Disomia uniparentale del cromosoma 14q in pazienti con
Neoplasie Mieloproliferative Croniche Philadelphia-negative:
conseguenze molecolari e funzionali.
INTRODUZIONE
Con il termine disomia uniparentale (UPD) si indica la trasmissione di due cromosomi omologhi o
parte di essi da un solo genitore; quando questa condizione si verifica in una cellula somatica per
errori durante il processo di ricombinazione mitotica si parla di disomia uniparentale
somaticamente acquisita (aUPD) e costituisce uno dei più comuni meccanismi di amplificazione di
una mutazione osservati nei tumori. Nelle Neoplasie Mieloproliferative croniche Philadelphianegative (MPN) la disomia uniparentale del cromosoma 9p, associata alla mutazione del gene JAK2
costituisce uno delle più frequenti alterazioni molecolari associate alle progressione neoplastica.
Mediante analisi con Single Nucleotide Polymorphisms arrays abbiamo identificato una nuova
regione di UPD che coinvolge un segmento di lunghezza variabile del cromosoma 14q in un
numero significativo di pazienti affetti da MPN. La regione minima di UPD comune a tutti i pazienti
comprende alcuni geni regolati mediante imprinting genomico. L’imprinting è il fenomeno per cui
uno dei due alleli di un gene è attivato o inattivato mediante meccanismi epigenetici in
dipendenza dal genitore da cui esso è ereditato; nel caso del locus sul cromosoma 14 i geni DLK1 e
RTL1 sono espressi esclusivamente dall’allele paterno, mentre l’allele materno esprime tutta una
serie di RNA non codificanti tra i quali MEG3, circa 50 miRNA e numerosi snRNA. DLK1 è una
proteina della famiglia Notch/Delta/Serrate che gioca un ruolo importante nel differenziamento e
nello sviluppo embrionale; vari esperimenti hanno inoltre dimostrato un ruolo anche
nell’adipogenesi e nell’ematopoiesi, mentre alterazioni dell’espressione di DLK1 sono state
descritte in diverse neoplasie. Resta tuttavia da chiarire quali altri geni possono essere coinvolti in
questa regione e quali siano i meccanismi in grado di conferire alla cellula tumorale un vantaggio
proliferativo.
MATERIALI E METODI
Studio del profilo di metilazione del locus DLK1-MEG3:
Per definire il profilo di metilazione del centro di imprinting che controlla l’espressione dei geni del
locus DLK1-MEG3 saranno utilizzate tecniche di bisulfite sequencing e bisulfite allele specific PCR.
Questo tipo di analisi è volta a definire quale dei due alleli è preferenzialmente perso nei pazienti
con 14q UPD e quale invece risulta duplicato.
Analisi mutazionale dei geni coinvolti nella regione di UPD:
Questo studio verrà effettuato mediante whole exome sequencing e successiva validazione dei
risultati ottenuti mediante Sanger sequencing. I risultati di questi esperimenti ci serviranno per
chiarire se vi sono eventi mutazionali associati alla perdita di eterozigosi a livello del cromosoma
14q, in grado di conferire alla cellula neoplastica un vantaggio clonale.
Analisi di espressione genica in cellule di pazienti con 14q UPD:
Il profilo di espressione genica in cellule di pazienti con 14q UPD ci fornirà importanti informazioni
per definire il pattern di espressione dei geni del locus DLK1-MEG3 e individuare quali tra questi
possono avere un ruolo patogenetico. Inoltre questi risultati potranno essere utilizzati per valutare
l’impatto di questa alterazione sul profilo di espressione globale della cellula ed eventualmente
quali altre pathways sono influenzate. Questa analisi verrà svolta mediante RNA-seq in un primo
momento su granulociti di pazienti con 14q UPD e poi estesa su cellule CD34+ adattando il
protocollo per basse quantità di RNA.
Analisi del profilo i microRNA in cellule di pazienti con 14q UPD:
Il locus DLK1-MEG3 comprende circa 50 microRNA. Pertanto, è importante capire se l’espressione
di questi geni risulta alterata nei pazienti con 14q UPD e se queste molecole contribuiscono a
definire un fenotipo patologico. Utilizzeremo un sistema di Real Time PCR per valutare
l’espressione dei singoli miRNA, per poi integrare i risultati ottenuti con i dati derivanti dall’ RNAseq in modo da poter identificare i possibili target e le pathways coinvolte.
Studi funzionali:
Basandosi su dati di letteratura abbiamo scelto DLK1 come primo candidato per effettuare studi
funzionali. L’approccio che utilizzeremo si basa sulla costruzione di vettori lentivirali per iperesprimere stabilmente la proteina in diversi modelli: inizialmente linee cellulari per verificare
l’efficienza del nostro sistema di espressione e stabilire eventuali effetti della proteina su processi
come proliferazione, sensibilità a fattori di crescita e apoptosi. Lo stesso sistema verrà poi
utilizzato per studi in vivo in diversi modelli murini. In questo modo avremo un panorama
completo sugli effetti fenotipici dell’iperespressione di DLK1 sul compartimento ematopoietico.
OBBIETTIVI E RISULTATI ATTESI
Le MPN sono un gruppo di patologie caratterizzate da numerose alterazioni molecolari, le più
frequenti delle quali sono le mutazioni dei geni JAK2 e MPL. Nonostante i numerosi sforzi volti a
definire il quadro completo di eventi che contribuiscono alla patogenesi di queste neoplasie,
numerosi aspetti restano tuttora da comprendere; questo studio pertanto si pone come
obbiettivo la caratterizzazione molecolare e funzionale di una nuova alterazione osservata nelle
MPN. La prima parte dello studio sarà volta a definire gli effetti molecolari di questa alterazione,
utilizzando approcci volti alla caratterizzazione di numerosi aspetti complementari: alterazioni
genetiche ed epigenetiche, profili di espressione genica e microRNA. I dati ottenuti da questi studi,
insieme alle informazioni reperibili in letteratura ci permetteranno di selezionare i possibili
candidati sui quali svolgere i successivi studi funzionali. In particolar modo ci potremo avvalere
dell’utilizzo di differenti modelli murini per studiare gli effetti fenotipici di questa alterazione
molecolare e valutarne il ruolo nella patogenesi delle MPN.
In fede,
Prof. Alessandro Maria Vannucchi
