione si utilizzano primers più esterni al frammento di
DNA da amplificare
2) Nella seconda amplificazione si utilizzano primers che amplificano un
frammento interno a quello amplificato nella I reazione.
Miglioramento della sensibilità.
Se il prodotto di amplificazione fosse aspecifico la seconda PCR non
andrebbe a buon fine.
Questa tecnica, però, trova sempre minore applicazione in ragione degli
alti rischi di contaminazione.
REVERSE TRANSCRIPTASE PCR ( RT-PCR)
Amplificazione del
target
Tecnica di amplificazione genica sviluppata per amplificare l’RNA target.
L’RNA target viene inizialmente convertito in cDNA ad opera
di un enzima, la Trascrittasi Inversa.
E’ una DNA polimerasi RNA dipendente, inizialmente
identificata nei retrovirus.
Non è termoresistente ( è attiva 37-42°C).
Recentemente sono state isolate e clonate delle RT mutanti che
resistono a temperatura fino a 60°C per aumentare specificità.
Il prodotto della reazione è un prodotto ibrido RNA/DNA.
Dopo allontanamento dell’RNA, il cDNA può essere utilizzato
come templato per l’amplificazione enzimatica (PCR)
MULTIPLEX PCR
Amplificazione del
target
Reazione di amplificazione in cui una o più coppie di “primers”
specifici per differenti “target”, vengono introdotte nello stesso
tubo di reazione, permettendo l’amplificazione di molteplici
sequenze.
LIGASE CHAIN REACTION (LCR)
Tecnica di amplificazione genica simile alla PCR ma che utilizza
due coppie di primers e due enzimi:DNA polimerasi, DNA ligasi.
I primers sono complementari ai due filamenti della sequenza
target.
Dopo l’ibridazione dei primers, la ligasi unisce i due primers
adiacenti.
Tecnica che offre una elevata specificità.
Amplificazione del
TMA (Transcription-Mediated Amplification)
target
Utilizza due “primers” e due enzimi:
• T7RNA polimerasi che sintetizza RNA dal DNA
• Trascrittasi inversa che converte l’RNA in cDNA e ha attività RNAasica
Amplificazione isotermica a 41,5°C estremamente veloce in grado di
produrre in 15-30 minuti una quantità di amplificato che, con la PCR
convenzionale, non può essere ottenuta prima di 3-4 ore.
NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)
Utilizza due “primers” e tre enzimi:
• T7RNA polimerasi che sintetizza RNA dal DNA
• Trascrittasi inversa che converte l’RNA in cDNA e ha attività Rnasica
• RNAasi H
Minimizzata
Amplificazione isotermica a 41,5°C
contaminazione da
carry over
Il principale vantaggio di questi due sistemi è che tutte le reazioni
avvengono in un’unica provetta. Solo alla fine del processo l’operatore ha
modo di rivelare gli amplificati formatisi.
La rivelazione finale in chemiluminescenza dei due metodi è un concetto
innovativo, mentre i passaggi che portano alla formazione degli ampliconi di
RNA appartengono alle metodiche molecolari classiche.
Tecniche che possono essere completamente automatizzate
RIVELAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI
L’ultima fase di un saggio di PCR riguarda la rivelazione del prodotto di PCR
Le prime amplificazioni di PCR erano effettuate con il frammento di Klenow
(enzima) di DNA polimerasi di E.coli e non avevano un alto livello di specificità.
Per analizzare il DNA amplificato era necessaria una ibridazione con una sonda
specifica marcata con radioisotopi (sonda calda)
Con l’utilizzo della Taq polimerasi (1988) la sensibilità della PCR ha raggiunto un
livello elevato tanto da essere sufficiente una semplice elettroforesi su gel di
agarosio per visualizzare il DNA amplificato.
1
ELETTROFORESI SU GEL
1) Gel di agarosio al 2% + EtBr
2) Elettroforesi: 100~150 volt.
