recenti acquisizioni sulla malattia del riso provocata da fusarium

RECENTI ACQUISIZIONI SULLA MALATTIA
DEL RISO PROVOCATA DA FUSARIUM
FUJIKUROI
Davide Spadaro*,**, Maria Lodovica Gullino*,**, Angelo Garibaldi*
*AGROINNOVA – Centrdo di Competenza per l’Innnovazione in Campo
Agroambientale, Università di Torino
**DISAFA – Dip. Science Agrarie, Forestali ed Alimentari, Università di Torino
Triangolo del riso: VC-NO-PV
I: 247.594 ha (52% EU)
VC-NO-PV-MI: 90% I riso, 40% EU riso
56.000 ha: risotto (Arborio, Carnaroli, Roma, VN)
50.000 ha: zuppe e riso soffiato
(Balilla, Centauro, Selenio, Brio)
40.000 ha: riso parboiled
35.000 ha: riso indica
30.000 ha: riso aromatico o pigmentato
2
Fusarium fujikuroi
Agente del Bakanae (Giappone, 1828)
Trasmesso per seme
Microconidi e macroconidi
3
Fusarium fujikuroi





Biologia ed epidemiologia
Diagnostica
Concia chimica, biologica e fisica
Selezione varietale
Interazioni tra pianta e patogeno
4
Sintomatologia
Entro la fase di accestimento:
 allungamento del culmo
 clorosi
 aumento dell’angolo di
inserzione fogliare con
foglie a bandiera colore
verde pallido
 assenza o riduzione di
accestimento
 le piante muoiono
Sintomatologia
Sviluppo tardivo:
 sviluppo di masse fungine di
colore bianco-rosa alla base
del culmo e sulla corona
Maggior parte dei sintomi:
dall’emergenza all’inizio
dell’accestimento
Levata: assenza di nuove piante
malate
Nuovi sintomi:
botticella-inizio maturazione
Diffusione del bakanae
Maggiori aree di produzione del riso
Sud-est asiatico
 Pakistan (Khan et al., 2000)
 Bangladesh: 2000 (Haq et al., 2011)
 Taiwan: (Huang e Chu, 2009)
 India: 2006 (Gupta et al., 2014)
 Corea del sud: (Kim et al., 2015)
Italia: dal 2006 (Amatulli et al., 2012)
2013: 1509 ha su 8578 ha da seme
Fusarium AND rice: 874 articoli
Diffusione per via aerea
Captaspore: Trino, VC (Italy)
Numero di conidi/m3 aria
Diffusione per via aerea di F. fujikuroi solo su brevi distanze
Fattori predisponenti
Il fungo sverna nei semi infetti o nei
residui vegetali di riso (fino a 3 anni).
Temperatura ottimale: 25-27°C,
sintomi regrediscono a T<20°C.
i
Elevata UR: allungamento del culmo,
arresto della crescita del patogeno in
terreni asciutti.
Elevato azoto nel terreno: aumenta
crescita
fungina
e
suscettibilità
dell'ospite.
Malattia favorita da elevate quantità di
essudati (amminoacidi e zuccheri)
prodotti dai semi in germinazione.
Gibberella fujikuroi species complex
Gruppo monofiletico che include oltre 50
specie di Fusarium caratterizzate da
caratteristiche morfologiche simili.
Suddiviso in gruppi (clade), in base ad
analisi filogenetica sul DNA.
Wiemann et al. 2013, PLOS Pathogens
Draft WGS: Jeong et al. 2013
12 cromosomi
Metabolismo secondario
F. fujikuroi è impiegato industrialmente per la
produzione di gibberelline, in particolare di GA3.
F. fujikuroi è in grado di produrre altri metaboliti
secondari tra cui pigmenti (BIK) e micotossine
Fusaproliferina
Beauvericina
Fusarine
Acido fusarico
Wiemann et al. 2013, PLOS Pathogens
Fumonisine, strutturalmente simili alla sfinganina,
interferiscono con il metabolismo degli sfingolipidi
in animali e piante.
Moniliformina
Fumonisine
Produzione di fumonisine
Diverse condizioni di luce
Espressione di FUM1 (PKS)
FUM 1: PKS, 1° gene espresso nel cluster
delle fumonisine
Produzione di FB1
Matic et al. 2013, IJFM
Fusarium fujikuroi





