biosensori: ricerca, sviluppo e applicazioni in

RT/ PAS18918
G. PALLESCHI, M. PiZZlCHNL A PLLOTON, O. CREMiSINL S. CHAVARIN
BIOSENSORI: RICERCA, SVILUPPO
E APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO,
INDUSTRIALE E AMBIENTALE
COMITATO NAZIONALE PER A RCERCA E PER LO SVI
) DELL*RIA NUCEAE E DELL
L IERG ALTRNAP’JE
ISSN/O39363O9
COMIThTO NAZIONALE PER LA RICERCA E PER LO SVILUPPO
DELLENERGIA NUCLEARE E DELLE ENERGIE ALTERNATIVE
BIOSENSORI: RICERCA, SVILUPPO
E APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO,
INDUSTRIALE E AMBIENTALE
Il Università di Roma
ENEA
ENEA
-
-
-
G. PALLESCHI
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche
M. PIZZICHINI, R. PILLOTON
Dipartimento Tecnologie Intersettoriali di Base, Centro Ricerche Energia Casaccia
C. CREMISINI, S. CHIAVARINI
Dipartimento Protezione Ambientale e Salute dell’Uomo, Centro Ricerche Energia Casaccia
Testo
pervenuTo
neiiane 1989
Progetto Enea: Studi sulla protezione dell’ambiente (EA)
contu t tecnc se ti
‘oec.c ano opnont d g au o e no
purt €ni d Enta
ss
e t ueN’ deN’en
Riassunto
La possibilità di coniugare l’elevata specificità di sistemi biologicamente attivi
(enzimi, anticorpi, componenti di membrana, batteri, cellule, tessuti viventi animali o
vegetali) con la sensibilità e praticità dei metodi elettrochimici di analisi (potenziometrici ed
amperometrici), ha aperto alla ricerca un fertile campo di indagine e portato allo sviluppo di
applicazioni di rilevante interesse sia teorico che applicativo industriale.
Le stesse caratteristiche costruttive di un biosensore sono alla base della specificità
del sistema e rendono possibile l’estensione a semplici sistemi in flusso continuo permettendo
quindi il monitoraggio e l’automazione di apparecchiature biochimiche cliniche e di processi
biotecnologici.
in questa rassegna vengono illustrate alcune interessanti applicazioni in campo medico
(determinazione di glucosio, urea, creatinina, proteine, ormoni, lattato, piruvato), industriale
(unità sensibili per il controllo automatico in impianti di smaltimento di rei lui di caseificio,
determinazione “on line” del glucosio prodotto dalla idrolisi del cellobiosio realizzata con un
bioreattore cellulare) e nel settore agro-alimentare (determinazione di glucosio ,lattosio ed
acido lattico nel latte, determinazione della lecitina in vari alImenti).
Viene inoltre presentata una possibile applicazione (sistemi di analisi per pesticidi
organofosI orici) nel settore dell’analisi di microinquinanti organici nell’ambiente con la
possibilità di indicazioni di tipo tossicologico e di identificazione di indici di rischio”.
la rassegna è corredata di una bibliografia “di base” per l’approfondimento
dell’argomento proposto,
-
The possibility 01 coupling the high specificity 01 biologically active systems
(enzymes, antibodies, membrane components, bacteria, cells, living animai and vegetal tissues)
with the sensitivity and easiness or handling o! electrochemical..(potentiometric and
amperometric) analytical methods, opened a fruitful investigation field to the research and
carried to the development of interesting theoretical and applied-industrial applications.’
The structural features themselves are the base br the biosensor specificity, enabling
their application to simple, continuous 1 10w systems, in the monitoring and automation or
biochemical instrumentation or biotechnological processes.
This report reviews some interesting applications in the medical (determination o!
glucose, urea, creatinine, proteins, hormones, ‘lactate, piruvate), industrial (sensing units
• dedlcated to the automatic control ot waste treatment plants in dairies, on line determination 01
glucoèe from the hydrolysis or cellobiose in a cellular bioreactor) and alimentary i ield
(determination o! glucose and lactic acid in milk, dettrmination o! lecitine in food-stuff s).
The report shows a possible application (analyticai systems Ior organophosphorous
• pesticides) in the field or environmental analytical determination 01 organic micropollutants.
The proposed biosensors could also give a broad toxicological information, useful to the delinitton
o! a “risk index”.
The report comprises a “basic” bibliography, a valuabie help I or a deeper insight in
the topics treated herein.
a
7.
i
pag.
3
1)
introduzione
2)
CaratterIstiche generali dei biosensori
4
3)
immobilizzazione di ‘mediatori biochimici’
11
3.1
immobiiizzazione di enzimi attranerso retzloni
chimiche
14
3.1.1 Le reazioni di Immobilizzazione
14
3.2
Membrane poiimeriche
23
4)
Rppiicazioni dei blosensori
25
4.1
.nieocotm
26
4.1.1 Determinazione di Glucosio ed Urea nei sangue
26
4.1.2 Determinazione della Creatinina è deiie Proteine
28
4.1.3 Determinaziòne di Ormoni
31
4.1.4 Determinazione di Giucosio, Lattato e Piruuato in
pazienti diabetici
33
4.2
36
4.2.1
36
Smaitimento di retiui di caseiticio
4.2.2 Determinazione Non iine dei Glucosio prodotto daiia
idrolisi dei ceilobiosio realizzata con un bioreattore
ceiiuiare
43;
...
9
47
43
4.3.1
Determinozione cli Glucosio, L8ttosio ed Ficido Lattico
nel latte
47
Conclusio
6)
Bibliogrefia
66
L©©’ ra© [
J©©E1 Liì1 ©iL
©i©©
i) JjROUZIONE
Le possibilità di applicazione di mediatori biochimici accoppiati
con sensori elettrochimici sono state da tempo Individuate e studiate.
Negli ultimi anni le realizzazioni di sistemi funzionali ed
effidabili si sono moltiplicate, purtuttauio ancora vastissimo sembra il
campo dl indagine a disposizione.
in questa rassegna vengono proposte alcune Interessanti
applicazioni e presentate le aree di sviluppo più promettenti.
Vengono inoltre accennate quelle che, a nostro avviso,
potrebbero essere le possibilità di accoppiamento con altre tecniche
analitiche per garantire, oltre alla accuratezza e sensibilità, anche una
elevata specificità di questi sistemi.
A
2) CARRUERIST1CHE GENERALI DEI B1OSENSORI
Un biosensore può essere definito come raccoppiamento di un
sistema biologicamente attivo immobilizzato, con un trasduttore di
segnale che converte il segnale biochimico in uno analiticamente
quantificablie e praticamente utilizzabile.
Generalmente li materiale biologicamente attivo è rappresentato
da un enzima, PIÙ enzimi, anticorpi, componenti di membrane, batteri,
cellule, tessuti viventi animali o vegetali. Questi sistemi sono i
responsabili del riconoscimento della specie che si vuoie misurare e
quindi deiia specificitò dei sensore che si vuole assembiare. li
segnaie-prodotto che scaturisce daiia interazione di questi sistemi
bioiogicI con i’anaiita può essere un composto chimico ed allora li
sensore sarò di tipo eiettrodico (eiettrodi, semiconduttori, ecc...). Se
invece li segnaie è di tipo caiorlco li sensore sarò un termistore. Se li
segnale è dl tipo luminoso si avrò un sensore ottico. Se infine il sistema
genera onde sonore si utiiizzerò un sensore acustico.
Questi sensori possono essere più o meno selettlvi per la specie
generata dalia reazione biologica; tanto più li sensore sarò selettivo
per la specie prodotta dai sistema biologico tanto più li biosensore
sarò affidabile.
i blosensori che oggi offrono le migliori garanzie di senslbllltò e
seiettivitò sono queiii di tipo eiettrochimlco. (1-3)
Questi sensori sono stati chiamati, In un recente Convegno
tenutosi a Park Cito 1W negli USR, superprobes, proprio per indicare li
nuovo tIpo di sensori che possono misurare con sensibliitò eievatisslme
alcune specie chimiche di particoiare interesse nella comunitò
scientifica biochimica e medica.
i biosensori eiattrochimici stanno dunque avendo una larga
appilcazione in campo medico, Industriale ed aumentare e sono i soii
attuaimente ad essere stati utiiizzati per scopi pratici. Molte industrie
dedicano parte della loro ricerca aiio sviluppo e appiicazione del
blosensori eiettrochimici e glò sono stati messi in commercio da
industrie americane, inglesi, francesi e giapponesi strumenti anaiitici
che utilizzano biosensorl per ia determinazione del glucosio e
dell’acido lattico.
Questi biosensori sono generalmente elettrodi a membrana
accoppiati con mediatori biochimici quali enzimi Immobllizzatl e
recentemente anche antlcorpi, batteri e tessuti viventi altamente
specializzati; ia selettivitò degli elettrodi e ia specificitò dei medIatorI
convertono spesso una determinazione chimica altrimenti
b e
o
o r la s rnpF e opero br e d u a mis ra elettr co.
!n Fg.
e schemolcmnte inaicoto li principio base del
biosensori e!ettrochImc. o illustriamo ctendo esempio classico del
sensore omperometrico o gfticosio di Clark e Lgons che per primi, nel
1962, lo realizzarono (1). Come tutti biosensori ero costituito di due
porti: quella molecolare cli riconoscimento realIzzata con lenzima
glucosio ossidosi (60.0) e quello per io trosduzione del segnale
effettuata da un sensore per I ossigeno.
Venzima catalizza fo seguente reazione:
p
Glucosio ÷ 2
GOD -> Ficido gluconico
÷
0
2
H
il segnale di corrente, dovuto allo diminuizione dell’ossigeno, è
correlato alla concentrazione cli glucosio.
Fig.
Schema di un biosensore
À
elettrodo
a membrana
sostanza da determinare
• prcdottc eletiroattivo
O
aHri prodoth
O
LÀ
strato
biocatalitìco
o
/
i
corpo della
soluzione
i
0 +1
la reazione base di un mediatore biochimico è in genere una
reazione enzimetico; queste sono infatti motto specifiche, si verificano
solo su determinati substrati, avvengono in modo assai rapido e
generano o consumano nel loro evolversi specie chimiche che possono
essere selettivamente rivelate dai sensori elettrochimici con elevata
sensibilità,
Nella tabella I sono elencati una serie di substrati di interesse
biologico, chimico e farmaceutico che negli anni hanno costituito
oggetto di ricerca per la realizzazione di “biosensori specifici’.