3) Analizzare su un transilluminatore
UV la banda del prodotto di
amplificazione
Il prodotto dell’amplificazione viene
introdotto in un pozzeto ricavato in un
gel, attraverso il quale viene applicato un
campo elettrico
L’elettroforesi su gel separa i frammenti di
DNA in base alle loro dimensioni: i frammenti
più piccoli migrano più velocemente
Le bande di DNA si visualizzano alla luce ultravioletta
2
IBRIDAZIONE PER LA RIVELAZIONE DEL MATERIALE
AMPLIFICATO
Nel corso degli anni si sono messe a punto tecniche rapide, semplici e
adeguate alla diagnostica di routine.
Si sono resi disponibili sul mercato Kit che permettevano la rivelazione
del DNA amplificato in breve tempo, con l’impiego di traccianti non
radioattivi e con procedure molto semplici e automatizzabili.
Fine anni ‘80 vengono sviluppati metodi di ibridazione che utilizzano
specifiche sonde o primers di amplificazione , marcati con enzimi
(fosfatasi alcalina), molecole fluorescenti, chemiluminescenti (estere di
acridinio) o con biotina.
3
CATTURA DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE
Le sonde possono essere adese al pozzetto di una micropiastra o
a biglie magnetiche e sono specifiche per il prodotto di
amplificazione.
4
Nella fase di PCR vengono utilizzati dei primers biotinilati.
Il DNA biotinilato si lega alla sonda adesa al pozzetto e, dopo alcuni
lavaggi per allontanare i prodotti non specifici, si aggiunge substrato. La
reazione colorimetrica viene letta allo spettrofotometro.
RIVELAZIONE MEDIANTE TEST HPA (Hybridization Protection Assay)
Gli ampliconi di RNA, generati con il TMA, sono ibridati con sonde di DNA a
singola elica marcate con estere di acridinio.
Le sonde non ibridate sono idrolizzate dall’azione di un reagente di idrolisi,
mentre l’estere di acridinio, dopo l’ibridazione, risulta protetto.
I tubi di reazione vengono introdotti in un luminometro che, dopo aggiunta
di un acido e una base, rileva il segnale chemiluminescente e lo converte in
RLU (unità luminose relative).
Con lo sviluppo dei test commerciali, le procedure si
sono semplificate, migliorando il livello di accuratezza
e riproducibilità
Numerosi kit disponibili contengono tutti i reagenti
per l’intera metodica:
Preparazione del campione
Mix per PCR
Rivelazione del prodotto amplificato
Fine anni ‘90
Nascono i primi sistemi completamente automatici per
l’esecuzione del test PCR, accessibili a tutti i laboratori di
routine.
Si tratta di metodiche basate sull’utilizzo di:
Primers biotinilati
Sonde di ibridazione
Rivelazione colorimetrica
Lettura al fotometro (densità ottica)
Viene definito un valore di cut-off che
rende semplice il risultato analogalmente ai
comuni test immunoenzimatici.
Determinazione
qualitativa
Ogni fase del test presuppone, da parte della ditta produttrice, una
approfondita messa a punto per garantire la massima efficienza e la
qualità dei reagenti utilizzati.
BRANCHED DNA
Amplificazione del
segnale
Tecnica usata in alternativa alla PCR e alla
RT-PCR per rilevare piccole quantità di
sequenze specifiche di DNA o RNA
Si tratta del legame di una grande numero di
sonde specificamente e direttamene alla sequenza
di acido nucleico da identificare, creando una
struttura a “branched DNA(bDNA), cioè DNA
ramificato.
L’aggiunta di sonde marcate con fosfatasi
alcalina e di un substrato chemiluminescente
genera un’emissione di luce.
La reazione è letta da un luminometro e il
segnale è direttamente proporzionale alla
quantità di acido nucleico.
Metodica di ibridazione di
ultima generazione
effettuata su uno
strumento che permette di
automatizzare i passaggi
operativi di ibridazione e
rivelazione
Determinazione
quantitativa
Si evitano problemi di contaminazione, ma la sensibilità è inferiore alle
metodiche di amplificazione del target
Il metodo chiamato IBRIDAZIONE INVERSA (REVERSE DOT-BLOT)
utilizza sonde legate a una membrana di nitrocellulosa che “catturano” le
eventuali sequenze di DNA specifiche.