Biologia ed epidemiologia
Diagnostica
Concia chimica, biologica e fisica
Selezione varietale
Interazioni tra pianta e patogeno
13
Popolazione di Fusarium spp. in Italia
ISOLAMENTO
RACCOLTA CAMPIONI
2006-2010
Estrazione del DNA
Fattore di elongazione traduzionale TEF
334 isolati da piante di riso infetto su 364 erano F. fujikuroi
Analisi BLAST
Monitoraggio di Fusarium spp.
2006-2007
2008
2009
2010
15
Patogenicità
203 isolati di Fusarium spp. impiegati nei saggi di
patogenicità.
Micelio di 15 d
Solo gli isolati di F. fujikuroi
causavano sintomi di Bakanae.
F.
verticillioides
e
proliferatum
reisolati
106 conidi/ml
F.
da
plantule asintomatiche:
colonizzano il tessuto ma non
sono coinvolti nello sviluppo
della malattia.
Semina
Valutazione a 30 dpg
16
Limiti legislativi
recepita dal Decreto MIPAAF 19 luglio 2012
sementi di base:
max 2 piante colpite da bakanae per 200 m2
sementi certificate di 1° generazione: max 4 piante colpite da bakanae per 200 m2
sementi certificate di 2° generazione: max 8 piante colpite da bakanae per 200 m2
Rilevamento speciifico di F. fujikuroi: mating type o tecniche molecolari
Obiettivo:
sviluppare primer species-specifici per distinguere F. fujikuroi da Fusarium del GFSC
Sequenze TEF
Estrazione del DNA
Amplificazione del TEF
Analisi sequenze e
disegno di primer
Valutazione della specificità e sensibilità dei primer
Specie più rappresentative del GFSC e altri Fusarium spp.
DNA dalla collezione di Fusarium spp. isolati da riso
18
Delezione per il disegno di primer
Una delezione di 6 nt nel
secondo introne del
geneTEF di F. fujikuroi
Species
F. fujikuroi
Primer
name
Fuji1F
TEF-R
F. proliferatum Proli1F
TEF-R
gene Primer sequence
TEF
TEF
Fragment size
ACGTGTCAAACTAAACATTCGA 179 bp
GCGACAACATACCAATGACG
GTCACGTGTCAAGCAGCGA
GCGACAACATACCAATGACG
Primer specifici per F. fujikuroi Primer specifici per F. proliferatum
188 bp
19
M
Applicazione in real time
(SYBR GREEN)
Germinelli di riso sani
Sensibilità dei primer: 10 pg gDNA
Germinelli di riso infetti
Specificità e sensibilità dei primer
Rilevamento da
tessuti di riso
CM
Rilevamento da semi di riso
M
Semi naturalmente
infetti da F. fujikuroi
CM
Semi inoculati artificialmente
con F. proliferatum
CM
Cicli di amplificazione di qPCR su diverse concentrazioni di DNA.
DNA rilevato a concentrazioni da 1 ng a 10 pg di DNA genomico.
20
Sonda Taqman per qPCR
Primer specifici e sonda Taqman per PCR real-time per il
rilevamento di Fusarium fujikuroi, aumentando sensibilità e
specificità.
Fusarium fujikuroi