Fissando l’attenzione sui tipo di sensore elettrochimico
utilizzato, troviamo appunto alcuni sensori potenziometrici (elettrodi o
vetro. o clanuroad ommoniocoì, alcuni sensori a gas potenziomtritI
6
di i sensori
(sensori per ammoniaca ed anidride carbonica); quin
per acqua
amperometrici come l’elettrodo di Ciark (02), i sensori
flg/RgCi) e
ossigenata (catodo dl platino poierlzzato a + 600 mu in.
’
4
catodi dl grafite per la riduzione dei NAD
i tipi di mediatore biochimico che
tati
Nelle tabelle 2 sono ripor
Infetti non
sono stati utilizzati, in ordine dl crescente complessità;
etto “crudo”
sempre è sufficiente o possibile utilizzare i’enzima cosid
‘I
7
TBBELLR I
Ricuni substrati che possono essere convertiti in specie chimiche
individuate da sensori amperometrici e potenziometrici.
ofle2nft®
cmtmDOm2®rm
ocOw ono®rm
Urea
Ureasi
3
NK
gas
membr.iiquida
Giucosio
Giucosioossidasi
Oz
tiaric
11202
anodo piatino
Saiattosio
Gaiattosioossidasi
IIzOz
anodo platino
flmigdalina
fr-giucosidasi
CN
ISE
Coiesteroio
Coiesteroioossidasi
Ciark
Proteine
Proteasl+L-aminoac. os. MI
3
gas
Rc. Rscorbico
Rscorbatoossidasi
Ciark
Lattato
Lattatoossidasi
Oz
Ciark
Ricooldeidrogenasi
NRDH
catodo
Penicillina
Penicillasl
11
vetro
Ossalato
Ossaiatoossidasi
2
CO
gas
• Rlcooi
•
-•
i’
9.
TRBELIR 2
Tipici 8ccoppi&flefltl dl bioCt8liZZt2t0rl e sensori elettrochltTìlti
fl1T
rct
ISE 1iquid
tiree
Enzlmo ureesi
Gtuto!ThtO
Sequenzo enzimi
2
CO
gos
SccrosIO
SeqUeflZ enzimi
02
Clork
Glutmmifl8
Mitocondri del tes.ren1e
3
NH
gos
Cisteino
Cellule batteriChe
S
2
H
gs
Glucosio
Lievito
2
02, Co
Clrk, gs
fldenoSifl
monofOSftO
Tessuto muscoIre
del coniglio
3
NH
800
FunghI, btter1
02
ges
RmIgd&lfl
Tessuto stomcO lumoc
CN
ISE
G1ut8mmifl
Tessuto rene melale
3
NH
gas
H
0
2
OrmOflI
Tessuto fegato ultellO
02
Clark
GlutammotO
Tessuto vegetale
2
CO
gas
)
aivolta p u d un enzima e necessario alla trasformazione di una
le
•Deiabile dai .unsore elettrochimico
spe
il caso piu semplice è quello dei saccarosio dove sono necessari
ben tre enzimi in sequenza per ottenere una relazione tra li saccarosio
e i’ossigeno disciolto in soluzione:
Saccarosio
anvertasi———-> an—Giucosio
aO-biucosio -----mutarotas
30-Glucosio
1e>
+
Fruttosio
DO-Glucosio
GoD----> Acido Gluconlco
+
11202
Aitri casi riguardano enzimi iabiii, che invece, se usati in
ambiente più adatto (mitocondri, membrane cellulari, batteri, tessuti
interi), sono molto più stabili; il tempo di vita è infatti un parametro
molto importante nella realizzazione di un sensore biochimico.
Sii esempi riportati nella tabeiia 2 sono li frutto di iunghe
ricerche che hanno portato a tipi dl mediatori biochimici differenti.
Alla base cè sempre una reazione enzimatica, ma spesso
i’enzima non è usato come taie, in forma iiofiiizzata, ma in un
ambiente dove è ‘protetto per ia presenza di altri cofattori, altri
enzimi e dove il tempo di vita è più lungo.
interessante è per esempio li paragone rappresentato neila Fig.
2 tra diversi tipi di biosensori, ii mediatore biologico dei quali è la
giutaminasi, un enzima demolitore della giutamina in ammoniaca.
Si possono usare diverse “preparazioni”, diversi “mediatori
biochimici”; ia reazione enzimatica è sempre la stessa , ma la forma
nella quaie in pratica si realizza l’accoppiamento con l’elettrodo ad
ammoniaca influenza molto li tempo di vita dei sensore.
Basta d’aitra parte osservare la tabeila 2 per notare come i
ricercatori abbiano avuto molta fantasia nel selezionare alcuni
catalizzatori moito particoiari.
Neiia tabella sono inclusi solo alcuni esempi dei lavori realizzati
negli ultimi anni, ma questi danno una idea abbastanza precisa dei
ventaglio delle soluzioni reaiizzabili.
La ricerca in questo campo si trova ad affrontare problemi non
indifferenti dovuti aila compiessitò dei numerosi aspetti.
(in biosensore può considerarsi infatti come un sistema-sensore
costituito da numerosi sottosistemi ognuno con differenti aspetti di
natura biologica, chimica e fisica. Lo sviluppo dei biosensori richiede
perciò interventi di ricerca a diversi iiveiii su ognuno di questi
sottosistemP l’enzima, i’immobiiizzazione enzimatica, li supporto
poiimerico, le membrane seiettive, il trasduttore elettrochimico,
__
ospetti sul quoli ovremo occosione di tornore, più o meno
diffusamente, in seguito nel testo.
CI sono poi altri problemi di carattere chimico rappresentati dal
sistemo reale che si vuole studiare: I analita nel campione reaie gli
effetti dello matrice, delle sostanze interferenti ecc..
Nell affrontare in queste pagine ciascuno di questi aspetti non si
ho Io preteso di esaurire un argomento che negli ultimi anni ho
coinvolto molti settori dello ricerca, dellindustrio e dello medicina, sì
vorrebbe invece, attraverso alcuni dei numerosi esempi reperibili in
letterature, illustrare in maniera sia pur generale il funzionamento, le
applicazioni e le potenzialità dei biosensori, accennando in taluni tosi
anche al procedimenti operativi per ottenerli.
FIg, 2
ComparazIone tra tempi di vita minimi per lo
utilizzazione dl diversi biosensorì per lo determinazione dello
glutamina,
TESSUTI
E30
/
Co
>
/
2O’
L
MITOCONDRI
*1
ENZIMA
7//i
tipo di elettrodo
Liengono qui di seguito riportati alcuni tipi cli immobilizzazIone
attraverso cui questi mediatori biochimici sono utilizzabili per I fini
analitici ai quali siamo interessati. in genere ciò è particolarmente
Importante nel caso dl sistemi basati su enzimi data la loro solubilità In
soluzione acquosa.
Non ci sono Infatti particolari problemi neirlmmoblllzzazlone dl
uno coltura batterica, In quanto le dimensioni del batteri sono tali per
cui un filtro dl cellulosa rappresenta già un favorevole supporto per la
Immobilizzazione stessa.
I metodi di immobilizzazione degli enzimi sono schemeticomente
indicati nella FIg. 3
Fig,3
Schema dl tecniche
per lo immobilizzazione
di un enzima. (rif. 3)
SUPPORTO
E
LEGAME COVALENTE
ADSOR8IMENTO
CROSS— LINKING
INTRAPPOLAMENTO
IN GEL
ME M BR AN A
=
enzima
ch lo e ltzzozione piu semplic€
ro iuest lo rot e [o StOblil
è Io Immobilizzazione fisico di quolcnc mg ai enzima sullo superficie
elettrodica, con il semplice ausilio di uno membrana do dtolisL E’ un
procedimento di tipo preliminare che permette di sapere se la reazione
8il quale siamo interessati effettivamente avviene e se 18 suo
cinetica è compatibile con i tempi di risposto del sensore scelto; essa
deve precedere sempre timmobilizzozione ottenuta con altri sistemi
generalmente di natura chimica.
Lo descriviamo per questo in dettaglio.
SI preparo un impasto viscoso mescolando t’enzima con acqua o
con un’appropriata soluzione tampone (ad esempio i mg di enzima ed i
ul dl soluzione), L’imposto così ottenuto è disteso sulla superficie
elettrodico e lo strato coperto con una membrana da dlallsl motto
sottile (20-25 u di spessore),
l’elettrodo ad enzima così realizzato è stabile per circo una
settimana purchè conservato, quando non è in funzione, alta
temperatura di 5-l0C.
Il procedimento è illustrato nelle sue fasi essenziali in Fig, 4
(rif, 1)
Fig.4
C
e
Preparazione
amigdaiina.
di
un
elettrodo
A) corpo dell’elettrodo: gli angoli
membrana sono
sezione con la
arrotondati;
ad
della
stati
fl) I mg di enzima con I UI dl acqua sono
stratificati direttamente sulla superficie;
C) membrana da dialisi di spessore 20 u
D) anello di gomma.
A
La quantità di enzima cia strotificere sulla superficie
dell’elettrodo, possibilmente piatta, oscillo intorno a 1-10 mg pari o
10-15 unItà, Lo spessore deve essere il più piccolo possibile per non
impedire la diffusione delle specie elettroattive alla superficie
dell’elettrodo e per eliminare rapidamente il substrato passando do un
campione ad un altro o concentrazione diverso.
Anche lo spessore dello membrana do dialisi deve essere lI più
sottile possibile, pur montenendo uno strutturo resIstente, SpessorI
intorno ot 30 u sono risuttoti i più oppropriotL
Lelettrodo tosi preporoto deve essere tenuto in ocqua o
soluzione tompone in modo do montenere umido lo membrono di
ceiluloso e quondo non in uso, in frigorifero per ossicurare uno più
lungo vita ol[enzima,
Questo tipo di immobilizzaziorìe è talvolta anche conveniente do
un punto di vista analitico, poichè Il processo cli immobilizzazIone non
comporta uno reazione deilenzima.