Questo metodo è basato sul legame tra
biotina e streptavidina e consta di tre
passaggi:
1) Il DNA amplificato marcato con
biotina viene ibridato con la sonda
2) l’ibrido biotinilato viene incubato
con la streptavidina legata all’enzima
3) il substrato viene messo a contatto
con il complesso DNA-biotinastreptavidina-enzima e sviluppa una
reazione colorimetrica
FINE ANNI ’90
il metodo è automatizzato
NECESSITA’ DELLA STANDARDIZZAZIONE
Nonostante la semplicità delle metodologie e la facilità di lettura del
risultato, l’attendibilità della PCR in ambito diagnostico è vincolata dal
suo inserimento nella routine diagnostica e dall’esecuzione di
personale competente ed esperto.
Studi collaborativi a livello internazionale hanno sottolineato la
necessità di standardizzazione della PCR per poterla considerare
completamente integrata nel laboratorio clinico.
L’utilizzo di kit comuni migliora la qualità dei risultati rispetto all’impiego di
protocolli diversi (metodiche “in house”).
Indagini multicentriche periodiche con l’utilizzo di pannelli di campioni
“standard” sono necessarie per monitorare la performance del laboratorio
(riproducibilità e sensibilità)
Sviluppo dei kit commerciali
Standardizzazione dei protocolli
Apparecchiature automatizzate
Rapidità di esecuzione
Diagnostica clinica più precisa
EVOLUZIONE DELLA PCR
La PCR è stata migliorata notevolmente con l’introduzione di
coloranti fluorescenti che possono essere usati per marcare sonde
o primer e permettere la rilevazione dei prodotti di PCR durante o
dopo l’amplificazione.
I marcatori fluorescenti fungono da indicatori diretti del
numero di ampliconi sintetizzati durante l’amplificazione PCR.
Nasce la Real Time PCR
Prima pubblicazione sul metodo della Real-Time PCR da parte dei
ricercatori della Cetus (Holland et. al. 1991).
PCR “REAL TIME”
1. Permette di visualizzare l’amplificato man mano che si
forma, sin dalle prime fasi di PCR
2. La concentrazione dell’amplicone è misurata in tempo reale
nel tubo di reazione mentre l’amplificazione è ancora in
corso
3. Permette quindi una valutazione quantitativa del DNA
presente(alta sensibilità analitica: fino a poche copie)
4. La PCR Real Time consente di abbandonare tutte le
manipolazioni successive all’amplificazione, potenziali fonti
di inquinamento del campione (carry-over)
PCR “REAL TIME” : principio
Il principio alla base della maggior parte delle Real-Time PCR è il
trasferimento di energia fluorescente per risonanza FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer)
CHE COS’È LA FRET ?
E’ il trasferimento di energia tra due molecole adiacenti: una funge da
donatore e l’altra da accettore di energia.
L’accettore può essere anch’esso una molecola fluorescente o una
molecola non fluorescente in grado di spegnere il segnale del donatore ( in
questo caso si chiama Quencer).
Le molecole fluorescenti sono attaccate a sonde di DNA specifiche per la
sequenza target
L’efficienza del trasferimento di energia tra i due marcatori dipende
dalla distanza che li separa e dal grado di sovrapposizione tra lo spettro
di emissione del donatore e quello di assorbimento dell’accettore/quencer
Nella Real-Time PCRsi utilizza un solo sistema che funge sia da
termociclatore, sia da rivelatore del segnale di amplificazione.
I risultati quantitativi sono disponibili immediatamente dopo
l’amplificazione senza ulteriori amplificazioni o analisi.
Non essendo necessarie altre fasi post PCR, la possibilità di
contaminazioni incrociate da parte del prodotto di PCR è ridotta al
minimo.
