Analisi del ruolo del gene Xbsx nello sviluppo dell`organo pineale di

INDICE
Riassunto…………………………………………………………….2
Abstract………………………………………………………………5
1. Introduzione…………………………………………………….8
1.1 Lo sviluppo del sistema nervoso …………………………………….9
1.1.1 La neurulazione
1.1.2 La formazione dell’encefalo
1.2 L’organo pineale dei vertebrati ……………………………………..11
1.2.1 Morfogenesi
1.2.2 L’organo pineale di Xenopus laevis
1.2.3 Controllo genetico dello sviluppo dell’organo
pineale di Xenopus laevis
1.2.3.1 Xrx1
1.2.3.2 Xotx5b
1.2.3.3 Xnot2
1.3 Il sistema foto-neuro-endocrino …………………………………. 22
1.3.1 Ruolo della melatonina
1.3.2 Regolazione endogena dei ritmi circadiani
1.3.3 Basi molecolari dell’orologio endogeno
1.3.4 Controllo genetico del ritmo di produzione
della melatonina
1.4 Il gene “Brain specific homeobox” ……………………………….29
1.4.1 Il gene bsh di Drosophila melanogaster
1.4.2 Il gene Bsx di topo
1.4.3 Il gene Xbsx di Xenopus laevis
1.5 Scopo della tesi
2. Materiali e Metodi…………………………………………….42
2.1 Trasformazione di cellule di E.coli ed amplificazione
del DNA plasmidico ……………………………………………………………..42
2.1.1. Trasformazione
2.1.2 Estrazione di DNA plasmidico
su piccola scala mediante lisi alcalina (“miniprep”)
2.1.3 Estrazione di DNA plasmidico su
media scala (“midiprep”) mediante colonne
NUCLEOBOND
2.2 Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione ………..47
2.3 Purificazione del DNA …………………………………………………….48
2.3.1 Estrazione fenolica
2.3.2 Precipitazione alcolica
2.4 Elettroforesi su gel di agarosio …………………………………….49
2.5 Iniezione e rivelazione della
Bromodeossiuridina (BrdU) ………………………………………………….51
2.6 Ibridazione in situ ………………………………………………………….52
2.6.1 Raccolta di embrioni di Xenopus laevis
2.6.2 Preparazione della sonda per gli esperimenti di
ibridazione
2.6.3 Ibridazione in situ “whole mount”
2.6.3.1 Procedura di ibridazione
2.6.3.2 Preparazione dell’ “egg extract”
2.6.3.3 Depigmentazione (“bleaching”)
2.6.4 Ibridazione in situ su sezione
2.6.4.1 Criosezione
2.6.4.2 Procedura di ibridazione
2.6.5 Fotografie
2.7 Crescita degli embrioni di Xenopus laevis in condizioni
cicliche di luce………………………………………………………………………..66
2.8 Cloni ………………………………………………………………………………….66
2.9 Reazione di PCR ……………………………………………………………….68
2.10 Reazione di “ligation” ……………………………………………………68
2.11 Analisi per la presenza di proteine ………………………………70
2.11.1 Elettroforesi su gel di poliacrilammide (“SDS-PAGE”)
2.11.2 “Western blotting”
2.11.3 Rivelazione per chemioluminescenza
2.12 Misurazione dell’intensità del segnale con il
programma Imagej……………………………………………………………………74
3. Risultati…………………………………………………………….75
3.1 Espressione di Xbsx nelle cellule in sviluppo……………………76
3.2 Analisi del tipo cellulare di espressione di Xbsx……………….78
3.3 Analisi dell’espressione circadiana di Xbsx ………………………81
3.3.1 Analisi dell’espressione circadiana di Xbsx
nell’organo pineale
3.3.2 Espressione circadiana di Xbsx nell’ipotalamo
3.4 Verifica dell’efficacia e della specificità
dell’oligonucleotide antisenso “morpholino” contro Xbsx……….88
3.4.1 Generazione dei costrutti
3.4.2 Sintesi dell’RNA messaggero dai costrutti
3.4.3 Microiniezione degli embrioni
3.4.4 Estrazione di proteine dagli embrioni e
“western blotting”
4. Discussione ………………………………………………………96
Bibliografia
Ringraziamenti