FENOTIPO PRADER-WILLI IN UN CASO PRENATALE
CARATTERIZZATO DALLA MICRODELEZIONE DI
SNORD116 C/D BOX
S. DE TOFFOL1, D. BALDO2, E. FRATE2, L. TUROLLA2, G. BRACALENTE3, L. MARCATO1, L. GARAVAGLIA1, M. BENDINI4, F. CANAL5, V. ZANATTA1,
E. GAETANI1, B. GRIMI1, F. DULCETTI1, B. MALVESTITI 1, G. SIMONI1, F. MAGGI1, F.R. GRATI1.
1 Ricerca & Sviluppo, Citogenetica e Biologia Molecolare, TOMA Advanced Biomedical Assays SpA, Busto Arsizio, Varese
2 U.O. Genetica Medica , Poliambulatorio ULSS9, Treviso
3 U.O. Ecografia Ostetrica e Diagnosi Prenatale, Osp. “S. Maria di Ca’ Foncello” di Treviso
4 S.C. Neuroradiologia, Osp. “S. Maria di Ca’ Foncello” di Treviso
5 U.O. Anatomia Patologica, Ospedale “S. Maria di Ca’ Foncello” di Treviso
INTRODUZIONE
La sindrome di Prader-Willi (PWS, OMIM #176270) è un disordine multisistemico che colpisce 1 su 10,000-30,000 bambini nati vivi, caratterizzato dalla mancata espressione
paterna di geni imprinted nella regione 15q11.2q13.
I soggetti affetti da tale condizione sono caratterizzati da ipotonia severa e difficoltà di alimentazione nella prima infanzia, seguiti da iperfagia ed obesità nell’infanzia tardiva o
durante la giovinezza; ipogonadismo con ipoplasia genitale,insufficienza puberale ed infertilità sono presenti in entrambi i sessi. Inoltre, sono comuni bassa statura, dismorfismo
facciale, mani e piedi piccoli, e diabete mellito non-insulino dipendente. Tutti i pazienti presentano deficit cognitivo di grado lieve-moderato e sono frequenti disturbi comportamentali (Cassidy et al, 2012). In epoca prenatale l’assenza di segni ecografici specifici rende difficilmente diagnosticabile tale sindrome. Le principali anomalie gestazionali
sono polidramnios, ipomobilità fetale, ridotta circonferenza addominale, ventricolomegalia e peculiare e transitorio malposizionamento di mani e piedi, spesso evidenziabili
solo oltre la 30a settimana di gestazione (sdg) (L’Ermine et al, 2003; Oiglane-Shlik et al, 2006; Bigi et al, 2008).
In circa il 65-75% dei casi PWS si riscontra la delezione della copia paterna della regione 15q11-q13; nel 20-30% dei casi è presente la disomia uniparentale materna del cromosoma 15, mentre solo nell’1-3% dei casi si hanno alterazioni dell’Imprinting Center (IC), una regione regolatoria differenzialmente metilata su i 2 alleli.
La regione 15q11.2q13 può essere suddivisa in 4 distinte regioni delimitate da 3 breakpoint ricorrenti (BP1, BP2, BP3) interni a duplicazioni segmentali: 1) una regione prossimale, compresa tra BP1 e BP2, che contiene geni non soggetti ad imprinting, 2) la “PWS paternal-only espressed region”, che comprende alcuni geni codificanti, tra cui
SNURF-SNRPN, l’IC, un cluster di C/D box snoRNAs e numerosi trascritti antisenso, 3) la “Angelman Syndrome (AS) region” che comprende il gene UBE3A, ad espressione
materna, e 4) una regione distale non imprinted in cui è situato il BP3 (Fig.1). Nella “PWS region” il gene bicistronico SNURF-SNRPN codifica per 2 proteine: la proteina SmN
(esone 4-10) coinvolta nello splicing dell’mRNA e la proteina SNURF (esone 1-3) di funziona ignota. All’estremità 5’ del
gene è situata la CpG Island, comprendente l’IC, mentre all’estremità 3’ si trovano diversi snoRNAs, tra cui il cluster
SNORD116 (o HBII-85, 29 copie) e SNORD115 (o HBII-52, 43 copie), probabilmente coinvolti nello splicing alternativo
dell’mRNA, la cui espressione è regolata dal promotore del gene SNURF-SNRPN (Cassidy et al, 2012). Fino a qualche
anno fa si riteneva che SNURF-SNRPN fosse il gene candidato della PWS, ma studi più recenti su rari pazienti con delezioni atipiche (no BP1-BP3 e BP2-BP3) o portatori di traslocazioni bilanciate che non interrompono tale gene sembrano
Fig 1. Rappresentazione schematica della regione 15q11.2q13.