E’ la vera rivoluzione nel campo della diagnostica molecolare
COMPONENTI DELLA REAZIONE
DNA target
DNA polimerasi
Due primers
dNTPs
Sonda fluorescente/
Colorante fluorescente
La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:
COLORANTI FLUORESCENTI (es. SYBR Green) che si
intercalano nella doppia elica del DNA
Il SYBR Green è un colorante fluorescente che si lega al
solco minore del dsDNA. La fluorescenza emessa è letta a
530 nm. La rilevazione del prodotto di PCR utilizzando
il SYBR Green è ottenuta misurando l’aumento della
fluorescenza provocato dal legame del colorante al dsDNA.
REAZIONE ASPECIFICA
SYBR green
Il SYBR Green non discrimina tra diverse specie di
DNA a doppia catena presenti in una soluzione di
reazione. Di conseguenza ogni artefatto del primer
ed altri prodotti di reazione non specifici,
contribuiranno alla misurazione dell’intensità del
segnale fluorescente.
Ciò produrrà una sovrastima della concentrazione della sequenza PCR bersaglio
per cui è necessario ottimizzare la metodica utilizzando primers ben definiti.
La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:
SONDE AD IBRIDAZIONE specifiche per il frammento di
interesse, marcate con molecole fluorescenti.
Esistono diversi tipi di sonde
• Sonde di idrolisi TaqMan
• Sonde di ibridazione FRET
• Sonde Molecular Beacons
• Sonde Scorpions
SONDA TAQMAN
Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” ed
all’estremità 3’ una molecola “Quencer”
SONDE TAQMAN:
Sfuttano la capacità esonucleasica 5’—3’ della Taq Polimerasi
Denaturazione
Nella fase di denaturazione il DNA bersaglio a doppia elica è separato
con un aumento della temperatura nella soluzione della reazione di
amplificazione
SONDE TAQMAN:
Sfuttano la capacità esonucleasica 5’—3’ della Taq Polimerasi
Ibridazione
Nel corso dell’ibridazione prima le sonde TaqMan e poi i primer
ibridizzano in modo specifico con le sequenze complementari del
filamento di DNA bersaglio.
La sonda TaqMan porta due marcatori fluorescenti: un marcatore FAM
(carbossifluoresceina) è il Reporter, l’altro è il Quencer.
Quando la sonda è intatta FAM e Q sono molto vicini e il segnale del
reporter è smorzato.
SONDE TAQMAN:
Sfuttano la capacità esonucleasica 5’—3’ della Taq Polimerasi
Estensione
Durante l’estensione del primer la DNA polimerasi entra in contatto
con la sonda;
Siccome la sonda non può essere estesa,
è digerita dalla polimerasi che utilizza la
sua attività esonucleasica per idrolizzare
la sonda marcata in piccoli frammenti,
separando il FAM dal Quencer.
SONDE TAQMAN:
Sfuttano la capacità esonucleasica 5’—3’ della Taq Polimerasi
La separazione delle due molecole, interrompe il trasferimento di
energia di risonanza fluorescente eliminando, quindi, lo “spegnimento”
del FAM (Reporter) che è libero di emettere un segnale fluorescente
L’attività esonucleasica della
Taq si ha solo se la sonda è
attaccata al bersaglio.
L’aumento di fluorescenza è
direttamente proporzionale
alla quantità di prodotto di
PCR che si è formata.
SONDE MOLECULAR BEACONS:
Le sonde Molecular Beacons sono formate da una singola catena di
DNA ripiegata come una forcina e contengono un fluorocromo e un
quencer non fluorescente.
La vicinanza del Quencer al donatore impedisce a riposo l’emissione di
fluorescenza.
Durante la fase di annealing, la sonda si lega al DNA bersaglio, c’è un cambio di
conformazione per cui il donatore è in grado di emettere fluorescenza.
Nella fase di estensione del primer, le sonde si staccano dal DNA bersaglio e non
interferiscono con la PCR
PRIMER SCORPION:
I primer Scorpion sono primer PCR che
sono legati all’estremità 5’ a una molecola
simile ad una sonda Molecular Becons
(stelo-e-ansa) contenente un Fluoroforo e
un Quencher.