R2
3
Biologia ed epidemiologia
Diagnostica
Concia chimica, biologica e fisica
Selezione varietale
Interazioni tra pianta e patogeno
R2
6
R9
SB1
control
22
Concia chimica
Italia
La concia chimica delle sementi di riso in Italia interessa circa il 70%
delle sementi di riso certificate.
- Fludioxonil (Celest, 2,4%, Syngenta), nuova formulazione
- Procloraz (Prelude 20 FS, 27,25%, BASF Crop Protection): non più
consentito dal 2015
Altri Paesi
- Carbendazim
- Tiram
A causa della riduzione della disponibilità di agrofarmaci per la concia,
la malattia ha acquistato maggiore rilevanza.
Metodi di difesa alternativi:
 concia fisica
 concia biologica
Lotta biologica in vitro e in vivo
R23
R26
R9
SB1
control
Prodotti commerciali
Streptomyces griseoviridis
(Mycostop mix)
Bacillus subtilis
(Serenade)
Glomus caledonium GM 24
Glomus coronatum GU 53
Glomus intraradices GB 67
Bacillus subtilis BA 41
Streptomyces spp. SB 15
Trichoderma harzianum TH 02
Pseudomonas proradix 10
(Ekoseed Pro)
Indice di bakanae su
riso coltivato in serra.
Isolate
R23
R26
R9
SB1
Species
Metschnikowia pulcherrima
Metschnikowia pulcherrima
Pichia guilliermondii
Sporidiobolus pararoseus
Matic et al. 2014, Biological Control
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
j
h
b
i
b
g
f
b
e
e
e
d
c
Germination
Disease index
b
b
b
b
b
c
b
b
b
aa
aa
aa
aa
aa
aa
60
°
60 Cx5
°C '
60 x10
°C '
60 x15
°C '
x
65 20'
°
65 Cx5
°C '
65 x10
°C '
65 x15
°C '
x
70 20'
°
70 Cx5
°C '
70 x10
°C '
70 x15
°C '
x
75 20'
°
75 Cx5
°C '
75 x10
°C '
75 x15
°C '
x2
Co 0'
nt
ro
l
%
Termoterapia
Efficacia di HWD sulla germinazione
e sull’incidenza di bakanae di semi
di riso naturalmente contaminati da
F. fujikuroi.
Fattori chiave: tempo e temperatura.
Matic et al. 2014, Biological Control
25
Antagonisti + HWD: effetto sinergico
HWD, antagonisti e combinazione
HWD+antagonisti sull’indice di malattia
di piante di riso coltivato in serra.
26
Fusarium fujikuroi





Biologia ed epidemiologia
Diagnostica
Concia chimica, biologica e fisica
Selezione varietale
Interazioni tra pianta e patogeno
27
Germoplasma di riso
3,5
Per trovare linee di riso resistenti o tolleranti a bakanae.
 40 linee fornite da SAPISE
 62 linee della collezione RISINNOVA fornite da CRA-RIS
 13 cultivar (RISINNOVA)
3,0
f
2,5
1,5
1,0
0,5
e
d
2,0
a
ab
abc
abc
abcd
abcd
bcd
cd
g
cd
0,0
0
1
2
3
4
Prove in serra
6 genotipi resistenti
(D.I. < 1)
28
40 linee di riso in sviluppo
0
1
2
3
4
Prove in campo - 6 genotipi resistenti - (D.I. < 1)
29
Fusarium fujikuroi





Biologia ed epidemiologia
Diagnostica
Concia chimica, biologica e fisica
Selezione varietale
Interazioni tra pianta e patogeno
30
Meccanismi di resistenza al bakanae
a) Selenio inoculato
b) Selenio testimone
c) Dorella testimone
d) Dorella inoculato
Risposte molecolari
Risposte chimiche
31
Le risposte molecolari
Selenio: cv resistente
Dorella: cv suscettibile
Confronto tra sano e inoculato (106 spore/ml)
2 tempi: 1 / 3 settimane dopo la germinazione (wpg)
Replicazioni tecniche e biologiche
Estrazione dell’RNA da foglie
Sequenziamento NGS
Sequenze mappate sul genoma di riso (Oryza sativa subsp. Japonica ‘Nipponbare’)
in media, 17 milioni di sequenze = 867 mil in totale
trascrittoma per replicazione: 16X
DEG: geni differenzialmente espressi
Annotazione funzionale dei geni
Arricchimento in ontologie geniche
Vie geniche: KEGG
Profilo dei geni di difesa a 3 wpg
Chitinase
PR3,4,8,11
Peroxidase
PR9
Germins
PR15,16
WRKY
Selenio 3 wpg
5
3
Glucanase
PR2
Proteinase inhibitor
PR1
1
-1
-3
Geni indotti nel genotipo suscettibile: germine, MAP chinasi, PR1 e fattori
trascrizionali WRKY.
5
4
Dorella 3 wpg
3
2
1
0
-1
-2
-3
Geni indotti nel genotipo suscetttibile: glucanasi, chitinasi, perossidasi e PR
MAP kinase
Other
PRs: PR5
Arricchimento in GO in Selenio
Selenio
specific
33 GO specifiche per Selenio:




