Regolazione genica nei batteri e nei batteriofagi

Principi di genetica - Robert J. Brooker
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Soluzioni ai problemi del Capitolo 14
Domande concettuali
C1. Un gene costitutivo non è regolato, il che significa che i suoi livelli di espressione sono
relativamente costanti. Invece, l’espressione di un gene regolato varia in diverse condizioni. Nei
batteri, la regolazione dei geni avviene di solito a livello trascrizionale, mediante l’azione
combinata di diverse proteine ed effettori. Inoltre, l’espressione genica può essere regolata a livello
della traduzione, oppure a livello della funzione di una proteina, dopo che è avvenuta la traduzione.
C2. Nei batteri, la regolazione genica aumenta enormemente l’efficienza della crescita cellulare.
Serve parecchia energia per trascrivere e tradurre i geni. Perciò una cellula è molto più efficiente e
compete meglio nel suo ambiente se esprime soltanto quei geni i cui prodotti siano necessari. Per
esempio, un batterio esprimerà i geni necessari al metabolismo del lattosio solo quando viene
esposto a questo zucchero. Se nell’ambiente il lattosio è assente, questo geni vengono spenti. Allo
stesso modo, quando i livelli citoplasmatici di triptofano sono alti vengono repressi i geni necessari
per la biosintesi di questo aminoacido.
C3. In questo caso sono coinvolti un inibitore e un attivatore. Il legame dell’inibitore all’attivatore
impedisce il legame al DNA e quindi la capacità di attivare la trascrizione.
C4.
A. Proteina di regolazione
B. Effettore
C. Segmento di DNA
D. Effettore
E. Proteina di regolazione
F. Segmento di DNA
G. Effettore
C5. B e C sono corrette. In entrambi i casi la presenza di un piccolo effettore spegne la trascrizione.
Invece, la presenza di un induttore attiva la trascrizione.
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C6. Una mutazione con effetto in cis si trova all’interno di una sequenza di regolazione, per
esempio un operatore, che influenza il legame di una proteina regolativa. Una mutazione con effetto
in cis influenza soltanto i geni adiacenti, che sono sotto il controllo della sequenza di regolazione.
Una mutazione con effetto in trans di solito è un gene codificante una proteina di regolazione. Essa
può essere complementata in un esperimento nel quale si costruisce un merozigote, introducendo un
gene normale che codifica la proteina regolativa.
C7. Adattamento enzimatico significa che un certo enzima viene prodotto solo se la cellula è
esposta al substrato di quell’enzima. I geni che codificano l’enzima coinvolto nel metabolismo del
substrato sono espressi solo quando la cellula è stata esposta al substrato stesso.
C8.
A. La trascrizione non avverrebbe, l’operone lac non potrebbe essere espresso.
B. Non avverrebbe la regolazione, l’operone sarebbe continuamente acceso.
C. Il resto dell’operone funzionerebbe normalmente, ma non sarebbe prodotta la transacetilasi.
C9. Sarebbe impossibile accendere l’operone lac in presenza di lattosio, perché il repressore
resterebbe legato all’operatore.
C10. La crescita diauxica è il fenomeno per cui una cellula dapprima utilizza completamente un tipo
di zucchero (per esempio il glucosio), poi inizia a metabolizzare un secondo zucchero (per esempio
il lattosio). In questo caso interviene la regolazione genica. Quando una cellula è esposta a entrambi
gli zuccheri, l’assunzione di glucosio produce una riduzione dei livelli intracellulari di cAMP. A
seguito di ciò la proteina attivatrice del catabolita (CAP) si dissocia dall’operone lac, che non viene
più attivato da questa proteina.
C11.
A. Effetto in cis. Sarebbero influenzati solo i geni dell’operone adiacente.
B. Effetto in trans. Questa mutazione influenza una proteina che si muove all’interno della cellula.
C. Effetto in trans. Questa mutazione influenza una proteina che si muove all’interno della cellula.
D. Effetto in cis. Sarebbero influenzati solo i geni delll’operone adiacente.
C12. Una mutazione che impedisce al repressore lac di legarsi all’operatore renderebbe l’operone
costitutivo soltanto in assenza di glucosio. Tuttavia questa mutazione non sarebbe del tutto
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costitutiva, perché in presenza di glucosio la trascrizione sarebbe inibita. Lo svantaggio di
un’espressione costitutiva di questo operone è che la cellula sprecherebbe molta energia,
trascrivendo i geni e traducendo gli mRNA anche quando il lattosio non è presente.
