302
Casistica
Recenti Prog Med 2011; 102: 302-306
Importanza della diagnosi molecolare
nel riconoscimento delle alfa talassemie.
Descrizione di un caso
Domenico Dell’Edera1, Antonio Malvasi4, Andrea Tinelli3, Eleonora Mazzone1,
Manuela Leo1, Vito Monti1, Annunziata Anna Epifania2
Riassunto. Con il termine di alfa talassemie si intendono
quei disordini ereditari dell’emoglobina causati da ridotta o assente sintesi delle catene globiniche alfa. Il presente lavoro mette in evidenza come in presenza di una alfa2Tal (-α/αα), denominata silente, la diagnosi biochimica risulta essere insufficiente. In questi casi, lo studio molecolare dei geni alfa globinici è necessario per la sua identificazione. A ragione di ciò, presentiamo il seguente caso clinico. È pervenuta alla nostra osservazione una donna di
29 anni, gravida alla 12a settimana, per sottoporsi al test
di screening prenatale per la sindrome di Down e di Edwards (bitest). Dall’anamnesi effettuata alla coppia, si evinceva che entrambi presentavano indici ematologici dubbi:
il signor T.G. presentava un quadro biochimico correlato
ad alfa1-Tal (MCV 58,8fl, MCH 19,8pg, HbA2: 1,9, HbF:0,4,
globuli rossi 6,58x106/ul ed Hb 13g/dl), che è stato confermato dall’analisi molecolare (genotipo alfa0-20.5Kb). Particolari difficoltà interpretative ha presentato la paziente
C.F. che aveva un fenotipo biochimico borderline (MCV
79,8fl, MCH 27,2pg, HbA2: 2.9, HbF: 0.6, globuli rossi
5,11x106/ul, Hb 12,8 g/dl). Solo l’analisi molecolare ha rilevato con certezza che la signora C.F. risultava essere fenotipicamente alfa2-TAL (-α/αα) per la presenza della mutazione “alfa2 init.Cd(T>C) NcoI”. Nell’eventualità, come nel
nostro caso, che vi sia una coppia in cui un coniuge risulta alfa2-TAL (-α/αα) e l’altro alfa1-TAL (--/αα), occorre informare la coppia circa la possibilità di concepire un nascituro con emoglobinosi H (HbH). Lungi dagli autori l’idea
di sottoporre a diagnosi prenatale coppie a rischio di generare bambini con HbH; invece, va sottolineata l’importanza di un attento studio dei parametri ematologici e una
capillare e precisa informazione circa le implicazioni cliniche legate alle complicanze delle alfa talassemie.
The term alpha thalassemia refers to inherited disorders of
hemoglobin caused by reduced or absent synthesis of alpha
globin chains. This paper highlights that in the presence of
a alfa2-Tal (-α/αα), called the silent, the biochemical diagnosis turns out to be insufficient. In these cases, the molecular
study of alpha-globin genes is necessary for identification. In
reason of this we present the following case report. A
woman of 29 years, pregnant at 12a weeks, arrived at our observation to undergo prenatal screening test for Down and
Edwards syndromes (bitest). The medical history of the couple revealed that both had doubts haematological indices:
Mr. T.G. had a biochemical framework related to alpha1-Tal
(MCV 58.8fl, MCH 19.8pg, HbA2: 1.9, HbF:0.4, erythrocytes
6.58x106/ul ed Hb 13g/dl), which was confirmed by molecular analysis (genotype alfa0-20.5Kb). Particular difficulties of
interpretation presented the C.F. patient who had a biochemical phenotype border line (MCV 79.8fl, MCH 27.2pg,
HbA2: 2.9, HbF: 0.6, erythrocytes 5.11x106/ul, Hb 12.8 g/dl).
Only molecular analysis has found with certainty that Mrs.