Nella “PWS region” (blu) sono presenti i geni ad espressione paterna tra cui SNURF-SNRPN, gli snoRNAs di cui SNORD116 e SNORD115
presenti in più copie, e l’imprinting center (IC) bipartito che regola sia l’espressione dei geni ad espressione paterna che quelli ad espressione
materna nella “AS region” (arancio). In verde sono riportati i geni non soggetti ad imprinting. Le linee verticali ondulate identificano i 3 breakpoint
ricorrenti (BP1, BP2 e BP3). In casi rari sono presenti breakpoint più distali (BP4 o BP5). Le regioni comprese tra BP2-BP3 (5Mb - Deletion Type 2)
e BP1-BP3 (6Mb - Deletion Type 1) rappresentano le delezioni comuni associate alla PWS. L’immagine è tratta da Cassidy et al, 2012.
MATERIALI E METODI
Il caso clinico descritto riguarda una donna di 35 anni alla 22a riferita per il riscontro all’ecografia di screening di ventricolomegalia borderline bilaterale fetale.La successiva ecografia di secondo livello
conferma la ventricolomegalia borderline (trigoni di entrambi i lati 14mm) apparentemente isolata (Figura 2).Si esegue risonanza magnetica che oltre a evidenziare la ventricolomegalia rileva anche
anomala indentellatura della corteccia tipo micropachigiria con dubbia presenza di micro noduli sub-ependimali in corrispondenza del ventricolo laterale destro.Si evidenzia inoltre un dismorfismo
cranio-facciale aspecifico.Dopo counseling moltidisciplinare la donna ha richiesto IVG (Legge 194/1978).L’esame autoptico e istologico hanno confermato quanto rilevato coi precedenti esami.
Le analisi genetiche vengono condotte su losanga di cute fetale.
Fig 2. Ecografia di secondo livello.
E’ visibile la ventricolomegalia borderline (trigoni di entrambi i lati 14mm) apparen-
L’analisi del cariotipo fetale è stata effettuata mediante bandeggio QFQ, mentre per l’analisi array-CGH, eseguita sia a livello fetale che a livello del sangue periferico dei genitori, è stata utilizzata la piattaforma Nimblegen oligo CGX Array 135K
(PerkinElmer) con risoluzione nelle regioni critiche pari a ~40Kb e risoluzione effettiva nel backbone di ~140Kb. I dati ottenuti sono stati elaborati mediante Software Genoglyphix 2.6 (Signature Genomics, PerkinElmer). Per confermare le anomalie riscontrate a livello fetale sono stati inoltre eseguiti il test di metilazione (CpGenome DNA Modification Kit e CpG
Wiz Prader-Willi/Angelman Methylation Specific PCR Assay; Millipore), il Methylation Specific-MLPA (SALSA MLPA ME028
Prader Willi/Angelman probemix, MRC-Holland) e l’analisi dei polimorfismi (STRs) per la regione Prader Willi/Angelman.
temente isolata
RISULTATI
La coltura delle cellule fetali non ha dato risultati analizzabili (fallimento) mentre l’array-CGH eseguito su DNA
estratto da cute fetale e, successivamente, sul genoma dei genitori ha evidenziato un cariotipo femminile con una
duplicazione de novo in 12q21.33 di ~472kb e 2 delezioni interstiziali de novo contigue in 15q11.2 rispettivamente di ~34Kb (33.75-33.87 kb, 8 oligonucleotidi) e ~117Kb (116.76-116.88kb, 9 oligonucleotidi). Il cariotipo molecolare è il seguente: arr [hg18] 12q21.33(89,888,821-90,360,606)x3dn, 15q11.2(22,847,512-22,881,383)
x1dn, 15q11.2 (22,966,255 -23,083,077)x1 dn (Human Genome Built 36, hg18, Assembly Mar 2006).