Le diminuzione di attività nel tempo è dovute o processi cli
demolizione spontaneo degli enzimi con conseguente diffusione
attraverso lo membrane da diolisi, allo degradazione spontanea degli
enzimi nello soluzione tampone durante te misure ed alle stesse
diffusione dellenzimo attraverso lo membrana.
ffThft!f!
RERZIONI CHI1lCHE
Negli ultimi anni si sono sviluppate diverse tecniche per
lrnmobiilzzare gli enzimi formando un legame di tipo covalente tra
renzima ed alcuni supporti Insolubili. Gli enzimi così legati hanno
spesso una maggiore stbi!ità nel tempo ed il legame covalente cori il
supporto non è influenzato dall’ambiente esterno (fattori quali pi-I,
forzo Ionica, tipo di substrato e temperatura)
Oggi infatti questo è il metodo più Importante di
immobilizzazione tenendo presente anche la semplicità cli alcuni
metodi cli preparazione (4 ). Il legame è ottenuto tra gruppi funzionali
dell’enzima, che non partecipano olio reazione enzimatico e che quindi
non inffuenzano Io attWità enzimatica stessa, e quelli del derivati
reattivi di polimeri insolubili.
In pratica si ottiene quasi sempre uno parziale denoturazione
dell’enzima a causo di reazioni casuali, anche perchè spesso non è ben
Individuata io parte dell’enzima che determino le suo attività
cotalitica.
Nello maggior parte dei casi la scelto deve essere
necessariamente sperimentale ma nonostante ciò, I risultati ottenuti
Invitano a proseguire nella messa a punto di questa tecnica.
Gli elettrodi ad enzima così realizzati hanno come caratteristico
peculiare uno maggiore stabilità nel tempo; si passa cioè da tempi cli
vita di 1-2 settimane per gli elettrodi realizzati con il metodo di
introppolomento precedentemente descritto, e circa 1-6 mesi (cioè un
vero ordine di grandezza).
3.1.1 LE REAZIONI Dl !MMOlLIZZfiZlONI
A tuttoggi esistono un gran numero di procedimenti di
immobilizzazione covalente degli enzimi; la ragione del proliferare di
tali metodi è dovuta essenzialmente alle diverse proprietà degli enzimi
che si utilizzano. Non bisogna dimenticare che tutti i procedimenti di
Immobilizzazione chimica modificano in modo sensibile Io struttura di
queste proteine e, se da un lato si ottiene una maggiore resistenza agli
agenti denaturonti, in certi casi si pijò assistere alla distruzione del
sito attivo con parziale o totale perdita di attività.
Appare evidente alloro che ogni enzima richiede differenti
condizioni per operare e che I esistenza di piu metodi, diversi per
15
supporti e procedimenti usati, costituisce un valido punto di partenza
per l’immobilizzazione di nuovi enzimi.
La reazione, in senso generale, consiste di due fasi: la
trasformazione o attivazione dei composto inioiubiie in un derivato
reattivo e ia reazione tra i gruppi funzionaii deii’enzima con questo
derivato.
i materiaii più comuni utiiizzati come supporti (tab. 3) sono
composti inorganici come li vetro, poiimeri naturali e sintetici come la
ceiiuiosa (6), il coiiagene (7—8), il ngion (9—10), l’agarosio (11), ia
poiiacriiamide (12) o il poiivinil aicooi (13,14,15).
Questi composti sòno attivati con opportune reazioni e quindi
fatti reagire con gli enzimi.
TRBELLR 3 Supporti insoiubiii utiiizzati per ia
insoiubiiizzòzione chimica di enzimi.
-
Poiiacriiammide
Rcido poiiacriiico
Vetro poroso
Carbossimetiiceliuiosa
Poiistirene
teiiuiosa
Rcido poiiaspartico
Rcido poiigiutammico
Ngion
Sephadesi
Sepharose
Poiivinii aicooi
Coiiagene
POL1MERi BiOCOMPRTiBiLi
Poiiuretanl
Rcriionitriie
Acetato di ceiiuiosa
Qui di seguito (Fig.5) sono riportate aicune reazioni di
accoppiemento con enzima. in genere i residui degli amminoacid!
I
adatti aiie reazioni di accoppiamento sono:
I.
16
e) gruppi emmlnlcl In «ed in E
b) leneilo tenolico delle tlroslne
e) I gruppI cerbosslllcl In e 7
d) Il gruppo ossldrlllco delle serlne
e) Il gruppo Imldezollco delle Istldlne;
dl questI I prImI tre sono I pIù comunemente usetl.
I.
N
I
E.
o
L
o
E
o
a)
E
E
o
o
o
E
a)
o.
o
o
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L)
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i
7:
I
I
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z
I
o
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b) ettiva i
e ed cc opp onerto di ocido po ccciii o
o
i
CH,=(HC
O
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/
O
2
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OH
1
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OH
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/
,
/
O
O
O
NaNO,, HCI
—C
NHG_NH,
‘NH—N,
OH
O
/
O
eC!o
2
\Hc_N
NH
OH
N=NQ
CI
c reazi ne d ottiunzione vetro ed oc opplomento con enzimi
vet o porosc.
vetro aichilamminico
3amrninopropiItrie ossilano
cr10
2
vetro—NT-!
3
)
2
(CH
+
—*
vetro-N
CHO
3
)
2
CH(CH
CHO
2 —————
vetro-N = CH(CF! )
CHO + enzima—NH
3
vetroN
CHN—enzima
3
)
2
CH(CH
vetro lchitmminico può essere convertito in vetro
8rfl8mminico f8cendolo reogire con ecido p—nltrobenzoico e
successIu riduzione
il
d) ttivQzfone ed ccoppimento dl crbossimetilceUulos
CH-OH
—OCH COOH
2
(CM C)
—-—---
iici
CONHNH
OCH
2
—
2
enzima—NH
+
CON
2
-OCH
3
-OCH 2 COOH
2
NaNO
———
—
-OCH 2 CON
CONH—enzima
2
-OCH
=
(O
3
3
(O
CO
3
3
—
:i
1!
‘-‘(o
‘I
— —
c
+
I
o
—
o
o
=
CO
CO
—o
o
==
cz
D
0
c
= o
CO
o
CO
g formazione di legami ammdicì con [ausilio dl carbodiimmìde
tra supporti nsolubiIi ed enzimi
—COOH
enzimaCOOH
2
enzima
—N11
N = C= N
—NHCO---enzima
—CONH—enzima
h) 6ttivazlone di un supporto emminico con gtutoretde
ide
CHO
3
)
2
(CH
±
—
R-N = CH(CH
2 ), dO
CHÒ
-R-N
= CH(CH ) C}-Icj
+
2
enzima
—NH —*
RN
2 3
CH(CH
)
C
11
N—enzima
4
NaBH
R-NH(CH
25
NH—enzima
22
La tabella 4 mostre inoltre gli amminoacidi coinvolti nel metodi di
immobilizzazione più comuni.
Dall’esame di quanto tino ed ore mostrato, conoscendo i slti
attivi dell’enzima, si potrò scegliere il metodo chimico più adatto per
un particolare enzima.
Questa è però ancore una strade teorica che, come spesso
avviene nella ricerca chimica, non rappresenta le sicura alternativa
rispetto aiia sperimentazione, cioè al metodo triai and error.
Tabella 4 Residui reattivi degli amminoacidi in alcuni
metodi di insoiubiiizzazione chimica
-
r®ettIn
sniniienmendlo melhmnDtfl
bc®OflOOfl®mtw
nOlIm rmnOnm
Azlde acido
Lls. Tir. Cls. Ser.
Sale dl dlazonio
Lls.
Lls.
Lis.
His.
Giutaraidelde
Lis.
Lis. 1115. TIr. 05.
Derivato isotiocienato
Lis. Rrg.
Dhimmlde
Lls. Tir. 05. Rsp. Elu.
His. Tir. firg. 05.
Hls. TIr.
Tir. flrg.
Tir.
23
3.2 MEMBRANE POL1MER1CHE
Si ere accennato nelle pagine precedenti ai sistema-sensore ed
alle sue numerose unità costituenti.
Le membrane poiimeriche che si trovano oggi sui mercato
costituiscono, insieme aii’enzima ed ai trasduttore elettrico il cuore dei
sistema-sensore poiché sono i’interfaccia, l’unione tre ii sottosistema
di riconoscimento e quello di rivelazione. Non solo quindi una funzione
di supporto, ma anche, in alcuni casi, di selezione (selettività di
membrana). E’ per questo motivo che ci soffermiamo, in questo
paragrafo, a descrivere aicune caratteristiche chimiche e strutturali
dei polimeri costituenti le membrane ed i meccanismi chimico-fisici del
trasporto attraverso di esse.
Esiste una stretta relazione tra il tipo di polimero costituente ia
membrana ed il meccanismo di trasporto. Da un punto di vista chimico
fisico è conveniente ciassificare ie matrici poiimeriche in due
categorie: omogenee ed eterogenee. Nei primo caso si hanno dense
matrici poiimeriche ed il trasporto avviene per diffusione moiecoiare
attraverso ia fase solida, nello spazio disponibile tra le catene
macromoiecoiari (10-100 A). La diffusione attraverso una membrana
poiimerica omogenea è regoiata daila iegge di Ficic, ma è opportuno
anche considerare la solubilità dei soiuto permeante nella matrice
poiimerica. Per questo motivo la natura dei soluto (dimensione delle
molecoie, interazioni elettrostatiche) e della matrice poilmerica
possono Influenzare in modo determinante la permeabilità dl una
specie.
Le matrici polimeriche eterogenee hanno invece una struttura
porosa. li trasporto dl molecole avviene attraverso i pori che possono
essere di larghezza controllata e quindi costituiscono in genere una
barriera selettiva per molecole più grandi. Per questo motivo si
propone un modello di trasporto esempilcativo a setaccio, in questo
caso le interazioni elettrostatiche tra poiimero e molecola assumono
minore importanza eccetto che per molecole di dimensioni
confrontabill a quelle del pori. La porosltà della membrana, li suo
spessore e ia tortuosità dei poro aisumono allora un ruolo importante
nella diffusione di una sostanza.
Appare evidente aiiora come ia natura del polimero, Il
meccanismo di trasporto, la microstruttura deiia membrana, i gruppi
reattivi presenti, possono giocare ruoli determinanti ai fine di una
maggiore seiettivit4 del sistema analitico, o dell’attività dei mediatore
biologIco o ancora della sua stabilità.
