Analisi della variabilità genetica del gene PRNP in

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Analisi della variabilità genetica
del gene PRNP in razze caprine allevate
in Piemonte e nella razza Valdostana
11
j
S. COLUSSI1, P. SACCHI2, I. CRISTOFERI2, M.G. MANIACI1, S. MAIONE2,
M.V. RIINA1, R. ORUSA3, S. PELETTO1, M. CARAMELLI1, R. RASERO2, P.L. ACUTIS1
1
CEA - Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta - Torino
Facoltà di Medicina Veterinaria - Dipartimento di Produzioni animali, Epidemiologia ed Ecologia - Torino
3
CERMAS - Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta - Aosta
2
RIASSUNTO
Le encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) dei piccoli ruminanti sono oggetto di crescente attenzione a seguito della segnalazione di un caso di BSE naturale in un caprino avvenuta in Francia nel 2005.
Per gli ovini è stato possibile utilizzare, quale strumento di controllo, la selezione di soggetti geneticamente resistenti poiché è
nota una chiara associazione tra polimorfismi del gene PRNP e modulazione della suscettibilità/resistenza alla scrapie. Per
quanto riguarda i caprini invece, l’approccio selettivo non è al momento possibile perché gli studi effettuati non hanno ancora consentito di identificare polimorfismi associati con certezza a resistenza/suscettibilità alla malattia. In Italia gli studi condotti sulla variabilità genetica dei caprini sono stati limitati; il presente lavoro si propone pertanto di analizzare alcune razze
caprine diffuse in due regioni dell’Italia del Nord: Piemonte e Valle d’Aosta. La regione codificante del gene PRNP di 364 capi
è stata sottoposta a sequenziamento. Sono stati individuati 8 siti di mutazione per cui sono presenti 9 alleli. Le due popolazioni considerate sono risultate nel complesso differenti nella ripartizione delle frequenze alleliche al locus PRNP; le razze allevate in Piemonte sono risultate abbastanza simili tra loro, la razza Valdostana sembra invece rappresentare una popolazione a se
stante. Queste differenze, soprattutto in presenza di alleli per cui è stato ipotizzato un coinvolgimento nel conferire resistenza
alla malattia, dovranno essere tenute in debita considerazione nell’allestimento di piani di selezione per i caprini.
PAROLE CHIAVE
Capra, scrapie, gene PRNP, polimorfismo.
INTRODUZIONE
La scrapie è una encefalopatia spongiforme trasmissibile
(EST), ad esito fatale, tipica di pecore e capre. Nonostante sia
una patologia ad eziologia infettiva, la suscettibilità alla malattia nella pecora è fortemente influenzata dai genotipi del
gene codificante la proteina prionica (PrP), in particolare
dalle varianti ai codoni 136, 154 e 171. Per questo motivo
l’Unione Europea ha deciso di utilizzare la selezione di soggetti geneticamente resistenti quale strumento di controllo
della scrapie nelle popolazioni ovine.
Per i caprini, l’approccio selettivo non è attualmente possibile poiché gli studi sul gene PRNP sono stati limitati e non
hanno condotto all’identificazione di polimorfismi associati
con certezza a resistenza/suscettibilità alla scrapie.
A partire dal 2005, anno in cui in Francia è stato segnalato un
caso di BSE naturale in un caprino1, le encefalopatie spongiformi dei piccoli ruminanti sono diventate oggetto di crescente attenzione da parte dell’Unione Europea, per il timore che l’agente della BSE si fosse diffuso nelle popolazioni
ovi-caprine. La tutela della salute pubblica nei confronti di
tale patologia negli ovi-caprini è infatti difficile e complessa,
in quanto la sola rimozione dei materiali specifici a rischio
non risulta del tutto efficace. L’approdo ad un controllo di tipo selettivo analogo a quello in atto per gli ovini sarebbe pertanto auspicabile anche nei caprini; ciò implica uno studio
della variabilità genetica delle innumerevoli razze supportato da studi caso-controllo che consentano l’associazione tra
un dato polimorfismo e suscettibilità/resistenza alla scrapie.
In Italia, mentre le razze ovine sono state analizzate in modo
approfondito, nella capra ad oggi gli studi effettuati non risultano ancora esaustivi; pertanto, nell’ambito di un progetto di ricerca finanziato dalla Regione Piemonte, si è proceduto ad indagare i polimorfismi del gene PRNP nelle razze
caprine maggiormente diffuse in Piemonte e di caprini appartenenti alla razza Valdostana.