C13. La proteina AraC si lega agli operatori araI, araO1, e araO2. Il legame agli ultimi due inibisce
la trascrizione del gene araC. Allo stesso modo, le proteine AraC si legano a araO2 e araI
per reprimere l’operone. In questo caso le proteine legate ai due siti inducono la formazione di un’ansa nel
DNA. Questo impedisce all’RNA polimerasi di trascrivere l’operone. In assenza di arabinosio, l’operone è
spento. Quando le cellule sono esposte all’arabinosio, esso si lega alla proteina AraC e rompe l’interazione
tra le proteine ai siti araO2 e araI . In questo modo l’ansa si apre; inoltre una seconda proteina AraC va a
legarsi al sito araI, attivando la trascrizione
C14.
A. Senza araO2, la repressione dell’operone ara non potrebbe avvenire. L’operone sarebbe espresso
in maniera costitutiva ad alti livelli, perché la proteina AraC potrebbe ancora attivare la trascrizione
dell’operone legandosi ad araI. La presenza di arabinosio non avrebbe effetto. Nota che il legame
dell’arabinosio con AraC non è necessario per formare il dimero di AraC in corrispondenza di araI.
Il dimero si può formare perchè l’ansa è stata aperta. Puoi comprendere questo punto tenendo conto
che il dimero di AraC si lega con araO1 in presenza o assenza di arabinosio (Figura 14.7).
B. Senza araO1, la proteina AraC sarebbe sovraespressa, e probabilmente sarebbe necessario più
arabinosio per rimuovere la repressione. Inoltre, l’attivazione sarebbe di maggiore entità, perché ci
sarebbe più proteina AraC disponibile.
C. Senza araI, la trascrizione dell’operone ara non può essere attivata. Potresti osservare un livello
molto basso di trascrizione costitutiva.
D. Senza araO2 non ci sarebbe repressione dell’operone ara, tuttavia mancando anche araI non
sarebbe attivata la trascrizione. Potresti osservare un livello molto basso di trascrizione costitutiva.
C15. Attenuazione significa che la trascrizione viene terminata prima che sia raggiunta la fine
dell’operone. Si tratta perciò di una forma di regolazione trascrizionale, anche se nel meccanismo ha
un ruolo la traduzione della regione trpL.
C16.
A. L’attenuazione non avverrebbe perché si formerebbe l’ansa 2-3.
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B. L’attenuazione avverrebbe perché non si potrebbe formare l’ansa 2-3, quindi si avrebbe l’ansa 34.
C. L’attenuazione non avverrebbe perché non si potrebbe formare l’ansa 3-4.
D. L’attenuazione non avverrebbe perché non si potrebbe formare l’ansa 3-4.
C17. Un enzima triptofanil-tRNA sintetasi difettivo renderebbe meno probabile l’attenuazione.
Infatti la cellula avrebbe una quantità ridotta di tRNAtrp. Perciò sarebbe più probabile lo stallo del
ribosoma ai codoni del triptofano che si trovano nella sequenza Leader, anche quando i livelli
cellulari di triptofano fossero elevati.
C18. La presenza di G e C nella sequenza ricca in U dovrebbe prevenire l’attenuazione. La
sequenza ricca in U promuove la dissociazione dell’mRNA dal DNA, quando si forma l’ansa di
terminazione. Questo causa la dissociazione dell’RNA polimerasi dal DNA, e quindi la
terminazione della trascrizione. La sequenza UGGUUGUC probabilmente non si dissocerebbe, per
via della presenza di G e C. Ricorda che le coppie GC hanno tre legami idrogeno e sono più stabili
delle coppie AU che hanno solo due legami idrogeno.
C19. Se guardi con attenzione la sequenza di RNA nella Figura 14.9, noterai che un codone UAA si
trova proprio a valle della regione 2. Perciò in questo ceppo mutante il codone di stop UGA alla
fine della regione 1 potrebbe essere letto dal tRNAgly mutante, e il ribosoma si fermerebbe al codone di
stop UAA. Se il ribosoma si ferma qui, coprirebbe probabilmente una parte della regione 3 e così non si
formerebbe l’ansa di terminazione 3-4. In questo scenario non avviene l’attenuazione. Dobbiamo però anche
tenete conto della tempistica: il ribosoma dovrebbe arrivare molto vicino all’RNA polimerasi per impedire
l’attenuazione in questo ceppo mutante. E’ possibile che l’ansa 3-4 possa formarsi prima che il ribosoma
raggiunga il codone di stop UAA, rendendo attuabile l’attenuazione.
C20. Ci vuole molta energia per tradurre un mRNA in una proteina. Una cellula spreca meno
energia se previene l’inizio della traduzione piuttosto che una fase tardiva quale l’allungamento o la
terminazione.