C.F. appeared to be phenotypically alpha2-TAL (-α/αα) for
the presence of the mutation“alfa2 init.Cd(T>C) NcoI”. In the
event, as in our case, there is a couple where one spouse is
alpha2-TAL (-α/αα) and the other alpha1-TAL (--/αα), must
have to inform the couple about the possibility of conceiving a child with hemoglobin H (HbH). Far from the authors
refer to the idea of prenatal diagnosis for couples at risk to
bear children with HbH, but it is worth highlighting the importance of a careful study of the blood parameters and an
extensive and precise information about the clinical implications related to complications of alpha thalassemia.
Parole chiave. Alfa talassemia, α2-TAL, α1-TAL, HbH, Hb Bart’s.
Key words. Alpha-thalassemia, α2-TAL, α1-TAL, HbH, Hb Bart’s.
Introduzione
Dalle varie combinazioni di questi due quadri
genici α0 e α+ si hanno i quattro fenotipi dell’alfa
talassemia: HbH, Hb Bart’s, α2 Talassemia (α2
TAL), α1 Talassemia (α1 TAL)2,3.
La malattia da HbH è caratterizzata da un deficit di sintesi di alfa catene molto marcato. La sintesi di catene alfa non riesce a saturare le catene
beta in eccesso le quali si legano formando il tetramero β4 (HbH), molto instabile, che precipita
nell’eritrocita (corpi di Heinz).
Le alfa talassemie sono causate da alterazioni
genetiche a carico dei geni deputati alla produzione delle catene alfa dell’emoglobina.
Per quanto attiene la trasmissione familiare a seconda se si ha la compromissione di un gene o di due
geni alfa si parlerà di α+ (genotipo: -α/αα) o α0(--/αα,
o -α/-α)1. Tale difetto si tradurrà in parziale o del tutto assente sintesi delle catene α globiniche.
Summary. Importance of the molecular diagnosis
in the screening of alpha-thalassemia.
1
Laboratorio di Genetica Medica; 2Laboratorio di Patologia Clinica ed Analisi di Laboratorio, Presidio Ospedaliero Madonna
delle Grazie, Matera; 3Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Presidio Ospedaliero Vito Fazzi, Lecce; 4Dipartimento di Ostetricia
e Ginecologia, Clinica Santa Maria, Bari.
Pervenuto il 24 marzo 2011.
D. Dell’Edera et al.: Importanza della diagnosi molecolare nel riconoscimento delle alfa talassemie. Descrizione di un caso
Materiali e metodi
La malattia da HbH è la forma clinicamente di
tipo intermedio dell’alfa talassemia e geneticamente deriva dalla doppia eterozigosi α0/α+ (--/-α).
Delezione o mutazione di tutti e quattro i loci α
costituisce la più grave forma di α-talassemia ed è
associata ad idrope fetoplacentare4. Non essendovi sintesi di catene α, il prodotto del concepimento
non è vitale, è idropico e presenta solamente tetrameri γ4 (Hb di Bart’s) e β4 (HbH). Geneticamente è una omozigosi α0.
La delezione o mutazione di due loci α (--/αα o α/-α) porta come effetto fenotipo allo sviluppo della forma denominata “α1-TAL”. Il deficit di sintesi
non è molto elevato da causare la malattia, trattasi, infatti di portatori sani. Il quadro ematologico è
caratterizzato da anemia, microcitosi e ipocromia
che sono però di grado lieve. Questa condizione è
spesso scambiata con un deficit marziale e trattata in modo inappropriato con ferro.
Lo stato di portatore silente deriva dalla delezione o mutazione di un solo gene α-globinico e come conseguenza fenotipico porta allo sviluppo della forma denominata “α2-Tal” (-α/αα) e non mostra alcun segno ematologico o clinico rilevabile.
Questa ultima condizione viene il più delle volte
misconosciuta a causa della normalità del quadro
biochimico-ematologico. La diagnosi certa di α2TAL richiede lo studio molecolare dei geni alfa
globinici5,6.
L’α1-TAL può essere sospettata in base alla diminuzione del volume corpuscolare medio (M.C.V.)
e del contenuto medio di emoglobina (MCH) del
globulo rosso; l’HbA2 è normale o diminuita; anche
in questo caso la diagnosi di certezza si può avere
solamente dallo studio molecolare dei geni alfa globinici.
La tabella 1 riassume l’aspetto fenotipico delle
varie forme di talassemia.
