attività b-galattosidasi

G1 - Immobilizzazione enzimatica e attività della β-Galattosidasi
Immobilizzazione enzimatica
Difficoltà
Obiettivi didattici
Utilizzare β‐galattosidasi (lattasi) immobilizzata per produrre latte privo di lattosio.
Prerequisiti
Proteine, enzimi e attività enzimatica.
Descrizione
La β‐galattosidasi (lattasi) è un enzima della classe delle idrolasi che catalizza la
reazione di idrolisi del lattosio a glucosio e galattosio. Entrambi questi zuccheri sono
più dolci del lattosio e risultano anche più digeribili. E’ stato stimato che il 75% degli
adulti nel mondo mostrano una diminuzione dell’attività della lattasi nell’età adulta.
Per tale motivo sul mercato sono sempre più presenti latte e derivati privi di lattosio.
In questa attività gli studenti dovranno immobilizzare l’enzima lattasi in biglie di
alginato di calcio che saranno poste in una colonna attraverso la quale verrà fatto
passare il latte. In seguito alla scissione del lattosio catalizzata dall’enzima si formerà
una maggiore concentrazione di glucosio misurabile con metodo colorimetrico.
L’immobilizzazione enzimatica è una tecnica ampiamente utilizzata sia come
strumento per la ricerca di base, che per applicazioni analitiche ed industriali. Questo
protocollo permette di applicare tale tecnica all’enzima β‐galattosidasi per ottenere un
prodotto presente anche in commercio e avere una stima della concentrazione di
glucosio prodotto in seguito alla reazione di idrolisi del lattosio ad opera dell’enzima.
Attività della β-Galattosidasi
Difficoltà
Obiettivi didattici
Studiare la regolazione dell’ attività enzimatica della β‐galattosidasi.
Prerequisiti
Struttura delle proteine, sito attivo negli enzimi, inibitori competitivi e non competitivi,
spettrofotometria e legge di Lambert Beer.
Descrizione
La β‐galattosidasi o lattasi è un enzima localizzato principalmente nella parete
intestinale e responsabile della scissione del lattosio a glucosio e galattosio. Il
protocollo analizza l’attività enzimatica della β‐galattosidasi mediante uno
spettrofotometro. Come substrato dell’enzima viene utilizzato l’ONPG (2‐Nitrophenil‐
β‐D‐Galactopyranoside), un analogo del lattosio. Tale composto è incolore, ma in
presenza dell’enzima viene idrolizzato a ortonitrofenile (ONP) (un composto dal colore
giallo) e galattosio. La velocità della reazione di idrolisi può essere calcolata allo
spettrofotometro misurando l’intensità della colorazione gialla. La velocità di reazione
verrà misurata in assenza e in presenza di sostanze che riducono l’attività dell’enzima,
gli inibitori. Gli inibitori possono impedire al substrato di entrare nel sito attivo o
intralciare la reazione di catalisi dell'enzima.
Il protocollo utilizza un inibitore competitivo e uno non competitivo. Il primo tipo di
inibitore si lega in maniera reversibile al sito attivo diminuendo la quantità di enzima
libero con una riduzione della velocità alla quale avviene la reazione. Un aumento della
concentrazione di substrato, aumenta la velocità di reazione. L’inibitore non
competitivo, invece, si lega ad un sito distinto da quello preposto a legare il substrato
senza interferire quindi con il legame enzima‐substrato; questo legame, tuttavia,
inattiva l’enzima perché ne cambia il sito attivo. L’inibitore non competitivo riduce la
quantità di enzima attivo abbassando di fatto la velocità di reazione. Aumenti di
substrato in presenza di inibitori non competitivi non variano la velocità di reazione.