La sonda è separata dal primer per mezzo
di un “bloccante PCR”.
5’
Nel corso della PCR, il primer Scorpion è esteso a partire dalla sua
estremità3’.
Durante la fase di ibridazione del ciclo PCR, la sequenza della sonda nella
coda del primer Scorpion si ricurva per ibridare con la sequenza bersaglio
del prodotto di PCR, separando il Fluoroforo dal Quencher e permettendo
l’emissione di una fluorescenza rilevabile.
3’
SONDE FRET:
Si hanno due sonde distinte, ciascuna marcata con un fluorocromo
FRET: un donatore (Fluoresceina) e un accettore (LC Red)
Quando le due sonde marcate sono libere nella
soluzione, la distanza tra loro impedisce il
trasferimento di energia tra i coloranti.
Le due sonde di acido nucleico marcate
sono disegnate per ibridare con determinate
sequenze bersaglio in modo che i fluorofori
finiscano molto vicini.
Durante la fase di ibridazione le due
sonde si legano a regioni adiacenti del
DNA bersaglio.
Il donatore è eccitato da una fonte
luminosa esterna e trasferisce la sua
energia di attivazione all’accettore
adiacente, che emette un segnale
fluorescente.
PCR “REAL TIME”
La fluorescenza emessa in fase di amplificazione è registrata da
software dedicati che visualizzano il segnale di fluorescenza come
curve di amplificazione.
Le curve sono riportate su monitor collegati al termociclatore.
L’emissione di fluorescenza è direttamente proporzionale alla
quantità di DNA presente.
Per elevate concentrazioni di DNA le curve di amplificazione si
registrano già dopo i primi cicli di PCR.
SISTEMI
AUTOMATIZZATI
All’interno dello strumento c’è una
parte che funge da thermal cycler e
una parte ottica che comprende sia i
componenti per l’eccitazione dei
fluoroforidonatori, sia un sistema di
rivelazione dell’emissione di luce
fluorescente.
Sul monitor del
computer è possibile la
visualizzazione del
profilo termico della
reazione di PCR
Sul PC del sistema di ampl/rivel è
possibile visualizzare in tempo
reale l’andamento
dell’amplificazione sull’intera
piastra
Oppure c’è la possibilità di
visualizzare ogni singolo
campione della piastra
VISUALIZZAZIONE E VERIFICA DEI RISULTATI
Il software legge le unità di fluorescenza in ciascuno dei pozzetti
delle piastre e memorizza i dati. Poi utilizza i dati memorizzati per calcolare
il ciclo soglia (Ct) per ogni calibratore, controllo e campione.
Real-Time PCR : vantaggi
Tempi brevi per ottenere i risultati.
Riduzione del lavoro manuale con diminuzione costo del lavoro.
Uso di sistemi che prevengono il carry-over.
Alto rendimento.
Lunga durata dei probes marcati.
Real-Time PCR : svantaggi
Alti costi degli strumenti che utilizzano la real-time PCR.
Costo dei reagenti ( royalties).
Costo della sintesi dei probes
ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI
L’estrazione di acidi nucleici è il primo passo nelle applicazioni di
biologia molecolare.
Questa fase del processo è molto importante, in quanto
l'efficienza di amplificazione di un tratto di genoma è legata alla
purezza del campione che viene utilizzato per l'amplificazione.
Proteine e sostanze presenti nel campione interagiscono con
l'enzima Taq polimerasi riducendo di molto l'efficienza
dell'amplificazione stessa.
Pertanto, una buona amplificazione è anche il risultato di una
buona estrazione degli acidi nucleici che consente di avere un
prodotto di partenza il più puro possibile.
SEPARAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI
(Metodo di estrazione classico)
Viene sfruttata la diversa solubilità delle molecole presenti in soluzione
(acidi nucleici/contaminanti) fra due fasi tra loro non miscibili.
Una delle prime sostanze utilizzate è il fenolo, nel quale gli acidi
nucleici non sono solubili.