Le tecnologia di membrana hanno trovato molteplici applicazioni
nelle separazioni industriali (uitra, micro e iperfiitrazione) ed anche
nei processi biocatalizzati dove si assiste ad uno sviluppo analogo ai
b o se n s o rt,
Bosensort e bIoreattor touorno proNeomente ne process
biotecnoogIc, gli unì per consentire trsform8zioni in continuo
procIuttiumente corìuerìienti ttroverso i! confinarnento dl
bIoctaìIzz8torl, gli itri per controllarne ed ottimizz8rne le rese
Uedremo nei seguenti porogrofi olcune opplicozioni di blosensorl
e bloreattori nel compo procluttiuo ogro—olimentore.
I
25
4)
APPLICAZIONI BEI BIOSENSORI
Le ricerca e le applicazioni di laboratorio hanno consentito uno
sviluppo del sistema blosensore lino ella lese dl applicazione pratI
ca
In diversi campi. E’ ovvio che l’applicazione di un sistema molto
partiColare e sensibile come Il biosensore, le cui variabili sono state
discusse in precedenza, richiede una approfondita analisi delle
condizioni al contorno nelle quali si vuole realizzare il monitoragglo
.
Standardizzazione delle condizioni dl misura, effetto degli interferen
ti,
sensibilità dei metodo, misura in flusso, basso costo del
“probe”,
risposta In tempo reale, calibrazione kapida e sempiice, sono
solo
alcune delle specifiche richieste ai biosensori ippiicati In campo
biomedico o industriale. Le caratteristiche richieste ad un
sensore
possono cambiare da settore a settore dl applicazione, tosi, acca
nto
alla specificitò, sensibilità, accuratezza e precisione possono esser
e
importanti, soprattuto nel campo medico, caratteristiche come
la
5 teriiizzabiiità, la biocompatibiiità e la miniaturizzazione.
In altri settori, come quello del controllo dei processi
biotecnoiogici, la stabilità e la lunga durata del sensore sono in
certi
casi più rilevanti della sensibilità e della precisione. E’ da sotto
lineare
l’importanza degli studi anailtici in un’area c.he richi
ede
specializzazioné, lavoro di equipe e interdisciplinarietò, intesa
come
capacità al dialogo con altri esperti nei campo biologico, fisico, medico
e industriale.
Con i sensori blochimici si può ritenere di essere all’inizio di una
nuova ed assai promettente fase nella ricerca sui campo specifico
dei
sensori. Per chiarire questa affermazione si possono pass
are
rapidamente In rassegna alcune applicazioni recenti che dimo
strano
l’alto grado di sofistlcazione e la creatività evidenziatl nel disegn
o dl
alcuni recenti lavori su questo argomento.
/4.
4.1 1)
li primo esempio riguarda lapplicozione olio determinazione di
glucosio ed urea nel siero del sangue.
Questa analisi è importante per valutare diversi stati patologici
sia In analIsi dl rrnjtine che in urgenza.
In queste applicazione sono utilizzati due sensori, uno a glucosio
ed uno ad urea, ossembiati insieme in un sistema o flusso continuo per
cui la determinazione di azotemio e glicemio iilene effettuate
contemporaneamente sullo stesso campione (16).
I sensori sono stati preparati immobilizzando gli enzimi
Glucosloossidasi ed lireasi su reti di Nulon e poi fissati su due sensori
commerciali ad ossigeno ed ammoniaca. Le reazioni sono:
Glucosio
Urea
+
+
1-130
02
-
G1’cDs1oossidasi--->
---urasi---->
4
2 NH
+
Rcido Gluconico
÷
11202
HC0
La attività degli enzimi immobilizzoti si è mantenuta costante
per diversi mesi permettendo un notevolissimo numero di analisi.
SI è studiato leffetto delle voriozioni di p11 sulla attività degli
enzimi e sul tempo di risposta dei sensori. Si è deciso quindi di lavorare
a pI-I 8.3 in tampone Tris 0.1 M, diluendo i sieri 1:10.
Gli intervalli dì concentrazione dei sieri diluiti sono:
Glucosio 6.5-10.5 mg/dl
urea
2.0-4.5 mg/dl
I sensori sono lineari nellinteruallo:
Glucosio 1-20
mg/dl
Urea
0.2-10 mg/cli
I risultati ottenuti mostrano buon accordo con quelli
spettrofotometrici. Lo velocità di analisi è Intorno ai 20 campionI per
ora,
Flg6
FI
C =
FI =
5 =
W=
Sistemo o flusso per i sensori o glucosio ed ureo
elettrodo o glucosio; B
elettrodo od iireo;
cello termostotico; P = pompo perlst&tlco;
potenziometro ed omperometro con registrotore;
complone do onolizzore.
scorico
4 1.2) ftflgrm1npjie dejtt(reojffiiaa
&deJJtlLQteLJfl
Un’altro applicazione clinico è io determinazione dello treatinina
(Fig. 7) e delle Proteine (Fig. 8), utilizzando sistemi o flusso continuo e
reattori contenenti enzimi immobillzzati (17-18).
Nei coso dello creotinina l’enzima creotininosi è immobilizzato su
di uno spirale di ngion. il campione do analizzare, contenente
creatinina, viene fatto passare attraverso io spirale enzimatica e
iammoniaca prodotte viene anaiizzeta con un sensore ad ammoniaca.
Per quanto concerne le proteine, io tecnico di anaiisi si articolo in
tre fasi distinte. Neiio primo si reoiizzo uno idrolisi enzimotico deiie
proteine con formazione di un miscugiio di L-omminoocidi. Per questo
fese si è utilizzata od una proteasi già immobiiizzata su agarosio e
teperibile in commercio, od una proteasi immobilizzata suiie pareti
interne di un tubo di ngion.
Gii L-amminoacidi formatisi nelia prima fase reagiscono con un
secondo enzima, io L-amminoacidoossidasi; anche in questo caso, in
maniera anaioga alla precedente, si è immobilizzato l’enzima.
Queste seconda reazione enzimatica porta alla formazione di ioni
ammonio.
Neiia terza ed ultima fase vengono determinati gli ioni ammonio
come ammoniaca mediante un sensore ad ammoniaca.
La quantità di ioni ammonio che si formano è proporzionaie alla
concentrazione proteica deiia soiuzione biologica anaiizzata ed è
proprio su questo che si baso il metodo per la determinazione di
proteine.
‘Il.
er
I•
8
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3
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mV
rnV
50
00
50
100
120
100
—-
250
500
300
AMMONIACA
Fig
8
Schema a
—
i anaiisi
100
50
diL siero
ALBUMINA
flusno continuo per
--
1000
d
proteine.
Ti = fleattore con
A = Reattore con proteasi ;
PP = Pompa peristaltica;
PR = Poten
e;
Sensor
=
E
Ti = DcgorgogHatore;
L-arninoacido .ossidasi;
ziomctro registratore.
s campione
LJnaltra applicazione clinico rguordo ruso di biosensori nello
determinazione dl ormoni con una tecnica di EIfl tEnzgme
lmmunoossoj),
Il sensore utilizzato è un elettrodo od ossigeno con
immobIlizzato uno strato di fegato di vitello (in pratico uno alta
concentrazione di cotolasi). In ti modo il sensore divento un
rivelatore di acqua ossigenato.
Locqua ossigenato inoltre non reagisce con molte sostanze
organiche direttamente, per esempio il 4—ommino-fenozone
(4-omminoontipirino), ma solo in presenza di perossidosi, per cui
questo sistemo divento un sensore di perossiclosi (Fig. 9).
Rg. 9
-
Scherno dl un biosensore per la determinazione dl ormoni.
0+1120
>H
2
—
0
2
Red+H
Ormone + Ab
Ormone—HRP ÷ Ab
0+Ox
2
>H
>
—>
Ormone—Ab
Ormone—HRP-—Ab
÷Red
0
2
H
4
sensore COn
tessuH d fegato
tDrovetta t oisIrOo) con
Daret res.te d antcorp
Competizione
(EIA)
a .ernsi.es a u on, ma trecc’e.”te de p.c’ •w raez a. di P.
L’ormone Insu me è steto determneto con questo riveletore (Fig io)
Il cempione contenente insulina vleie messo insieme ei
coniugeto con i’enzime IiRP in une provette di polistirolo sulle cui
pereti è steto previemente letto essorbire i enticorpo dell insuiine;
quindi, dopo le reezione immunochimice, i’enzime rimesto sulle pereti
dei tubo, le cui quentitò è funzione delle competizione per l’enticorpo
tre l’ormone ed il coniugeto, è steto doseto con il sensore per le
perossidesi ottenendo quindi con un blosensore une indicezione
quentitetive di un ormone in soluzione (19).
Fig. IOe) Curve di ceiibrezione con biosensore con tessuto per le
determinezione di insuiine.
Stenderd e siero dei kit Boehringer.
— stenderd
— siero ricostituito
b) Curve spettrofotometrice
/
siero
a
A
ee
—c
INSULINA
.
33
4.1.4) Determinazione di Siucosio. Lottato e Piruvato in
nazienti diabetici
La più recente oppilcezione clinico dei biosensori è io misuro dei
Glucosio, Lottoto e Piruvoto in pazienti diabetici sottoposti o cure
intensive, utilizzando il pancreas artificiale (Betoiike,
Esacontrol-GENO1lA) (20-21). Questo strumento prelevo sangue dal
paziente, analizzo il contenuto di glucosio ed in base ol risultato
introduce quantità dosote di insulina. Essendo il lottato ed il piruvato
due metoboiiti de controllore durante iinfusione di insulina, è sorto la
necessità di realizzare due sensori per questi metaboiiti, che
potessero operore in continuo, in flusso di sangue eporinizzato
eventualmente diluito, Si sono cos-i ottenuti due sensori accoppiando
un elettrodo od ossigeno con le iattatoossidasi per io determinazione
dei iattato ed un elettrodo ed acqua ossigenata con io piruvatoossidesi
per la determinazione dei piruvato.
Le reazioni sono le seguenti:
ner il iattato:
Lottato
0z
+
>
Piruvoto
+
11202
ner il ninwato:
Piruvato
+
2
4
i1P0
>
flcetiifosfeto
+
11202
+
2
CO
Sono stati eseguiti esperimenti determinando “in vivo” lottato e
piruvato in pazienti sottoposti ai trattamento con pancreas artificiaie.