MATERIALI E METODI
Sono stati sottoposti a prelievo di sangue 223 capi (69 Saanen,
70 Roccaverano e 84 Camosciata delle Alpi) provenienti da 60
allevamenti situati in diverse zone delle province di Torino,
Cuneo, Asti, Alessandria e Biella; sono stati inoltre inclusi 141
capi di razza Valdostana, provenienti da 30 greggi della Valle
d’Aosta per un totale complessivo di 364 animali analizzati. Il
campionamento è stato randomizzato. L’estrazione del DNA è
stata effettuata con metodo semi-automatico, utilizzando l’estrattore Thermo Labsystems KingFisher e il kit ChargeSwitch
Sheep Blood. La Open Reading Frame del gene PRNP è stata
amplificata mediante un protocollo di PCR precedentemente
descritto2; sono stati utilizzati i primer p8(+) (5’-ATGGTGAAAAGCCACATAGG-3’) e p9(-) (5’-TATCCTACTATGAGAAAAATGAGG-3’)3. Il prodotto amplificato è stato analizzato per la determinazione dei polimorfismi del gene PRNP
mediante sequenziamento diretto di entrambi i filamenti. A
tale scopo è stata approntata la reazione di cycle sequencing
(Big Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit - Applied Bio-
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Analisi della variabilità genetica del gene PRNP in razze caprine allevate in Piemonte e nella razza Valdostana
systems), utilizzando come primer di sequenza p8(+), p61(+)
(5’-AACCAACATGAAGCATGTGG-3’), p60(-) (5’-GATAGTAACGGTCCTCATAG-3’) e p9(-)4. I primer si legano al templato di DNA in corrispondenza dei codoni: 1-7, 109-116,
147-154 e 249-257 rispettivamente (GenBank AJ000739). Per
il sequenziamento è stato utilizzato l’analizzatore genetico a 4
capillari ABI Prism 3130 (Applied Biosystems) e l’allineamento delle sequenze è stato effettuato mediante il software SeqScape v2.5 (Applied Biosystems).
Le differenze tra le frequenze alleliche all’interno del gruppo
costituito dalle razze piemontesi e tra razze piemontesi e razza Valdostana sono state valutate mediante test Chi-quadro o
test esatto di Fisher.
RISULTATI
Lo studio ha mostrato una cospicua variabilità del gene
PRNP caprino, peraltro in siti differenti rispetto a quelli riscontrati negli ovini. Mutazioni silenti, già riportate da altri
autori5, sono state riscontrate al codone 42 (CCG > CCA) in
236 capre, 73 delle quali omozigoti e al codone 138 (AGC >
AGT) in 282 capre, 106 delle quali omozigoti. Sono stati individuati 8 siti di mutazione per cui sono presenti 9 differenti alleli (Tabella 1). Le frequenze alleliche delle razze allevate in Piemonte con i relativi p-value, sono riportate in Tabella 2; in Tabella 3 è riportato il raffronto tra le frequenze alleliche delle razze piemontesi e della razza Valdostana.
Nelle razze piemontesi l’allele più comune è risultato l’allele
2 (S240P) seguito dall’allele 1 che corrisponde al wild type
della pecora; l’allele 2 differisce da esso soltanto per la presenza di prolina al codone 240. Il raffronto delle frequenze
alleliche tra le razze caprine piemontesi ha evidenziato una
differente distribuzione, statisticamente significativa, solo
per l’allele 2 particolarmente frequente nella razza Saanen e
per l’allele 6 (R154H), maggiormente rappresentato nella
razza Camosciata delle Alpi ed assente nella Saanen. Per i restanti alleli non è invece stata riscontrata alcuna differenza
significativa: gli alleli 3 (T110P) e 7 (P168Q) sono stati rilevati in eterozigosi, ciascuno in un unico animale; gli alleli 4
(G127S) e 9 (Q222K) erano presenti in tutte e tre le razze
considerate, ma ad una bassa frequenza (1-4%). Analoga situazione è emersa per gli alleli 5 (I142M) e 8 (R211Q) che
presentavano però frequenza più elevata.
L’allele 1 è risultato essere l’allele maggiormente diffuso nella razza Valdostana, seguito dall’allele 5 e dall’allele 2. Gli alleli 3 (T110P) e 7 (P168Q) non sono stati riscontrati in questo gruppo.
Il raffronto tra le frequenze alleliche delle razze piemontesi e
della razza Valdostana mostra come le differenze appaiano
significative per tutti gli alleli eccetto che per gli alleli 3, 7 e 9.
L’allele 9 è presente in entrambi i gruppi a bassa frequenza sia
nelle capre piemontesi, sia nelle valdostane (1% e 3%, rispettivamente). Gli alleli 1, 4 e 5 sono ben rappresentati nelle capre valdostane, mentre gli alleli 2, 6 e 8 sono più frequenti
nelle razze piemontesi.
DISCUSSIONE
Il presente lavoro ha permesso di descrivere per la prima volta i polimorfismi del gene PRNP in alcune razze caprine al-
Tabella 1 - Alleli rilevati nelle razze caprine piemontesi e Valdostana.