La duplicazione, comprendente i geni OMIM EPYC, KERA, LUM, DCN è stata classificata come CNV a significato clinico incerto, mentre le delezioni in 15q11.2 comprendono, rispettivamente, il cluster di geni SNORD116
(*605436) e SNORD115 interni alla regione associata alla PWS (Fig.3). Il test di metilazione che indaga la regione CpG Island del gene SNRPN, situato a monte delle 2 delezioni, è risultato normale indicando l’assenza di delezioni o perturbazioni dello stato dell’imprinting di tale regione. L’MS-MLPA ha confermato la presenza della delezione comprendente lo SNORD116 cluster (SNORD115 non è indagato dal kit MLPA) (Fig. 4). L’analisi dei
polimorfismi ha evidenziato un normale contributo (biallelico) della regione 15q11.2 e ha escluso la presenza di disomia uniparentale. Nessuno dei polimorfismi utilizzati mappa all’interno dei cluster SNORD116 e SNORD115.
CONCLUSIONE
La maggior parte dei casi PWS (~70%) è caratterizzata da grosse delezioni interstiziali (5-6Mb), di origine paterna, della regione 15q11-q13. Per molto tempo si è ritenuto
che il gene SNURF-SNRPN avesse un ruolo chiave nell’insorgenza della PWS ma l’identificazione di pazienti PWS portatori di traslocazioni bilanciate che non interrompono né
le sequenze promotrici né le sequenze codificanti di SNURF-SNRPN (Schulze et al. 1996;
Wirth et al, 2001; Gallagher et al, 2002; Schule et al. 2005) ne hanno escluso il ruolo
di gene candidato. Inoltre, l’individuazione in anni più recenti di 3 pazienti PWS con
microdelezioni de novo atipiche dell’allele paterno, non coinvolgenti SNURF-SNRPN, hanno portato a ridefinire la regione critica della PWS identificando il ruolo fondamentale
dei paternal espressed non-coding snoRNAs, in particolare di SNORD116, nell’eziologia
di tale sindrome (Sahoo et al, 2008; de Smith et al, 2009; Ducker et al, 2010). Infatti,
mettendo a confronto questi 3 casi si identifica una regione di delezione comune di
~108Kb (22,835,594-22,944,158) comprendente la copia prossimale di SNORD109, le
29 copie di SNORD116 e le prime 23 copie di SNORD115. L’identificazione di almeno
2 casi riportati con la delezione paterna di SNORD115 che non manifestano il fenotipo
PWS (Runte et al, 2005; Burger et al, 2002) sembra quindi dimostrare che la delezione
di origine paterna coinvolgente il solo cluster SNORD116 sia sufficiente a causare il
fenotipo PWS. Come ulteriore prova di tale dato sono stati creati 2 modelli murini
senza SNORD116 che presentano un fenotipo sovrapponibile a quello dei topi portatori
delle delezioni tipiche della PWS (Skryabin et al, 2007; Ding et al, 2008).
Il caso prenatale riportato presenta una microduplicazione de novo in 12q21.33
(~472kb), classificata come CNV a significato clinico incerto. Essa contiene geni associati soprattutto ad alterazioni della cornea o di altri tessuti connettivali e pertanto,
benché insorta de novo, presumibilmente essa non è coinvolta nell’insorgenza del
quadro clinico fetale. Le altre 2 microdelezioni, entrambe in 15q11.2, comprendono,
rispettivamente, parte del cluster di geni SNORD116 (prime 15 copie) e parte di
SNORD115 (28 copie, da 8 a 35), interni alla regione associata alla PWS. L’MS-MLPA
ha confermato la microdelezione nello SNORD116 cluster e l’assenza di alterazioni a
livello della CpG Island, dato confermato anche mediante test di metilazione e analisi
dei polimorfismi (esclusione disomia uniparentale). Sulla base di queste dati è possibile
ipotizzare che le anomalie identificate a livello fetale, soprattutto la ventricolomegalia
e i difetti di girazione a livello cerebrale, siano delle manifestazioni precoci della PWS,
nonostante non sia stato possibile confermare l’origine paterna della microdelezione.