Durante le misure in continuo sono stati prelevati campioni di sangue
ed li contenuto di lottato e piruveto è stato analizzato con i ciassici
metodi spettrofotometrici.
In Fig. 11 (pag. seguente) viene descritta in maniera dettagliata
questa eppiicazione ciinica. i risultati deiie anaiisi spettrafotometriche
(linee punteggiate) sono in ottimo accordo con queiii ottenuti “in vivo”
utilizzando i biosensori.
Ai tempo indicato come ST è state fatta passare attraverso la
cella, dove erano eiioggiati i sensori a latteto e piruvato, una soluzione
FIg. i!
Misuro In continuo del giucoslo lottato e plruvoto “in
vivo” durante un esperimento con il poncreas artificiale
“BETRLIKE”,
(vedi Il testo per spiegazioni ed ebbreviozioniL
o
LI,
o
D
-J
h
p
/
i
o
>
SIQo
ex
cx,
‘tepdard? attg.tn e p .uL..ta per ca. rre i b’c enari
RI tempo indicato come LRL il sensore e glucosio del Retalilce e
stato caiibrato. Durante questi periodi il flusso del sangue del paziente
veniva disconnesso del sensori.
RI tempo indicato come EH è stato chiesto ai pazIente di tare un
breve esercizio fisico, che è stato poi Interrotto ai tempo indicato
come STOPER.
RI tempo indicato come 1NFGLU un • carlco di glucosio e stato
iniettato (50 g) nei paziente in un tempo breve.
MERL indica il periodo in cui il paziente ha consumato un pasto
normale.
F interessante notare il grande effetto dell’esercizio fisico sulla
concentrazione di iattato e piruvato, seguito dai ritorno parallelo di
entrambi gli anaiiti alla concentrazione normale. Come ci si aspettava,
li carico di glucosio ha provocato una grossa variazione sulia
concentrazione di glucosio nei sangue, ma ha causato variazioni poco
apprezzabiii suiie concentrazioni di lattato e piruvato. Dopo il pasto
tutti e tre i metaboilti hanno mostrato notevoli e continue variazioni.
A)
N_.- nt
Le r,ossibi!i appiicazbni ir’dustriaii, fra le quell un cenno
particoiare merito il tempo delle biotecnoiogie, si basano
principalmente sullo misuro di parametri tisici e chimici “in situ” ed in
continuo. Da qui i esigenze di metodi non distruttivi e specifici per la
determinazione di composti bioiogici anche complessi; i’esigenza, in
oltre parnie, dei sensore capace di determinare un metaboiita in tempi
brevi con elevata affidabiiita, dando cioè un segnaie anaiitico preciso,
accurato e di elevata sensibiiitò.
Neiie pagine che seguono si cercherò di iiiustrare il ruolo chiave
dei biosensori nei controilo di alcuni processi industriaii acconto alle
potenziaiitò di particolari reattori enzimatici a fibre cave dove il
catalizzatore è confinato fisicamente per ottenere trasformazioni
chimiche in flusso continuo.
4.2.i) Smaitimento di retiui di caseificio
Nei nostro paese la grande produzione di siero di latte, vaiutata
intorno a 4-5 milioni di tonnellate/anno, crea probiemi di smaitimento
anche in reiazione alla vigente normativa di rilascio di refiui industriali
(legge Meni), il siero deiie industrie casearie, ma anche i refiui dei
settore iattlero, presentano generaimente elevato carico inquinante
(BOD 50,000 ppm) e basso valore economico per la notevole diiuizione
dei prodotto. A ciò si aggiungono aitri aspetti economicamente negativi
come i’eievato costo di trasporto, la bassa soiubiiitò dei lattosio nei
siero, la facile fermentabiiitò dei prodotto dovuta ad una elevata
carica microbica, l’invecchiamento dei prodotto etc..
L’applicazione della nuova normativa sui controiio dei refiui
industriali pone ii problema di riconsiderare, non soio da un punto di
vista ambientale, ma anche produttivo, io smaitimento, il recupero e la
vaiorizzazione dei costituenti naturali dei siero di iatte.
ii trattamento di uitrafiitrazione (UF) dei siero (22) più diffuso
nei paesi dei Nord-Europa e negli Stati Uniti che in itaiia, consente una
valorizzazione notevole dei suoi costituenti naturali. Fra questi in
particolare vanno considerate ie sieroproteine, il iattosio e i’acqua. li
iattosio si trova nei siero dilette di vacca ad uno concentrazione che
osciiia intorno ai 50 gli. La scarsa digenlbiiitò di questo disaccaride da
parte deiie popoiazioni mediterranee aduite, suqgerisce uno parziale
idrolisi dei iattosio nei due monosaccaridi costituenti (glucosio e
geiattosio). Ciò L’iene gia realizzato medien e !droiisi in ‘batch” per
perzni’ner.te edulcoYato e mano
p r” diqr.i’ilic
t
otie”re un iat
37
calorico (23).
attualmente l’impiego di tecnologie di VF e rnicrofiitrezio.ne
consente separazioni specifiche (proteine, giucidi, acqua)
da cui è
possibile un utilizzo integreto dei costituenti dei siero dilet
te. Le
Fig.12 mostre io schema generaie dei processo di trattamento dei
siero
dilette con tecnologie separative e bioeiettrodi per ii giucos
io e li
iattosio che costituiscono le unità sensibili per ii controiio auto
matico
di tutto il processo. L’VF dei siero consente di raccogiiere di raccog
liere
nei concentrato le frezione proteice e nei fluido perm
eeto
sostanziaimente lattosio, sali minerali e acque in emb
iente
parziaimente steriie poiché ie fiore batterica viene tràttenuta
daiie
membrane. Su questo permeato è possibile realizzare l’idrol
isi dei
lattosio attraverso i’impiego di un bioreattore enzimatico in contin
uo
(24). La superficie microporosa deiie membrane a fibre
cave
asimmetriche fornisce una buona opportunità per imm
obiiizzare
fisicamente enzimi o ceiiuie. Moduli commerciali da
VF (amicon,
Romicon, New etc.) sono stati utilizzati con successo a ques
to scopo
(25—26). Questo tipo di reattore, cosidetto di seconda generazio
ne, in
cui l’enzima -gaiattosidasi (iattasi) viene immobiiizzato sui suppor
to
costituito da una membrana da uitrefiitrazione (Fig.13-14), prese
nte
interessanti vantaggi pratici:
a) bassa quantità di enzima impiegato
b) reettoristica mòduiare e quindi impientistica ridotta
c) reazione in flusso continuo
d) ueioce cinetica di reazione (bassa inibizione da prodotto, nel
caso specifico gaiattosio)
e) separazione dei prodotto daii’enzima
f) controilo rigoroso dei parametri di processo.
Il
e
di
Ig
3
cher o
rot o
cJ bioreottore iot o ico
°
de !e
opporecchioture strumento!t per it controho de processo
I Soluzione di substrato (ieed)
2 Termostato
3
4
5
6
7
lo
Pompa penstaltica del feed
Modulo a fibre cave
Raccoglitore di frazioni
Crornatografo liquido (HPLC)
BoeIettrodo a glucosio
8 Voltamperometro
9 Camicia termostafica
10 Micromanometro in linea
9
i
latte
LEGENDA
feed adjustment
4)
5) bioreattore lattasico
impianto da ultrafiltrazione
3)
2) prefiltro meccanico
1) Raccolta omogeneizzatore
sedimentatore
sedimenti
siero dì
‘i
pastorizatore
recervoire di enzisa
10) caseificio
9)
8)
impianto di osmosi inversa;12) computer di gestione
lì) acquisitore dati
7)
12
senscre a glucosio
[;E
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Fig ! 4 Sezne irnc:tjdino!e d un no[Fi fibra polIsoIfonic6 cn
deposito enzirnotico e orocesso di drolisl in continuo del lotosio
(simboli in figuro)
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L_ L_P-L_
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EJEE)
qaIaltos/O
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Loso
O
DCC
(
Tgb.5 Specifiche de! modulo a fibre cave l-HPIO-20 Rmicofl
Materiale costituente le fibre: polisolfone
Materiale cli riempimento: resine epossidiche
Materiale cli rivesttmento (housing): polietilene
Molecular weight cut 0ff: nominale 10000 d&ton
Rreo superfici8le: 600 cm
2
Diametro interno delle fibre: 0.5 mm
Diametro dello cartuccia: 2.3 cm
Lunghezza dello cartuccia: 20.3 cm
Numero delle fibre: 250
Pressione massimo operativo: 1.8 Kg/cm
2
Temperatura ma operativo in continuo: 50 C
Intervallo di p11: 1.5
13
-
il consoilo ai pa ametri chimico-fisici dei processo
e di
notevole importanza per la caratterizzazione del siste
ma in esame e
per le costruzione di un modello matematico In base ai quale
risulta
possibile correlare le variabili In gioco ed ottimizzar
e li
comportamento del reattore in termini di rese (27).
Lo sviluppo di un sensore in flusso per li glucosio, posto sulle
linee dei permeato ci ha permesso di seguire il processo in contin
uo ed
in tempo reale. ii controllo on ilnew della resa del proc
esso è
importante nella fase dl ricerca e studio per consentire la correla
zione
del parametri chimico-tisici con la resa ldroiitica del proc
esso, ma
anche nella fase produttiva dove i’acquisizione in contin
uo di dati
relativi ai processo ne consente l’automazione. Questo siste
ma 6
basato suiia stessa reazione enzimatica dell’enzima 600 citat
a neiie
pagine precedenti,accoppiato con un sensore elett
rochimico per
l’acqua ossigenata (2) posto in una cella a flusso, in
figura 15 è
riportato un tracciato registrato durante una fase dei proc
esso. La
concentrazione di glucosio misurata con questo sensore in
continuo è
paragonata con queiia misurata con un metodo di
riferimento
enzimatico su frazioni di permeato raccolte ogni 90 minuti
.
tr,rìte t’jsensore
0
o
D
c’J
LQ
o
-J
O
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o
-J
0
L -; Pev.rairsJzja. : L’i LL’ie.
4
pei Sl!1SQ1iO.uIO*Qttfl
la.LItJdnl’cLjtcI csligti sJa..setlne e Jji_cpMloyo .dtsin
binxnunrtssl.Lulere..