Altre sostanze utilizzate sono il cloroformio o l’etere che permettono
di eliminare le tracce di fenolo eventualmente presenti nella fase
acquosa.
DNA
Lisi del campione
SDS (Detergente)
EDTA (Ag. chelante)
Proteinasi K (Ag. Proteinasico)
Estrazione DNA
Trattamento 1:1 con fenolo-cloroformio alcool isoamilico pH 8.0
3 fasi:
1) fase acquosa contenente DNA
2) interfaccia contenente proteine denaturate
3) fase organica contenente i lipidi
Precipitazione
con Etanolo 100% e lavaggio con Etanolo 70%
Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno
15 min a provetta aperta
Risospensione
con H2 O distillata ultrapura
Conservazione :
DNA 4°C/ -20°C/-80°C
RNA
Lisi del campione
SDS (Detergente)
Proteinasi K (Ag. Proteinasico)
Guanidina tiocianato (Ag. Caotropico)
β-mercaptoetanolo (Ag. riducente)
Estrazione RNA
Trattamento con fenolo-cloroformio pH 5.6
3 fasi:
1) fase acquosa contenente RNA
2) interfaccia contenente proteine denaturate
3) fase organica contenente i lipidi e DNA
Precipitazione
con Isopropanolo e lavaggio con Etanolo 75%
Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno
15 min a provetta aperta
Risospensione
con H2 O distillata ultrapura
Conservazione :
RNA -80°C
SEPARAZIONE PER BOLLITURA
(Metodo di estrazione classico)
Il campione viene riscaldato a 100°C
Lasciato raffreddare
Centrifugato ad alta velocità
Gli acidi nucleici si trovano liberi nel sovranatante
Nel precipitato è presente materiale insolubile
Resa decisamente bassa di estrazione
Negli anni ‘90 a protocolli manuali poco standardizzati
cominciarono ad affiancarsi metodi semi-automatizzati, in cui
si riduceva di molto l’intervento da parte dell’operatore.
Era necessario, però,svolgere manualmente alcuni
passaggi critici, come la lisi del campione.
Molti dei kit in commercio prevedono l'aggiunta al campione di un tampone
di lisi già pronto che contiene GuSCN e detergenti necessari a rompere le
cellule e stabilizzare gli acidi nucleici con la distruzione degli enzimi RNAasi e DNA-asi.
Kit per estrazioni
manuali
1 = Lysis Rack
2 = Filter Tube Rack
3 = Waste Container
4 = Elution Rack
5 = Cover Rack
6 = Grippers
DNA/RNA
SEPARAZIONE PER AFFINITA’
Il metodo è basato sulla proprietà degli a. nucleici di adsorbirsi alla
silice, a differenza delle proteine e di altri composti organici
Lisi del campione
SDS (Detergente)
Proteinasi K (Ag. Proteinasico)
Guanidina tiocianato (Ag. Caotropico)
56°C per 10 min
Adsorbimento DNA
al gel di silice contenuto in una colonnina
in presenza di etanolo e sali caotropici il DNA si lega alla silice
Lavaggi
con soluzioni contenenti alcool in grado di rimuovere le
proteine denaturate e gli altri componenti cellulari e lasciare
il DNA legato alla silice
Eluizione DNA
con H2O o soluzioni a bassa
concentrazione salina
AUTOMAZIONE DELL’ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI
Da pochi anni sono disponibili sistemi automatizzati che
prevedono l’estrazione degli acidi nucleici con metodiche
standardizzate, procedure rapide e semplificate che
riducono sensibilmente i problemi correlati alla manualità
dando così un elevato grado di
affidabilità.
Per una ulteriore garanzia del processo di estrazione è
prevista l’aggiunta di un Controllo Interno, sottoposto agli
stessi trattamenti del campione biologico, aumentando la
validità del metodo.
I sistemi automatizzati sfruttano il principio di affinità degli acidi
nucleici per la silice.
La silice riveste la superficie di biglie magnetiche.
La lisi del campione, la
deproteinizzazione, la
separazione e il
recupero dell’acido
nucleico avviene
all’interno della stessa
postazione di lavoro