Ovviamente trattandosi di una gravidanza interrotta ad una settimana di gestazione
relativamente precoce (22a) non è possibile né valutare la comparsa di eventuali altre
anomalie in epoca prenatale, né prevedere le possibili manifestazioni postnatali. Difatti
la microdelezione della regione SNORD116 copre solo circa la metà dell’intero cluster
(~34Kb) e ad oggi rappresenta la più piccola microdelezione descritta molto probabilmente causativa del fenotipo PWS, fornendo nuovi elementi per la determinazione
della regione critica minima della malattia.
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Fig 3. Analisi della regione 15q11.2 mediante aCGH e Genoglyphix Software.
L’analisi aCGH della regione 15q11.2 ha evidenziato la presenza di 2 delezioni
contigue (barre arancioni) nel DNA fetale. Nello schema in basso sono riportati i
geni e le sindromi associate alla regione in esame (Human Genome Built 36 ; hg18,
Assembly Mar 2006)
Fig 4. Analisi della regione 15q11.2 mediante MS-MLPA ME028 (Prader Willi/Angelman probemix).
Nella prima colonna (gene) sono riportate le regioni indagate dall’MLPA. Ogni campione è stato analizzato prima (X) e dopo digestione enzimatica metilazione-sensibile (Xdig) per valutare, rispettivamente,
il dosaggio (copy number analysis) e lo stato di metilazione (methylation analysis) della regione indagata.
Per quanto riguarda il dosaggio valori compresi nell’intervallo 0.7-1.3 identificano un dosaggio normale
(2 alleli), valori <0.7 identificano la presenza di 1 solo allele (delezione). Nel campione N (normale) tutte
le regioni indagate sono presenti in 2 copie, nel campione C (controllo PWS deleto) è presente una delezione coinvolgente l’intera regione PWS/AS, nel campione S (feto in esame) è presente una delezione
che coinvolge solo la regione dello SNORD116 cluster. Per quanto riguarda invece lo stato di metilazione solo le regioni evidenziate (prima colonna) sono metilazione-sensibili in quanto differenzialmente
metilate su i 2 alleli.Valori compresi nell’intervallo 0.7-1.3 identificano la presenza di soli alleli metilati
(100% metilazione), valori <0.7 identificano la presenza di un solo allele non metilato (50% metilazione),
valori pari a 0 identificano la presenza di soli alleli non metilati (0% metilazione). Le sonde in rosse (digestion control) sono controlli di digestione completamente non metilati (valori=0) che servono a valutare la qualità dell’esperimento. Le regioni in viola mappano all’interno della CpG Island del gene SNRPN
e sono importanti per definire la metilazione di tale regione. Nel campione Ndig (normale-digerito)
la CpG Island risulta correttamente emi-metilata, nel campione Cdig (controllo PWS deleto-digerito)
è presente solo l’allele materno metilato (100% metilazione) che non viene digerito (valori 0.7-1.3), il
campione Sdig (feto in esame – digerito) ha lo stesso profilo di un campione normale (emi-metilato).
BIBLIOGRAFIA
Bigi et al. Prenat Diagn. 2008;28(9):796-9.
Burger et al. Am J Med Genet. 2002; 111:233-7
Cassidy et al. Genet Med. 2012;14(1):10-26.
de Smith et al. Hum Mol Genet. 2009; 18:3257-3265.
Ding et al. PLosONE. 2008; 3:e1709.
Ducker et al. Eur J HumGenet. 2010; 18:1196-1201.
Gallagher et al. Am J Hum Genet. 2002;71:669-678.
L’Ermine et al. Prenat Diagn. 2003;23(11):938-43
Oiglane-Shlik et al. Am J Med Genet A.
2006;140(11):1241-4.
Runte et al. Hum Genet. 2005; 116:228-30.
Sahoo et al. Nat Genet 2008;40(6):719-721.
Schule et al. BMC Med Genet. 2005;6:18.
Schulze et al. Nat Genet. 1996;12:452-454.
Skryabin et al. PLos Genet. 2007; 3:e235.
Wirth et al. Hum Mol Genet. 2001;10:201-210.
Database elettronici e siti internet consultati:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim (Online Mendelian
Inheritance in Man)