Le tecnoloqie lnnoveth.’e basate su processi fermentetivi, sono
probabilmente quelle che, accento e tosti irrisori delle materie prime,
spesso costituite de materiali di scarto, producono sostanze pure con
un minore dispendio di energie poiché utiiineno ceppi betterici
selezionati per le trasformazione fermentatlve richieste. Un esempio è
costituito dalle degradazione enzimetice delle cellulose che fornisce
prodotti chimici essenziali come glucosio de cui combustibili e
chemicals. Inoltre le cellulose è il più diffuso composto organico
polimerlco naturale e la disponibilità In ogni parte dei mondo e la
rinnovebliltà la pongono come un materiale di notevole Interesse
energetico, anche per motivi ecologici.
Le conversione enzimetica dei ceiloblosio, un disaccaride
intermedio delle idrolisi dl materiali cellulosici, condizione le fettibilità
tecnico-economica dei processo complessivo di idrolisi fino a glucosio.
Un bioreettore ad attività ceiiobiaslce specifica applicato dopo la
fase di idrolisi in batch”, favorisce le cinetice dl trasformazione del
celioblosio (inibitore delle cellulesi) e riduce quindi li consumo di
questo enzima il cui costo incide per oltre li 607. su queiio complessivo
schematlzzato in fig. 16.
i reattori sono costituiti de fibre poilsoifoniche cave permeabili
ai reegenti ed ai prodotti me non elie cellule; il processo è condotto in
flusso continuo. L’aspetto reattoristico dei processo è dei tutto
enelogo a quello incontrato nei paragrafo precedente. Peremetri fisici
quell le velocità dl flusso, ia temperature e le pressione influiscono In
modo determinante sulle rese e sui tempi dei processo.
li probleme che si pone e chi lavora in questo settore è allora di
ottimizzare le condizioni fisiche e geometriche dei reettore seguendo
in continuo le concentrazione dei prodotto (il glucosio) delle
ferm ente zione.
Per monitorare le produzione del glucosio della cellulosa si è
studiato un biosensore per la misura dei glucosio in presenze di
ceilobiosio ad alta concentrezione (10 glI). In questo ceso si è risolto il
problema delle impurezze degli enzimi ai fine di ottenere un
biosensore specifico.
impurezze quell emilesi, maltesi, Invertasl e D-galattosidesl
normalmente presenti nelle preparezioni commercieli dell’enzima
giucosloossidesi, devono essere assenti per ottenere un
comportemento linere dei sensore a glucosio
E’ ctetn nWndi utilzzfi ner essernbie: Il er,sorc, un enzime
ti,, ,.‘rnssIds’... uiifitetc’
—., t..cjInIiz ‘p”,”e!ere ,fl
r ctt
44
continuo li glucosio prodotto dal reattore enzlmatlco a celloblasl e
confrontare i risultati con quelli ottenuti con un metodo dl riferimento
(Flg. 17) (ze).
La saccarlflcazlone enzimatlca della cellulosa appena vista ha
molte analogie con la Idrolisi degli amidi o delle pectlne. La
trasformazIone dell’amido a glucosio e l’idrolisI della pectlna ad acido
metilgalatturonico consente, in alcuni processi industriali di aumentare
Il valore aggiunto dei prodotto a beneficio dell’industria
agroalimentare.
Flg. 16
Schema di processo per ridrolisi della cellulosa,
c eitulose
bali
UF
modul e
glacose
eiecrcde
explcsicn
me
s ug a r s
REM
HF BIOREACTCR
ceLlase
y e as t
ceils
(om re one tro lo determirozione on Une del
Fq. 17
giucosio (lineo continue) ed un metodo di riferimento utiHzzeto
per cempioni pre!eueti doNefifluente e tempi determinotL
FU tempo contressegneto con uno freccle Io concentrezione del
glucosio eumento perchè H reottore uiene eflmenteto con uno
so!uzlone o concentrezione mogglore dl cefloblosio.
o
imentore
biosensori stonno trovondo
Rnc[ e nel compo
Interessonti oppilcozioni; per le loro carotteristiche dl semplicità di
uso specificità, sensibilità, occurotezzo e rapidità, le analisi condotte
con biosensori elettrochimici bene si adottano alruso in laboratori per
Il controllo di qualità degli nlimentL
4 3 1)
nel latte
ApplicazIoni recenti nei settore lattiero dimostrano come lunghe
e laboriose determinazioni possono essere condotte in breve tempo e,
in taluni casi, con maggiore accuratezza con biosensori del tipo
descritto nello porte introduttiua.
E il coso dello determinazione del lattosio (29-31), disaccarIde
presente nel lotte in concentrazioni comprese tra i! 45 ed il 5%
La determinazione analitica cli questo zucchero si pone come
utile strumento per stabilire lo freschezza di un latte o la sua
genuinità e per prevenire trattamenti fraudolenti (aggiunto di acquo o
dl lotte non fresco, conservazione e/o trasporto in autobotti non
refrigerate ecc.J.
Il controllo di questo parametro è Importante non solo al
momento dello commerciolizzazione dellolimento ma anche, e
soprattutto, al momento dello raccolto do porte delle centrali del lotte,
presso i singoli produttori,
Linuecchiomento di un lotte, dovuto ollozione dl batterI le cui
vie metobotiche utilizzano il lattosio producendo acido lattico, può
essere messo in evidenza misurando il pi-I, le concentrazioni di lattosio
e di acido lattico. L’esistenza di diversi metodi per la verifica dello
freschezza del latte è necessaria per prevenire il rischio di
adultera zio n i
A questo proposito è stato sviluppato un biosensore
elettrochimico a lattosio che costituisce un interessante esempio di
immobilizzazione asimmetrico di due enzimi su sensori elettrochimlcl.
Su di una faccia della membrana è Immobilizzato l’enzima
-golattosidosi che idrolizzo il lattosio in glucosio e galattoslo:
Lattosio
--
-f3--gaIattosidasi---’-> Glucosio
+
Galottosio
li glucosio prodotto da questo reazione diffonde allora
attraverso la membrana incon
rando un secondo strato enzimotlco
4
CJS Itu tu da g cosioossidasl che secondo lo bcn n’ta reazione,
riveloto
essere
nuò
he
ussqenotn
cndue
ocquo
r
o m p cm e t ri c o m e o te
In questo modo è stoto re&izzoto un sistemo omperometrico o
flusso per lo misuro del lottosio in compioni dl lotte; il sistemo non
ricluede, controilomente ai metodi ufficiali (titrimetrico,
spettrofotometrico) alcun pretrottomento (deproteinlzzozlone,
centrifugazione, incubazione) e consente I analisi di circo 20-30
c omploni/oro.
Poichè, come si è detto, l’azione metobolico dei batteri lattici
produce uno considerevole quantità di acido lattico (10-50 mmoli/litro)
abbassando il pli dell’alimento, l’uso di un biosensore specifico per tale
substrato (I?) del tipo descritto nello sezione 4.L4 può rappresentare
uno utile alternativa alla misura del pi-I; lo determinazione del pli
infatti è poco indicativo poichè tale parametro può essere facilmente
modificato mediante r aggiunto di bicarbonato sodico,
Nello Fig. 18 (pag. seguente) è rappresentato l’andamento dei
due parametri (pli e concentrazione dell’acido lattico) di un latte intero
nel tempo. In essa si può vedere i effetto dell’ossigeno e del pli sullo
crescita batterica ed anche che io misuro dello concentrazione
dell’acido lattico può rappresentare un metodo più sensibile e più
diretto per stabilire l’età’ di un latte.
Nello Fig. 19 è invece riportato un esempio della costruzione di
uno retta di toraturo e delle misure condotte su campioni reali,
mentre, in tabella 6 sono confrontati i risultati con un metodo di
riferimento spettrofotometrico enzimotico basato suwenzima lottato
deidrogenosi, che richiede lo deproteinizzazione del latte e lo
termostatozione a 37°C per 30 minuti per completare la reazione
enzimatica. In tabella 7 sono invece riportati i risultati di misure di
acido lattico in diverse specialità lottiero-casearie (creme di
formaggio, goghurt e lotte in polvere) (33)
Fig. 18
4
20
Campione
di
latte
fresco
Variazione
di
pH
e
lattato,
dovuta
alla
azione batterica.
Conservazione a 37°C.
STIRR
agitazione per
aumentare disponibilità
di ossigeno.
ADJ.
aggiustamento del
pH a 7,03
I
lo
1’
1’
STRR
20
h
ADJ
Fig. 19
Valori di corrente
registrati con standards
e campioni di latte
diluiti 1:200
05 nA
4 mn
caflbr I on
5
a mp o a
7
8
dUutlon)
9
50
Tabella 6
-
(concentrazione dei lattato in mmol/lltro)
campione
n
metodo nt. (Y)
biosensonl (11)
Errore?.
1
1.52
1.55
-0.7
2
1.77
1.75
+2.3
3
1.04
1.09
-4.8
4
5.69
6.10
-7.2
5
1.15
1.10
6
9.85
9.20
+6.4
7
19.60
19.10
+2.6
8
1.28
1.22
.4.7
9
1.49
1.38
+7,4
Y—-0.1
+
0.9814
-0.997
2
r
Teb elIo 7
Concentrozlone di 1-lo ttnto In siero e derivati del lette misurati con li
‘lucoprocesseur dotato dl un elettrodo o lattaio.
campione dl siero
tremo
formaggio
goghurt
semplice
(o)
polvere
ricostituita
e
dolce
acido
1.23
24.40
e
b
c
1-lottato (m?’l)
5.20
8.05
2.56
0ev, Standard
0.08
0.11
0,07
1.40
0,94
1.60
0.01
0.80
D.S.R.()
1.5
1.3
2.7
1.4
1.1
2.1
1.2
3.2
(o) soluzIone 20 g/i
Le misure sono lo medio di 6 repliche
o-b-c Indicano campioni differenti
99.0
83.7
b
80.6
lo sufluppo delle biotecnologle e delle tecnologie dl membrana ha
permesso, In questi ultimi anni, la creazione di nuove specialità
nell’industrie casearia, tra le quali il latte a basso contenuto di lattosio
ottenuto per idrolisi enzimatice dei disaccaride,
Questa specialità è un alimento e basso contenuto celorico, più
dicieribite, adatto per alimentezioni dietetiche e per particolari
individui che mostrano difficoltà digestive nei confronti del
disaccaride,
Il controllo di qualità di tele alimento è perciò un problema
analitico risoluibile con sensori a glucosio dei tipo descritto nella
sezione 4.1i.
