Diss. ETH No. 17223
Irx, Emx, and Sim transcriptionfactors control
distinct aspects of nephrogenesisin Xenopus
A dissertation submitted to the
Swiss Federal Institute of Technology (ETH) Zürich
For the degree of
Doctor of Sciences
Presented by
Luca Reggiani
Diploma of Biotechnology
University of Bologna
Born June 9, 1977 in Rimini,
Citizen of Italy
Italy
Prof. Dr. Andre Brändli, examiner
Prof. Dr. Dario Neri, co-examiner
Prof. Dr. Andreas Kispert, co-examiner
2007
Summary
Summary
frog Xenopus laevis has been employed for developmental biology studies since the
1950s but it is only in the last years that it became an established model system in the field
of organogenesis. During the first two days of life, Xenopus embryos develop a functional
pronephrickidney capable to retain efficiently ions and organic molecules while large volumes
The
of water are excreted.
The structure of the pronephrickidney resembles in many aspects the nephrons found in the
adult mammaliankidney. Moreover, the molecules and cellular processes directing pronephric
kidneydevelopmentare similar to the ones employedby highervertebrates.The aimof this thesis
is to identify and functionally characterize genes regulating nephron patterning in vertebrates.
In the first thesis project, a comparative analysis of solute carrier (Sic) gene expression was
performed in the kidney ofXenopus and mouse by in situ hybridization. The results demonstrated
that the segment-specific expressionpattern of several Sic genes is highly conserved between
amphibians and mammals. Moreover, this analysis permittedthe establishmentof a new model
subdividing the Xenopus pronephric kidney into proximal, intermediate, distal and connecting
tubule. This work provided the basis for the following three projeets, which focused on genes
involved in nephron patterning.
In the second project, I dissected the role of the irx gene family of homeobox transcription
factors during pronephric kidney formation. Expression for three irx genes (irxl, irx2, and
irx3) was detected in the intermediate region of the developing pronephrickidney. Knockdown
of irx3 function resulted in the specific loss of the intermediate tubule. Interestingly, irx3
overexpression led to the formation of ectopic intermediate tubule tissues. Taking together,
irx3 was shown to be required and sufficient for the speeification of the intermediate tubule
development. I also showed that Irxl, Irx2, and Irx3 were expressedduring metanephric kidney
developmentwith a spatial and temporal expressionprofile that reflectedthe Situationfound in
the pronephric kidney.
Next, I focused my attention on the sim genes, which are membersof the basic helix-loop-helix
Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS) family of transcription factors. Siml and sim2 were expressed in
the intermediate tubule region of the developing Xenopus pronephric kidney. Subsequently,a
number of approaches were taken to elueidate the role of sim2 in the control of intermediate
tubule development. Sim2 loss-of-funetion embryo displayedan abnormady short intermediate
tubule. On the other hand, ectopic expressionof sim2 led to an intermediate tubule characterized
by an extensive growth. I concluded that sim2 function is required to control the size of the
intermediate tubule compartment.
Summary
In the final
study, I dissected the function of emx genes, orthologs of the Ems homeobox
transcription factor dlscovered in Drosophila. Both emxl and emx2 were expressed, in the
proximal tubule, distal tubule, and connecting tubule. Knockdownsof emx genes, eitheralone
or in combination, did not affect proximal tubule patterning and maturation. However, reduced
expressionof terminal differentiationmarkers in the distal and connecting tubule was observed.
I concluded that emx gene funetions are required for maturationof the distal and connecting
tubule.
Taken together, I have established the nephron segmentOrganization of the Xenopus pronephric
kidney and defined the specific boundariesof several transcription factors in the development
of nephron segments.
Sommario
Sommario
La rana artigliata Africana Xenopus laevis e utilizzata nei laboratoriche si occupanodi biologia
dello sviluppo fin dagli anni '50 ma solo negli ultimi anni e diventata un organismo modello
nello studio della formazione degli organi. Durante i primi due giorni di vita, Xenopus sviluppa
un rene embrionale (pronefro) capace di assorbire gli ioni e le molecole organiche essenziali e
che e allo stesso tempo capace di espellere ingenti quantitä d'acqua.