Il presente lavoro vuole sottolineare come l’individuazione di soggetti α2-Tal presenta particolari difficoltà interpretative valutando solamente il
quadro biochimico-ematologico. Inoltre, l’individuazione di coppie in cui un soggetto è α2-Tal e l’altro α1-Tal, impone una corretta informazione circa
il rischio concreto che tali coppie possano generare
figli con emoglobinosi H.
Su richiesta ginecologica è pervenuta alla nostra osservazione una donna di 29 anni, gravida alla 12a settimana, per sottoporsi al test di screening prenatale del I
trimestre per la sindrome di Down e di Edwards (bitest).
Dall’anamnesi effettuata alla coppia, si evinceva che
i coniugi presentavano indici ematologici dubbi. Per i
motivi suddetti si è proceduto alla ripetizione dei seguenti esami in entrambi i coniugi: studio della morfologia eritrocitaria su striscio a fresco; esame emocromocitometrico mediante analizzatore Sysmex XE 2100 (Dasit, Cornaredo, MI); valutazione delle frazioni emoglobiniche mediante sistema High-Pressure Liquid Chromatography (H.P.L.C.) Tosoh G7 [Tosoh Bioscience S.r.l., Rivoli (TO)]; dosaggio sideremia e ferritinemia.
Inoltre, su entrambi i coniugi, si è proceduto allo studio dei geni α globinici e alla ricerca della mutazione
δ+cod.27(GT)7.
Per far ciò sono stati utilizzati campioni di sangue
raccolti in EDTA-K3. L’analisi molecolare eseguita comprendeva i seguenti passaggi:
1. Isolamento del DNA partendo da 25µl di sangue
utilizzando kit di estrazione della Promega Italia S.r.l.
(DNA IQTM System, cod.C6701).
2. Amplificazione in multiplex delle sequenze di interesse per i geni α globinici.
3. Rilevazione degli amplificati mediante “Ibridazione inversa non radioattiva su striscia”: l’amplificazione
e l’ibridazione inversa su striscia è stata ottenuta utilizzando il kit della Nuclear Laser Medicine (MI)(cod.
AC028). Il test genetico è volto all’accertamento della
presenza di 21 diverse mutazioni nei geni α-globinici. Le
mutazioni studiate sono elencate nella tabella 2.
4. Amplificazione, seguita da digestione enzimatica,
per la ricerca della mutazione δ+cod.27(GT) (sostituzione di una singola base nel codone 27 del primo esone del
gene δ). L’enzima di restrizione utilizzato è il HaeIII (BioLabs- New England). Il prodotto così ottenuto viene sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio (3%) in tampone TAE 1X e colorazione con bromuro di etidio.
5. Amplificazione, seguita da digestione enzimatica
per la ricerca della singola sostituzione nucleotidica nel
codone d’inizio del gene α: α2init.Cd(TC)NcoI (mRNA:
codone di inizio AUG corrisponde sul DNA a TAC, se la
C è sostituita da una T avremo che da TACTAT; in
questo modo l’aminoacido metionina sarà sostituito dall’isoleucina). L’enzima di restrizione utilizzato è NcoI
(BioLabs ñ New England). Il prodotto così ottenuto viene sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio (3%) in
tampone TAE 1X e colorazione con bromuro di etidio.
Tabella 1.
Fenotipo
Hb
MCH
MCV
HbA2
HbF
HbH
Hb Bart’s alla nascita
α2TAL
N
N¯
N¯
N
--
--
1–2%
α1TAL
N
¯
N¯
N¯
--
--
5 – 10%
M. da HbH
¯
¯
¯
¯
--
pres.
20 – 40%
Hb Bart’s
N= normale
IDROPE FETO-PLACENTARE
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Tabella 3. Indici ematologici del signor T.G.
Tabella 2.