E’ stato proposto un metodo olternetivo (1 6) per la
determinazione del lattosio, che consente l’analisi in flusso anche dei
glucosio. In questo caso l’enzima 3-golattosidasi era immobilizzato In
un piccolo reattore a fibre polisolfoniche cave dove avveniva l’idrolisi
del lattosio e che consentiva l’analisi del disaccaride secondo le
reazioni descritte In precedenza.
L’enzima glucosìoossidosi era invece immobilizzato sul sensore
ad acqua ossigenata e, mediante un rubinetto a quattro vie, era
possibile compiere analisi di glucosio o lattosio semplicemente
escludendo,o meno il reattore (Fig. 20)
hg. 20
Determ nozione dei lottosio e o glucosio con un
ettot. LnzmotILo ed uii ensore o glucosio
P
SCARICO
CAk’pIONr
R
reottore fr-go!ottosidosi; P
=
pompo peristoltico;
T voWolo o 4 ule; S = sensore;
UR. = omperometro e registrotore
N8 Il reottore è incluso solo per lo determinozione del lottoslo
rterrnlo oziono eH
e’in in von
oiIment
Uno recente opplicnzione dei biosensori in compo olimentore è Io
determinazione delta lecitina in vari alimenti utilizzando un sensore o
colino (33).
li metodo utilizzato consiste in due steps di reazioni: nel primo
lo tecitino viene Idrotizzato dall’enzima fosfolipasi 0, poi lo colino
prodotto vieno determinato con un sensore a colino preporoto
immobitizzando io co:lnoossldasl su un elettrodo od ossigeno.
Nello tabella 8 sono riportati I risultati ottenuti in vari composti
quello
con
e
omperometrico
metodo
il
con
alimentari
spettro foto metrico.
Comparazione dei risultati ottenuti in differenti
Tabella 8
alimenti per lo concentrazione di lecitina (ogni valore è la medio di tre
de te rm in ozio n i).
-
Alimento
valore trovato (o)
valore trovato (b)
[b
(% in peso)
metodo enzimotico
o m pero metri c o
(% in peso)
metodo enzimatico
spettro fo t o metrico
L
forino di solo
9.06
cioccolato
1.69
12.0
1.92
0
-oh?
o
J
+32.5
+13.6
35.4
32.6
-7.9
dolci
4.30
5.30
+23.3
biscotti
0.26
0.29
olio dl sola
0.19
0.19
tuono d’uovo
0.0
Un ulteriore settore che potrebbe rìsultere di estremo interesse
per io sviluppo dello ricerco nel cempo del biosensorl è quello delle
problemetiche relotive olle anelisi per il controllo dell’inquinomento
ombientele. E’ lecito prevedere lo possibilità di utilizzore i biosensori
per lo determinozione di composti opportenenti o diverse dossi; qui di
seguito viene descritto uno delle possibilità più interessenti: lo
determinozione di composti orgeno-fosforici (con perticolore riguordo
etto desse degli esteri fosforici utilizzoti come Insetticidi).
Questi composti sono di estremo interesse poichè olcuni di essi
bonno un tergo impiego come insetticidi e quindi fonno porte dello
desse generole dei pesticidi che negli ultimi onnl ho creoto problemi
non indifferenti per lo selvoguordio dell’ombiente.
li continuo oumento nello utilizzezione dei pesticidi ho generoto
un incremento di sensibilità verso gli espetti sonitori e di
conteminozione ombientele che potrebbero soprottutto derivere do
uno insufficiente tutelo delle ocque potenziolmente destineblli al
consumo umono.
Si rendono dunque necessorie un numero sempre meggiore di
onelisi di controllo che tengono conto dello gronde varietà di inquinonti
e dei loro metoboliti potenziolmente tossici. 1a presenze di questi
composti a livelli di concentrezior,e ossei bassi richiede lo disponibilità
di tecniche enoiitiche di notevole sensibilità ed occurotezzo.
4.4.1) Cerihl generoli sullo determinozione dl compostI
orgono-fos forici
Lo strutture bose degli esteri fosforidi utilizzati come insetticidi
è lo seguente:
0(S)
RO
\//
X=varie ,O-PhNO
(OR) R’
/\
X
‘ned e te trattamen i con
o es e c. ‘cceierc
t azio’
esime. p1 idina-aid cima n’e’. (PRM) ‘ .uro (39) c idross cnmina
(40). La inibizione e la riattlva7ione dell enzima sono mostrati delle
seguenti reazioni:
Le
En:
5t
Cd.)lOp
OR
inh&b
oq,
tcn
—e.*
taz
Gli,
e
òoa,
OR,
ti
CN-0HEn:—Ser-O-p”
fl”CR:
(PAn)
reaceivatsop
-s
tn:-Ser—OH
PAN
-
8’ OR,
Sulla base delle precedenti osservazioni si è dunque sviluppato
un campo dl ricerca per la messa a punto dl blosensorl basati
sull’accoppIamento con enzimi Immobillzzatl, per la determinazione
degli lnlbltori della collnesterasl.
E’ In prima approssimazione Impossibile distinguere tra I singoli
Inlbltori quando presenti In miscela nello stesso campione, ma può
essere Interessante considerare la procedura per misure dl IndIcI dl
tossicItà (41).
Il metodo è In generale semplice e molto sensibile In confronto
ad altre tecniche anelitlche e può essere usato In sistemi a flusso per
misure In continuo (42). E’ Inoltre, In linea teorica, possibile utilizzare
delle tecniche di separazione (cromatografla) a monte del sistema
(blosensore) per dlscrimlnare I vari Inlbltorl e determlnarll
singolarmente.
SI possono utilizzare vari sistemi elettrodlci basati su principi
diversi per la costruzione dl un sensore con enzima Immobilizzato.
La ImmobilIzzazIone dl AChE su dl un elettrodo a vetro permette,
medIante la reazione (a), dl seguire la inibizione dovuta al residuo del
pesticlda mediante la variazione dl pii.
lmmobllizzando l’enzima colme ossldasl su nglon fissato ad un
sensore per acqua ossIgenata (platino polarizzato a 0.6 1) vs. Rg/AgCi)
si può seguire lo stesso fenomeno di InibIzIone mediante la seguente
coppia di reazioni:
estere colme
ollna • 2 02
> collna + acidi
—-coilresterasl
->betalna + 211202
coira ossidasi
1120
-—-
—
-
--
L stesse prop ieta tossic’w I questi composti hann portato,
q’a da 9olto temp’ ella i- troduz,on di varie tecniche biochimicl’e per
ia loro individuazione e determinazione quantitativa (34-37)
L’azione base degli esteri fosforici è associata con le loro
capacitè di inibire le colinesterasi (AChE) nei sistema nervoso centrale
e periferico, dove l’enzima gioca un ruolo importante nelia
trasmissione deil’impuiso nervoso (38).
Le reazione (a) può essere scritta nei seguente modo:
CH,
-
C
O
—
—
CH,
-
CH, —CCH,)
3
fg!.
CH,
-
0 HO
COO
-
CH,
-
CH, -?(CH,), .
Sulla considerazione di questo meccanismo si è sviluppata la
ricerca per le realizzazione dl un sensore per la determinazione
analitica di questi composti.
in Fig. 21 vIene mostrata la risposta dl un sensore ad fiChE
lmmobiiizzata per varie concentrazioni di pesticidl organo-fosforici.
%
Inibizione
100
-«e
80
60
40
20
10.1
a
io’
MethyI-Parathion .Malaihion oEthyl-Parathion
Fig. 21
-
ioM
•
Paraoxon
curva di caiibrazione di un sensore ad RChE per la
determinazione di pesticidi;
La inibizione della fiChE è in una certa misura permanente e la
attivitò no i ritorna st or tar eamcnte se non dopo iunghi pertodi.
Elettrodo a BuChi (butirriicjffi.gsterasi) ner la
dejexin!poztontfil .nsilrWI organo tpjjorict
4 4
)
Come esempio di applicazione in questo tempo prendiamo In
considerazione un elettrodo e BuchE (43-46), sui quale sono stati
condotti diversi esperimenti per una corrette vaiutezione di tutti i
parametri che possono influenzare la determinazione analitica.
Prendendo come esempio ii Pnraonon è stato condotto uno studio
per valutare ia risposte deii’eiettrodo a BuChE. E’ stato scelto ii
Paraoxon perché suiia base deiie DL è riconosciuto come uno dei più
tossici tra i pesticidi organo—fostorici. Si riportano ie torme ossidate
deii’Ethui Parathion e dei Methgi Parathion:
MiO
O
LO O
Ed
2
‘b.’o
Me
Paranzon methvl.
Parnoxnn ethyL
—
Fig.22: risposta deii’eiettrodo a BuChE per:
concentrazione di ParaoHon 2w io M
tempo di incubazione della membrana neiia soluzione di
Paraowon 30 minuti
diverse concentrazioni di substrato
tampone tostato a differenti concentrazioni (pH 7,2)
temperatura 22C
membrana : 4 unità di BuChE
—
—
—
:.
5 WM.
A
prima
.vt...
I
depo
e
I
.‘•
t,z,’ne
—
• —
•.•I
—-e
•
:‘
40
itt
s
tobu o lo r ercentuole di Inibizione, si noto che effetto
inibitore aei PorooHon e omplificoto quondo si Icuoro od uno
concentrozione di substroto devoto. Conviene dunque utilizzore uno
concentrozione di substreto piuttosto devote, pur rimonendo nel
2 )
tempo di Hneorità ( iO
Tebelle 9
Relazione tre la concentrazione dl substrato e
percentuale di inibizione
BuChE
% di inibizione
1
0 OLI
OLi
-
OLIO
5H10
5
I1O
1H1O
2
5H10
O
17
63
66
ove 0110
=
risposto deirelettrodo ol substrato
DLII
=
risposto dopo la inibizione dello membrane enzim
E’ estremamente importante enche Io concentrazione dell’enzime
come si può rilevare dello Fig. 23
Fig. 23
Influenze dello concentrozione
sensibilità delle risposte dell’elettrodo ol PorooHon
‘
dell’enzimo sullo
5 H
M
2H 10
H
8
inibizione
i 00
8
1
‘o
‘o
2’
‘enzima)
.4
possono inflns re aefle on.idera7Icni sulle clnetaa di
nib’zlone
ufla hfiuenn del pH. l’i yrnareie si ruò affernsie Ciw la
iniblzionc. e p u efficace a p1 leggermente basico.