Codone
Allele
110
127
142
154
168
211
222
240
1
T
G
I
R
P
R
Q
S
2
–
–
–
–
–
–
–
P
3
P
–
–
–
–
–
–
–
4
–
S
–
–
–
–
–
P
5
–
–
M
–
–
–
–
P
6
–
–
–
H
–
–
–
–
7
–
–
–
–
Q
–
–
–
8
–
–
–
–
–
Q
–
–
9
–
–
–
–
–
–
K
–
Tabella 2 - Frequenze alleliche rilevate nelle razze caprine piemontesi.
Allele
Camosciata
delle Alpi
Saanen
Roccaverano
1
0.30
0.18
0.25
n.s.
2
0.33
0.60
0.45
<0.001
3
0.00
0.01
0.00
n.s.
4
0.01
0.01
0.02
n.s.
5
0.09
0.07
0.06
n.s.
6
0.11
0.00
0.03
<0.001
7
0.00
0.00
0.01
n.s.
8
0.14
0.10
0.14
n.s.
9
0.02
0.03
0.04
n.s.
TOTALE
1.00
1.00
1.00
p-value
Tabella 3 - Frequenze alleliche delle razze piemontesi versus razza Valdostana e relativi p-value*.
Allele
Razze piemontesi Razza Valdostana
p-value
1
0.25
0.32
<0.05
2
0.45
0.23
<0.001
4
0.02
0.10
<0.001
5
0.07
0.25
<0.001
6
0.05
0.01
<0.05
8
0.12
0.07
<0.05
9
0.03
0.01
n.s.
TOTALE
1.00
1.00
*Gli alleli 3 e 7 non sono stati riportati in tabella poiché le rispettive frequenze sono in entrambi i casi assimilabili a 0 e il loro confronto è risultato
non significativo.
levate in Piemonte e nella razza Valdostana. Il raffronto tra le
frequenze alleliche delle popolazioni considerate ha consentito di appurare come nel complesso esse siano differenti: le
razze allevate in Piemonte sono abbastanza simili tra loro, la
razza Valdostana ha invece caratteristiche peculiari e si presenta come una popolazione a se stante; ciò appare suppor-
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tato anche dalla struttura genetica di 8 differenti razze italiane condotto da Pariset et al.6 analizzando i Single Nucleotide
Polimorphisms (SNPs) relativi a 35 geni tra cui il gene PRNP.
Le differenze riscontrate nella presente indagine hanno interessato gli alleli: 1 (S240), 2 (P240), 4 (S127), 5 (M142), 6
(H154) e 8 (Q211). La distribuzione dell’allele 2, che è relativamente meno frequente nella Valdostana, è interessante
poiché studi precedenti7 hanno evidenziato che nelle capre
italiane tale allele è in generale più frequente dell’allele 1,
analogamente a quanto riportato per altre razze caprine dell’area mediterranea (Grecia8 e Cipro9), mentre nel Nord Europa l’allele 1 è risultato quello maggiormente diffuso5. Ad
oggi, non è emersa nessuna chiara associazione tra l’allele 2 e
il rischio connesso alla scrapie5,7,9. In modo analogo nessun
coinvolgimento è stato ipotizzato per l’allele 4.
Gli alleli 5, 6 e 8 sono invece ritenuti possibili candidati nella
modulazione della resistenza alla scrapie nella capra. L’allele
5, maggiormente rappresentato nel gruppo valdostano, risulta associato al prolungamento del periodo di incubazione in
capre inoculate sperimentalmente con ceppi di scrapie e di
BSE per cui è stato supposto un suo ruolo protettivo5. Ad oggi è stato segnalato un solo caso di scrapie naturale, in Spagna, in una capra con la mutazione I142M in eterozigosi10,
suggerendo quindi che la presenza di metionina possa ridurre la suscettibilità, ma non conferire una resistenza totale.
L’allele 8, più frequente nel gruppo piemontese, è comunemente presente nelle razze caprine francesi e studi condotti
in Francia suggeriscono una possibile associazione con la resistenza alla scrapie (dati non pubblicati). Tuttavia, in Italia
nel 2005 è stato rinvenuto in Lombardia un focolaio costituito da 5 capre di cui una sola risultata positiva, ma presentante l’allele 8 in eterozigosi (Acutis et al., comunicazione
personale).