Test strip A
Posizione
Mutazione
-3.7
Singola delezione
-4.2
Singola delezione
-20.5Kb
Doppia delezione
--MED
Doppia delezione
--SEA
Doppia delezione
--THAI
Doppia delezione
--FIL
Doppia delezione
α1 cd14
G>A
α1 cd59
G>A Hb Adana
Anti-3.7
Triplicato a
α2 int cd
[T>C]
α2 cd 19
[-G]
α IVS 1
5nt
α2 cd 59
[G>A]
α2 cd 125
Eritrociti
Test strip B
Hb
MCV
Esito
Unità
6,58 Valori di riferimento
106/µl
4,0 – 5.10
13
g/dl
11,8 – 15,1
fl
80 – 98
58,8 MCH
19,8 pg
27 – 32
HbA2
1,9
%
< 3,0
HbF
0,4
%
< 1,0
Sideremia
107
Ferritinemia
110
γ60 – 100%
ng/ml
donne: 6 – 81
uomini: 30 - 250
Tabella 4. Indici ematologici del signora C.F..
Esito
Unità
Valori di riferimento
Eritrociti
5,11
106/µl
4,0 – 5,10
[T>C] (Hb Quong SZE)
Hb
12,8
g/dl
11,8 – 15,1
α2 cd 142
[T>C] (Hb Constant Spring)
MCV
79,8
fl
80 – 98
α2 cd 142
[T>A] (Hb Icaria)
MCH
27,2
pg
27 – 32
α2 cd 142
[A>T] (Hb Pakse)
HbA2
2,9
%
< 3,0
α2 cd 142
[A>C] (Hb Koya Dora)
HbF
0,6
%
< 1,0
α2 poly A-1
[AATAAA>AATAAG]
Sideremia
96
Ferritinemia
290
α2poly a-1
[AATAAA>AATGAA]
γ60 – 100%
ng/ml
donne: 6 – 81
uomini: 30 - 250
Risultati
Discussione
Gli indici ematologici del signor T.G. sono riportati
nella tabella 3, mentre i valori ematologici della signora
C.F. sono riportati nella tabella 4.
Dall’analisi molecolare dei geni α globinici, si evince
(figura 1) che il signor T.G. risulta essere fenotipicamente α° (--/αα) in quanto presenta una delezione
20.5Kb che determina la perdita di due geni , d’altro canto la signora C.F. risulta essere fetonipicamente α+ (α/αα) in quanto presenta una singola sostituzione nucleotidica nel codone d’inizio del gene α [α2 init.Cd
(TC)NcoI] che determina la perdita di un gene α ed un
fenotipo α+ (figura 2). Nelle figure 3 e 4 si riportano i risultati ottenuti delle amplificazioni seguite da digestione enzimatica con gli enzimi HaeIII per il gene δ e NocI
per il gene α. Dalle corse elettroforetiche si deduce che
entrambi i coniugi non presentano la mutazione
“δ+cod.27(GT)” (figura 3). Per quanto riguarda la mutazione “α2 init Cd(TC) NcoI” si osserva, come già visto nella reverse dot blot, che il signor T.G. risulta negativo, mentre la signora C.F. presenta la mutazione (figura 4).
Dall’analisi dei dati si evince che il fenotipo del
signor T.G. risulta essere di facile individuazione
per le particolari caratteristiche ematologiche riscontrate (MCV, MCH, HbA2: 1,9, globuli rossi
al di sopra della norma), le quali sono state confermate dall’analisi molecolare, che ha messo in
evidenza il genotipo α0-20.5Kb associato al fenotipo
biochimico α1-TAL.
Difficoltà interpretative ha presentato la signora C.F. in quanto aveva un fenotipo biochimico borderline (MCV poco al di sotto della norma e MCH,
HbA2, HbF, globuli rossi ed emoglobina nella norma). Tale quadro risulta essere di difficile interpretazione alla luce della quasi normalità degli indici
ematologici. La presenza di una modesta microcitosi, associata a frazioni emoglobiniche normali e alla presenza del marito con α1-TAL e al fatto che la
signora era gravida alla 12a settimana ci ha spinti
ad attuare lo studio molecolare dei geni α globinici.
