Purificazione della β-galattosidasi

G2 - Purificazione della ß-galattosidasi, SDS page della ß-galattosidasi, immobilizzazione
enzimatica e attività della β-Galattosidasi
Destinatari
Classi III, IV e V
Purificazione della ß-galattosidasi
Obiettivi didattici
Purificare la proteina ß-galattosidasi precedentemente estratta da colture batteriche di Escherichia
Coli in cui è sovra-espressa.
Prerequisiti
Cellula procariotica, vettori di espressione, sintesi proteica e struttura proteine.
Descrizione
L'esperienza di laboratorio prevede la purificazione della proteina ß-galattosidasi prodotta all’interno
di Escherichia Coli dal resto delle proteine cellulari. A tale scopo l’estratto batterico totale verrà
purificato mediante cromatografia di affinità. Questa tecnica permette di separare la proteina grazie
alle interazioni specifiche fra la matrice della colonna cromatografia e la sequenza di poli-istidina
(His-tag) legata alla proteina ß-galattosidasi in fase di costruzione del vettore di espressione utilizzato
per sovraesprimere la proteina nei batteri. La purificazione permette di ottenere vari campioni proteici
da caratterizzare mediante elettroforesi in gel di acrilammide.
SDS page della ß-galattosidasi
Obiettivi didattici
Conoscere e sperimentare le principali tecniche di biochimica utilizzate nella identificazione e
caratterizzazione delle proteine quali l’elettroforesi su gel di poliacrillammide.
Prerequisiti
Cellula procariotica, enzimi di restrizione, vettori di espressione, sintesi proteica e struttura proteine.
Descrizione
I campioni della proteina ß-galattosidasi, precedentemente purificati mediante cromatografia di
affinità e contenenti differenti concentrazioni di proteina, sono caricati su gel di poliacrilammide.
Dopo colorazione del gel è possibile evidenziare le diverse concentrazioni di proteina ottenute
durante la purificazione e confrontarle con l’estratto totale contenente molte delle proteine espresse
dal batterio e un marcatore di peso molecolare costitutito da proteine di peso molecolare noto. L’SDSPAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di dodecil solfato di sodio) è il tipo di
elettroforesi più utilizzato in biochimica, in quanto permette di stabilire con buona accuratezza sia il
grado di purezza della proteina purificata, sia il suo peso molecolare. La tecnica è complessa e
richiede esperienza in chi la applica, ma è indispensabile per monitorare quante proteine sono presenti
nelle varie fasi di purificazione di un preparato.
Immobilizzazione enzimatica
Obiettivi didattici
Utilizzare β-galattosidasi (lattasi) immobilizzata per produrre latte privo di lattosio.
Prerequisiti
Proteine, enzimi e attività enzimatica.
Descrizione
La β-galattosidasi (lattasi) è un enzima della classe delle idrolasi che catalizza la reazione di idrolisi
del lattosio a glucosio e galattosio. Entrambi questi zuccheri sono più dolci del lattosio e risultano
anche più digeribili. E’ stato stimato che il 75% degli adulti nel mondo mostrano una diminuzione
dell’attività della lattasi nell’età adulta. Per tale motivo sul mercato sono sempre più presenti latte e
derivati privi di lattosio. In questa attività gli studenti dovranno immobilizzare l’enzima lattasi in
biglie di alginato di calcio che saranno poste in una colonna attraverso la quale verrà fatto passare il
latte. In seguito alla scissione del lattosio catalizzata dall’enzima si formerà una maggiore
concentrazione di glucosio misurabile con metodo colorimetrico. L’immobilizzazione enzimatica è
una tecnica ampiamente utilizzata sia come strumento per la ricerca di base, che per applicazioni
analitiche ed industriali. Questo protocollo permette di applicare tale tecnica all’enzima βgalattosidasi per ottenere un prodotto presente anche in commercio e avere una stima della
concentrazione di glucosio prodotto in seguito alla reazione di idrolisi del lattosio ad opera
dell’enzima.
Attività della β-Galattosidasi
Obiettivi didattici
Studiare la regolazione dell’ attività enzimatica della β-galattosidasi.
Prerequisiti
Struttura delle proteine, sito attivo negli enzimi, inibitori competitivi e non competitivi,
spettrofotometria e legge di Lambert Beer.
Descrizione
La β-galattosidasi o lattasi è un enzima localizzato principalmente nella parete intestinale e
responsabile della scissione del lattosio a glucosio e galattosio. Il protocollo analizza l’attività
enzimatica della β-galattosidasi mediante uno spettrofotometro. Come substrato dell’enzima viene
utilizzato l’ONPG (2-Nitrophenil- β-D-Galactopyranoside), un analogo del lattosio. Tale composto è
incolore, ma in presenza dell’enzima viene idrolizzato a ortonitrofenile (ONP) (un composto dal
colore giallo) e galattosio. La velocità della reazione di idrolisi può essere calcolata allo
spettrofotometro misurando l’intensità della colorazione gialla. La velocità di reazione verrà misurata
in assenza e in presenza di sostanze che riducono l’attività dell’enzima, gli inibitori. Gli inibitori
possono impedire al substrato di entrare nel sito attivo o intralciare la reazione di catalisi dell'enzima.
Il protocollo utilizza un inibitore competitivo e uno non competitivo. Il primo tipo di inibitore si lega
in maniera reversibile al sito attivo diminuendo la quantità di enzima libero con una riduzione della
velocità alla quale avviene la reazione. Un aumento della concentrazione di substrato, aumenta la
velocità di reazione. L’inibitore non competitivo, invece, si lega ad un sito distinto da quello preposto
a legare il substrato senza interferire quindi con il legame enzima-substrato; questo legame, tuttavia,
inattiva l’enzima perché ne cambia il sito attivo. L’inibitore non competitivo riduce la quantità di
enzima attivo abbassando di fatto la velocità di reazione. Aumenti di substrato in presenza di inibitori
non competitivi non variano la velocità di reazione.