La sua struttura ricalca quella del nefrone, il quäle e l'unitä funzionale del rene adulto dei
vertebrati. Inoltre, le molecole e i processi cellulari che dirigono lo sviluppo del pronefro sono
simili a quelli impiegati dai vertebrati superiori. Lo scopo di questa tesi e I'identificazione e
la caratterizzazione dei geni che regolano la progressiva segmentazione del nefrone durante lo
sviluppo.
primo progetto e stata condotta un'analisi comparativa del profilo di espressione della
famiglia dei trasportatori di soluti (Sic)mXenopus e topo, tramite ibridizzazione in situ. I risultati
hanno mostrato che il profilo d'espressione dei geni Sic e altamente conservato tra gli anfibi
e i mammiferi. Inoltre questa analisi ha permesso di definire con precisione la segmentazione
del pronefro, che e stato suddiviso in quattro segmenti principali chiamatitubulo prossimale,
intermedio, distale e connettore. Questa descrizione e stata il punto di partenzaper i tre progetti
successivi incentrati sui geni coinvolti nella segmentazione del pronefro.
Nel
Nel secondo progetto mi sono dedicato al ruolo dei fattori di trascrizione Irx, appartenenti alla
famiglia dei geni omeotici. Per tre di loro, irxl, irx2 e irx3 e stata descritta 1'espressione nel
tubulo intermedio del pronefro di Xenopus durante lo sviluppo. Quando la funzione del gene
irx3 e soppressa, nel pronefro viene a mancare il tubulo intermedio. Una sovraespressionedel
gene irx3 provoca la comparsa di tessuti ectopici del tubulo intermedio. Di conseguenza, ho
dimostrato che il gene irx3 e essenziale e sufficienteper specificare il tubulo intermedio del
pronefro di Xenopus. Abbiamo anche documentato che i geni Irxl, Irx2 e Irx3 sono espressi
durante lo sviluppo del rene adulto nel topo e che il loro profilo d'espressione, spaziale e
temporale,riflette la situazione riscontratanel pronefro.
Abbiamo poi analizzato la funzione dei geni sim, membri della famiglia di fattori di trascrizione
basic helix-loop-helix Per-Arnt-Sim (bHLH-PAS). I geni siml e sim2 sono espressi durente
lo sviluppo del pronefro di Xenopus nel tubulo intermedio. Abbiamo definito il ruolo del gene
sim2 nel controllo della dimensione del tubulo intermedio. In embrioni dove la funzione del
gene sim2 e stata soppressa il tubulo intermedio era significativamente piu' corto. Quando
sim2 era espresso in maniera ectopica 11 tubulo intermedio e caratterizzatoda una estensione
superiore al normale. I risultati dimostrano che sim2 ha la funzionedi controllare la dimensione
Sommario
del
compartimento
intermediodel pronefro.
Ho inoltre valutato la funzione dei geni emx, ortologhi del fattore di trascrizioneomeotico Ems
scoperto in Drosophila. Sia emxl che emx2 erano espressi, sebbene con un profilo diverso,
nel tubulo prossimale, distale e connettore del pronefro. La soppressione della funzione di
entrambi i geni, singolarmente o in combinazione, non ha prodotto effetti nella specificazione
del tubulo prossimale o nella sua maturazione.Ha invece ridotto l'espressione di marcatori del
differenziamentonel tubulo distale e connettore. I dati ottenuti indicano che la funzione dei
geni
emx e
necessaria per la maturazione del tubulo distale
e
connettore.
In definitiva, ho descritto la struttura segmentata del nefrone del pronefro di Xenopus e ho
definito i confini d'azione specifici di alcuni fattori di trascrizione implicati nello sviluppo dei
segmenti del nefrone.
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