D. Dell’Edera et al.: Importanza della diagnosi molecolare nel riconoscimento delle alfa talassemie. Descrizione di un caso
In questo modo siamo riusciti a rilevare che la suddetta risultava essere fetonipicamente α+ detta anche α2-TAL (-α/αα) per la
presenza della mutazione
“α2 init.Cd (TC) NcoI”
che determina la perdita
di un solo gene α.
Solo un attento esame
dei parametri ematologici,
ponendo particolare attenzione all’MCV, permette di
evidenziare quelle forme di
talassemia che, generalmente, rimarrebbero misconosciute.
In questi casi la diagnosi molecolare risulta
l’unico mezzo in grado di
riconoscerle.
Conclusioni
Figura 1. Dall’analisi delle reverse dot blot si
evince che il signor T.G. presenta una delezione di 20.5Kb che determina la perdita di
due geni α ed un fenotipo α0.
Figura 2. Dall’analisi delle reverse dot blot si
evince che la signora C.F. presenta una singola sostituzione nucleotidica nel codone
d’inizio del gene α: α2init.Cd (TC) NcoI che
determina la perdita di un gene α ed un fenotipo α+.
Il caso da noi descritto
dimostra come, di fronte
a soggetti α2-TAL, il solo
screening biochimico possa risultare insufficiente.
L’identificazione delle cosiddette “forme silenti” pone implicazioni cliniche ed
etiche importanti per quanto riguarda l’approccio alla
diagnosi prenatale. Risulta
indispensabile quindi una
esatta individuazione del
portatore sano, con successiva indagine approfondita
nei riguardi del coniuge.
Nell’eventualità, come
nel nostro caso, che vi sia
una coppia in cui un coniuge risulta α2-TAL (-α/αα) e
l’altro α1-TAL (--/αα), occorre informare la coppia
circa la possibilità di concepire un nascituro con
emoglobinosi H.
Lungi dagli autori l’idea
di sottoporre a diagnosi
prenatale coppie a rischio
di generare bambini con
HbH; va sottolineata l’importanza di un attento studio dei parametri ematologici e di una capillare e precisa informazione circa le
implicazioni cliniche legate
alle complicanze delle talassemie.
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Figura 3. tracciato elettroforetico ottenuto dopo amplificazione
e digestione con enzima HeaIII per la ricerca della mutazione “δ+
cod.27 (GT)”. In presenza della mutazione l’enzima HeaIII taglia
il frammento amplificato in tre pezzi, in assenza della mutazione
l’enzima taglia il frammento in due pezzi. Pozzetti 1 e 4: Dna amplificato e digerito della signora C.F., assenza di mutazione nel gene δ (presenza di due bande elettroforetiche). Pozzetti 2 e 5: Dna
amplificato e digerito del signor T.G., assenza di mutazione nel
gene δ (presenza di due bande elettroforetiche). Pozzetti 3 e 6:
Controllo positivo (presenza di tre bande elettroforetiche).
A tal proposito, lo studio molecolare del difetto
genetico ha permesso di individuare coppie a rischio per talassemia intermedia e di assumere una
informazione più completa e corretta circa l’eventuale nascita di un figlio affetto da HbH.
Bibliografia
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3. Liang ST, Wong VC, So WW, Ma HK, Chan V, Todd D.
Indirizzo per la corrispondenza:
Dott. Domenico Dell’Edera
Presidio Ospedaliero Madonna delle Grazie
UOS Dipartimentale Laboratorio di Genetica Medica
Via Montescaglioso
75100 Matera
E-mail: [email protected].
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Figura 4. tracciato elettroforetico ottenuto dopo amplificazione
e digestione con enzima NocI per la ricerca della mutazione “α2
init.Cd (TC) NcoI”. In presenza della mutazione l’enzima NocI taglia il frammento amplificato in tre pezzi, in assenza della mutazione l’enzima taglia il frammento in due pezzi. Pozzetto 1: Dna
amplificato e digerito della signora C.F., presenza della mutazione α2 init.Cd (TC) NcoI (presenza di tre bande elettroforetiche).
Pozzetti 2, 3 e 4: Dna amplificato e digerito del signor T.G., assenza di mutazione α2 init.Cd (TC) NcoI nel gene α (presenza di due
bande elettroforetiche).
4.
5.
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