Per i tempi dl incubazione, dopo prove da 10 a 40 minuti, si può
affermare che un tempo ottimale dl incubazione è di 30 minuti
i
Fig 24: curva dl taratura dl una membrana a BuchE in funzione dl
concentrazioni crescenti di Paraonon.
tempo dl incubaz!one : 30 minuti
tampone fosfato iir
2 M , pH — 7,2
conc. di lavoro In substrato:102 tel
caratteristiche di membrana : 4 unità di BuChE
temperatura : 22C
-
-
-
-
-
v i (wfl
6
6.
4U
(o.
(Praoon) 1(M).
4,4.3>
IorenofosforlcI
Dopo Io estrozione del principi attivi dal campione ( o
direttamente sul campione ) si può determinare l’attività
antlcolinesterosico, I volori potrebbero essere ventoggiosomente
espressi in
equivalenti inibitore di riferimento
( si può utilizzare
come rifer!mento i! Porothion, e quindi
equivalenti Porothion”, come
pure si può prendere come riferimento un altro pesticida
orgonofosforico ). In pratico si assume che nel campione in eseme sia
presente uno quantità cli sostanza di riferimento tele do causare uno
inibizione equivalente e quello dello quale sono responsabili I composti
anticolinesterasicl effettivamente presenti e dosabili nelle condizioni
sperimentali riportate,
Questo tipo di valutazione biochimico, olio quale concorrono in
misuro diverso i vari ontico!inesterosici presenti nei campione, è
comunque un indice estremamente interessante do un punto di visto
tossicologico per effettuare corrette valutazioni sul campione in
esame,
E infetti possibile valutare, porellelemente allo Identificazione
del singoli rappresentanti di uno classe di composti (ad esempio gli
insetticidi organo-fosforici) mediente tecniche ges-crometogrofiche,
le effettive incidenza
cli queste classe di composti sulla attività
anticolinesterasica totale del campione.
Del punto di vista della valutazione tossicologico si riportano qui
dl seguito alcune considerazioni tratte da una breve rassegno
bibliografico di LeonI (35) su quanto proposto do diversi autori per
questo tipo di indagii.
llieiss (1959,1964 e 1965 ) come criterio di giudizio ha
proposto di utilizzare il % di inibizione della colinesterasi del cervello
dei pesci; questo metodo, benchè utilizzato in qualche studio di
inquinamento da esteri fosforici ( Williams,!966; !iofland,1967 ) e
carbammici (Lowe,1967) risulta complesso e soggetto a diversi errori
in quanto è difficile stabilire il livello di riferimento standard della
attivitò onticolfnesterasica, che varia, oltre che con la specie
considerata, anche con la zona del cervello che può essere prelevata
e con la stagione (Gibson et aL,1969)
Un criterio valido per una valutazione tossicologico potrebbe
anche essere quello proposto da tJavis e P.lalanay (1967 ), ossia di
considerare 11 % di inibizione della attivitò anticolinesterasica
ottenuta da plasma umano, eseguendo la prova in condizioni standard
su estratti dl acque potabili; è comunque necessario reperire l’enzima
nilo stato puro per una corretta determinazione.
‘
‘
Lon le tecniche occennete, comur que non e possibile alcuna
d,fferenzia7,one qualitativo tra I diversi inibitori della colinesterasi,
Per questi motivi è stata introdotta la cromotografio su strato sottile
con evidenziozione enzimatico e chimico (Leoni, 1969,1971 ).
Diversi AR. hanno infatti proposto questa tecnica per la
valutazione, soprattutto negli alimenti, dei residui di esteri fosforici;
la evidenziazione chimico del principi attivi ( Baumier e Rippstein,
1 961 ; Wolker e Beroza, 1 963; Bunyon, 1964; Kouacs, 1964; Helchlorrl
e coI!,, 1964; Fischer e Plunger, 1965; Watts, 1965; Quaranta, 1967;
Guth, 1967; Rogob,1967 o,b; Fischer e Plozer, 1969; Askew e co!!,1969)
pur potendo dare informazioni sullo presenza o meno di determinati
gruppi atomici nelle sostanze cromatogro fate è tuttavia meno
sensibile e significativa della evidenziazione enzima tica. In fatti tale
tecnico cli rilevamento delle macchie ( Bungan, 1964; El-Refai ed
Hopklns, 1965; Winter!fn e co!,’., 1968; Schutzmann, 1968; Mendoza e
colI., 1969 a,b ) deve essere considerato più specifica della
evidenziozione chimico ed avente un grado di sensibilità pari ed In
qualche caso molto maggiore della gos-cromatografie con I vari
rivelatori.
?
tIueerlautlli z z azionijLbIosensor
mbientole
4,4,4
fin certo numero di sostanze organiche naturali di origine
vegetale ( soprattutto alcaloidi , in generale sprovviste di azione
insetticida, ed altri in’ejuinanti chimici, sono inibitori della colinesterasi
del siero umano. Lei diffusione di queste sostanze nell’ambiente (in
particolare nelle acque ) non è esattamente nota, me i metodi che
attività
determinazioni della
esclusivamente
utilizzano
anticolinesterasico come criterio di giudizio per i! grado di
inquinamento causato dalla utilizzazione in agricoltura cli esteri
fosforici o corbammici, ne restano compromessi.
V’altra parte non è sempre garantita ia identificazione analitica
di molti dei prodotti di trasformazione e degradazione ditali pesticidi
dotati di attività anticolinesterasica, e ciò soprattutto ne! caso di
indagini di una certa uastità e che implicano numerose
determinazioni,
Esiste però la esigenza di identificare almeno i principali
responsabili dei fenomeni di inquinamento, per avere indicazioni sui
provvedimenti più opportuni che è necessario intraprendere, mentre è
anche indubbia l’utilità di valutare la carica antico!inesterasica totale
de! campione in esame. “Leoni (35)
La ricerca su questo tipo di indagini analitiche ha subito negli
ultimi anni un rallentamento per le difficoltà in parte accennate.
In definitiva con queste tecniche dovrebbe essere possibile
valutare più correttamente lo stato cli inquinamento da esteri fosforici
ed accertare che ne sono responsabili prodotti dei quali spesso sono
sottovalutote le caratteristiche cii persistenza nell’ambiente.
Rispetto alla rassegna bibliografica precedentemente riportata, I’
introduzione dei sensori cui questo testo fa riferimento e lo sviluppo
delle tecniche cromatografiche (in particolare modo [IPt.C ) abbinobili,
dovrebbe consentire il superamento di una serie di problemi prima
seriamente limitanti per Io sviluppo di queste metodiche di indagine
biochimica.
MiaI 4iiCi1
Le breve ressegne proposte he come scopo quelle dl evidenzlere
le enormi potenzlelltà d sviluppo delle ricerce nel cempo del
blo sensori.
Gli esempi rlportetl nel peregrefi 4.1 (MedIcine), 4.2 (IndustrIe),
4.3 (Rllmentezlone) illustreno le grendi potenzlelltà del medietori
biochimici eccoppleti con sensori elettrochimlcl. In questi cesi è stete
messe In evidenze une ceretterlstice pecullere di teli biosensori che,
non richiedendo elcun pretrettemento del cemplone, rendono possibile
un’estensione e semplici sistemi In flusso continuo permettendo quindi
li monitoreggio e i’eutomezlone di epperecchleture biochimiche cliniche
e dl processi blotecnoiogici.
in cempo medico le commercieilzzezlone di un pencrees
ertificiele ( Slostetor, Beteiike) beseto su un sensore e glucosio
testimonie i’eite ettidebilità dl questi sistemi. Reletivemente e questo
settore nuove ricerche stenno producendo i presupposti per un
ulteriore sviluppo dei sisteme pencrees con controlli sempre più
eseustivi del quedro clinico del peziente (controllo multisensore) e le
possibilità di mlnieturizzere il sisteme rendendolo tresporteblie,
semplice ed economico, per uso domestico e non più ospedeliero.
Nei cempo delle blotecnoiogie il controllo del processi vie
biosensore ne rende possibile l’eutomezione. i biosensori stenno
infetti trovendo potenzieii epplicezioni leddove processi in continuo
richiedono un controllo In linee ed in tempo reeie. Nel settore
elimentere il controiio dl queiltà del prodotto industrlele e delle
meterle prime richiede nuovi metodi enelitici doteti oltre che dl
selettività, precisione ed eccuretezze, enche di semplicità, repidità di
esecuzione, economicità dl epperecchieture e reegentl.
Quento riporteto nel peregreto 4.4 (Rmbiente) mette in evidenze
le reeiistiche potenzielità dl questi sensori in un cempo nel queie, e
nostro evviso, henno evuto fino ed ore, per veri motivi, une iimitete
eppilcezione.
Le possibilità dl ricevere oltre el deto eneiitico enche indicezioni
dl tipo tossicologico è senze dubbio l’espetto più interessente in
questo settore. Tele possibilità derive dei tetto che le determinezione
enelitice strutte proprio il meccenismo elie bese delle tossicità dei
composti in eseme.
Tutto questo neliottice dl giungere e considerere i problemi
riguerdenti I inquinemento embientele non solemente con l’eusilio di
numeri reietivi elle indegini enelitiche me in un contesto più empio nel
quele troveno posto enche veluterlo il più complete, sino e giungere
65
elridentlrlcezlone dl indicI dl rlschio eventi più profondo slgniflceto
(47).
Questi poi dovrebbero Includere enche tests tosslcologlci, i
rlsulteti dei quell dovrebbero essere enellzzetl perellelemente el
rlsultetl delle determlnezlonl enelltlche (48).
In conclusione, per quento concerne I blosensorl, si può
veremente effermere che Il limite è costituito delle fentòsle del
ricercetori, mentre d’eltre perte molte scienze guerdeno el rlsultetl dl
queste tecnologie cercendo dl risolvere problemi eneiltlci entichi,
problemi nel quell.mlsure lunghe e leborlose possono, In elcunl cesi,
essere sostItuite de un semplice “probe”.
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