Risposta a chitina
Risposta ipersensibile
Risposta all’acido abscissico
Biosintesi dell’acido jasmonico
(bloccato da GA3)
Acido jasmonico
JA: difesa contro i necrotrofi
GA promuove i patogeni necrotrofi come G. fujikuroi,
reprimendo l’acido jasmonico
Siciliano et al., 2015
Fusarium fujikuroi su riso
Number of F. fujikuroi cells/g fresh plant weight
1,00E+04
1,00E+03
Taqman qRT-PCR
1,00E+02
1,00E+01
S-
S+
1 week
3 week
D-
D+
Selenio
specific
Arricchimento in GO in Dorella
51 GO specifiche per Dorella:
 risposta all’etilene
 risposta all’acido salicilico
 metabolismo delle gibberelline
Gibberelline e acido abscissico
Selenio: alto AbA, risposta allo stress, geni upregolati, antagonizza GA3
Dorella: alto AbA a 3 e 4 wpg, correlato alla senescenza
Acido salicilico
Ruolo importante nelle risposte di difesa ai patogeni fungini.
SA superiore in Dorella quando inoculata
SA simile in Selenio quando inoculato
Siciliano et al 2015
Risposta all’attacco patogeno
Selenio
Rosso: geni sovraespressi
Blu: geni sottoespressi
Dorella
Produzione di fitoalessine
16 fitoalessine caratterizzate in riso:
14 diterpeni (momilattone A e B)
2 flavonoidi (sakuranetina e naringenina).
Naringenin
Momilattone A:
principale
fitoalessina
diterpenica
Intermedio
7-O-metiltrasferasi
(NOMT)
Sakuranetina: principale fitoalessina flavonoidica
I momilattoni A e B in riso
MOM-A, elevato in Selenio, sia inoculato sia non, a 1, 2, 3 e 4 settimane
MOM-A sale in Selenio in seguito a inoculazione
La sakuranetina in riso
Elevata in Selenio inoculato a 1, 2, 3 e 4 wpg
Siciliano et al 2015
Conclusioni
 F. fujikuroi: rapida diffusione favorita da
riduzione della concia chimica
 Aziende sementiere: semente esente da F.
fujikuroi, certificazione
 Metodo di diagnosi specifico e rapido: PCR, qPCR
con sybrsafe, qPCR con sonda Taqman
 Lotta biologica mediante antagonisti
 Termoterapia
 Linee resistenti o tolleranti, utili per programmi
di miglioramento genetico
 Alcuni geni e produzione di fitoalessine:
marcatori di resistenza al bakanae
 Trascrittomica: maggiore conoscenza delle
interazioni tra riso e F. fujikuroi
nel genotipo S: necrotrofo sistemico
nel genotipo R: risposta ipersensibile a livello locale
44
Prospettive
Il patosistema riso - Fusarium fujikuroi
Modello per studiare patogeni trasmessi per seme
Modello per studiare patogeni emibiotrofi
Programmi di miglioramento genetico del riso:
ricerca di regioni cromosomiche dove si trovino geni o QTL di R
Nuove tecniche diagnostiche semplici e rapide
Studio di metagenomica:
diffusione aerea e interazioni con la microflora
45
Ringraziamenti
Maria Lodovica Gullino
Slavica Matic
Ilenia Siciliano
Giampiero Valè
Greice Amaral
Paolo Bagnaresi
Chiara Biselli
Luigi Orru’
Massimo Biloni
Diego Greppi
Pamela Abbruscato
Alessandro Infantino
Maria Aragona
Simone Silvestri
RISINNOVA “Integrated Genetic and Genomic Approaches
for new Italian Rice Breeding Strategies”
TESTA “Seed health: development of seed treatment
methods, evidence for seed transmission and assessment
of seed health”
EMPHASIS “Effective management of pests and harmful
46
alien species - Integrated solutions”