Il ruolo dell’allele 6, scarsamente rappresentato in entrambe
le popolazioni considerate, è invece ancora dibattuto. La sostituzione R154H è presente anche negli ovini: in alcune popolazioni, come quelle irlandesi e islandesi, è considerata associata a resistenza con azione di dominanza incompleta,
mentre in Italia2,11 e in Spagna12 risulta associata a suscettibilità, probabilmente per la diffusione di differenti ceppi di
scrapie. La mutazione H154 conferisce inoltre elevata suscettibilità al ceppo atipico di scrapie Nor9813. Nella capra l’allele 6 sembra presentare una situazione di analoga variabilità:
in Grecia è stato supposto un ruolo protettivo8 mentre studi
effettuati in Italia ne hanno rivelato la suscettibilità7. Occorre però sottolineare come in Italia siano stati riscontrati sette casi di scrapie caprina atipica e come in ognuno di essi fosse presente tale allele (dati non pubblicati).
L’allele 9 (Q222K), anch’esso riscontrato con una bassa frequenza ed assenza di significatività statistica, è però degno di
nota per il suo ruolo quale possibile fattore di resistenza7,14. A
ulteriore supporto dell’ipotesi di un ruolo protettivo della lisina in posizione 222 nella capra, è da sottolineare una sostituzione nel codone analogo esistente nella PrP umana
(E219K) che rappresenta l’unico fattore protettivo nei confronti della CJD sporadica15.
CONCLUSIONI
Lo studio dei polimorfismi del gene PRNP è risultato di notevole interesse per la conoscenza delle caratteristiche gene-
13
tiche delle razze caprine del Piemonte e della razza Valdostana; ha inoltre consentito di calcolare le frequenze e la distribuzione su base geografica degli alleli ritenuti candidati quali fattori di resistenza. Se ulteriori studi caso-controllo dovessero confermare l’associazione di tali alleli con la resistenza alla scrapie, le informazioni qui riportate dovranno essere
attentamente considerate negli studi di applicabilità dei piani di selezione.
RINGRAZIAMENTI
Gli Autori desiderano ringraziare: Dr. Bartola, Dr. Cava, Dr.
Curti, Dr. Dal Monte, Dr. Fedele, Dr. Gatto, Dr. Giordana, Dr.
Parasacco, Dr. Ragionieri, Dr. Rovarei, Dr. Quasso, Dr. Ratto,
Dr. Rizzola e Dr. Trucco per il prezioso contributo apportato.
❚ Genetic variability of the PRNP
gene in Piemonte region goat
breeds and in Valdostana breed
SUMMARY
The importance of Trasmissible Spongiform Encephalopaties
in small ruminants increased after the discovery in France of a
natural BSE case in a goat. Selection has been used to control
TSE in sheep populations because of the association between
PRNP polymorphisms and resistance to scrapie. In goats,
however, a similar association has not been proved so far.
In Italy only limited studies have been carried out on caprine
PRNP genotype distribution; the aim of this study was to determine the variability of the PRNP gene in goat populations
from two Northern italian regions: Piemonte and Valle d’Aosta. Coding region of PRNP has been sequenced for 364 goats.
In total, eight polymorphic sites were identified giving rise to
nine alleles. The two analysed caprine populations were different regarding PRNP genetic variability; breeds reared in
Piemonte were similar each other, while Valdostana breed
seems to be a different population. Differences in allele frequencies, if related to alleles potential candidates for modulating resistance/susceptibility, need to be taken into account
for future breeding programs.
KEY WORDS
Goat, scrapie, PRNP gene, polymorphism.
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Analisi della variabilità genetica del gene PRNP in razze caprine allevate in Piemonte e nella razza Valdostana
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Qualypig
Salone della filiera della carne suina
SOCIETÀ ITALIANA VETERINARI PER ANIMALI DA REDDITO
SOCIETÀ FEDERATA ANMVI
QUALYPIG
Salone della Filiera della carne suina
CremonaFiere, 17-19 Aprile 2008
CONVEGNO NAZIONALE SIVAR
ALLEVAMENTO DEL SUINO A BANDE: COME, QUANDO E PERCHÉ
Evento in fase di accreditamento ECM
Venerdì 18 Aprile 2008
RELATORI
CARLO LASAGNA (MARTINI SpA, Forlì - Cesena)
KEES DE ROEST (CRPA, Reggio Emilia)
FRANCESCO TONON (Med Vet, LP, Treviso)
PROGRAMMA SCIENTIFICO
14.30-15.45 Come trasformare un allevamento convenzionale in un allevamento a bande
Francesco Tonon
16.00-17.00 La gestione dell’allevamento a bande
Carlo Lasagna
17.00-17.30 Confronto tra i costi di produzione del suino in allevamento convenzionale e in bande
Kees De Roest
18.00 Questionario apprendimento ECM, consegna attestati e chiusura lavori
INFORMAZIONI
Segreteria SIVAR (Paola Orioli)
Tel. 0372-40.35.39 - Fax 0372-40.35.54
Email: [email protected] - Website: http://www.sivarnet.it