C21. Un RNA antisenso è complementare a un RNA funzionale, come un mRNA. Il legame
dell’antisenso all’mRNA inibisce la traduzione
C22. Un meccanismo riguarda la possibilità che l’istidina agisca come corepressore, spegnendo la
trascrizione del gene dell’istidina sintetasi. Un secondo meccanismo potrebbe basarsi sul feedback
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inibitorio. Una terza possibilità è che l’istidina inibisca la traduzione dell’mRNA codificante
l’istidina sintetasi. Forse viene indotto un gene che codifica un RNA antisenso. Se la quantità di
istidina sintetasi è identica in presenza o assenza dell’istidina extracellulare, è più probabile un
meccanismo di feedback inibitorio, perché questo influenzerebbe solo l’attività dell’enzima e non la
sua quantità. Gli altri due meccanismi porterebbero a una diminuzione della quantità di istidina
sintetasi.
C23.
1. Operone lac: il legame dell’allolattosio causa un cambiamento conformazionale nel repressore e
la allontana dall’operatore.
2. Operone ara: il legame dell’arabinosio ad AraC rompe l’interazione ad ansa e porta
all’attivazione dell’operone.
3. Operone trp: il legame del triptofano al repressore trp porta al legame con l’operatore e inibisce
la trascrizione.
C24. Le due proteine si assomigliano nella loro capacità di legarsi al DNA e reprimere la
trascrizione. Esse differiscono per tre motivi. (1) riconoscono diverse molecole effettrici (il
repressore lac riconosce l’allolattosio, e il repressore trp riconosce il triptofano). (2) L’allolattosio
causa il rilascio del repressore lac dall’operatore, mentre il triptofano induce il legame del
repressore trp al suo operatore. (3) Le sequenze degli operatori riconosciuti da queste proteine sono
diverse tra loro, altrimenti, il repressore lac potrebbe legarsi all’operatore trp e viceversa.
C25.
A. L’RNA antisenso di un repressore traduzionale spegnerebbe la sintesi proteica più rapidamente.
Un repressore trascrizionale spegnerebbe la sintesi di mRNA, e riuscirebbe a spegnere la sintesi
proteica dopo che l’mRNA preesistente sia stato degradato. Il feedback inibitorio non avrebbe
effetto sulla sintesi proteica .
B. Soltanto un repressore trascrizionale potrebbe inibire la sintesi dell’mRNA.
C. Il feedback inibitorio sarebbe la via più rapida per inattivare la funzione di una proteina. L’RNA
antisenso e i repressori trascrizionali riuscirebbero ad annullare la funzione della proteina dopo che
le molecole preesistenti (mRNA e proteina) siano state degradate.
C26. Nel ciclo litico il virus dirige la cellula batterica a produrre molte particelle fagiche, fino alla
lisi cellulare e al rilascio dei fagi. Nel ciclo lisogeno, il genoma virale si integra in quello della
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cellula ospite sotto forma di profago. Il fago resta in questo stato dormiente fino a che qualche
stimolo lo porta a escindersi dal cromosoma batterico ed entrare nel ciclo litico.
C27.
A. Sarebbe avviato il ciclo lisogeno, perché la proteina cro è necessaria per avviare il ciclo litico.
B. Sarebbe avviato il ciclo litico, perché il gene cI codifica il repressore di λ, che impedisce il ciclo
litico.
C. Sarebbe avviato il ciclo litico, perché la proteina cII è necessaria per avviare il ciclo lisogeno.
D. Potrebbero essere avviati entrambi i cicli, ma quello lisogeno fallirebbe, perché il fago non
sarebbe in grado di integrarsi nel cromosoma ospite.
E. Non avverrebbe alcun ciclo.
C28. La regione OR contiene tre operatori e due promotori. PRM e PR trascrivono nelle direzioni
opposte. Il repressore di λ si lega prima a OR1 e poi a OR2. Questo legame inibisce la trascrizione da
PR e quindi causa il passaggio al ciclo litico. Nelle fasi iniziali del ciclo lisogeno, il repressore di λ
aumenta in concentrazione fino a legarsi a OR3. Successivamente la concentrazione del repressore
diminuisce, e sarà rimosso anzitutto da OR3. Questo permette la trascrizione da PRM e mantiene il
ciclo lisogeno. Per confronto, la proteina cro ha la sua massima affinità per OR3 e si lega anzitutto a
questo sito. Ciò blocca la trascrizione da PRM e perciò spegne il ciclo lisogeno. La proteina cro ha
un’affinità confrontabile per OR1 e OR2 e quindi successivamente si può legare ad entrambi questi
siti. Ciò riduce l’espressione da PR che nella fasi tardive del ciclo litico non è più necessaria.
C29. PRE viene attivato dal complesso cII-cIII. Successivamente durante il ciclo lisogeno la quantità
del complesso diminuisce notevolmente. Questo impedisce ulteriore sintesi del repressore di λ.
Tuttavia il repressore può attivare la propria trascrizione da PRM. Ciò manterrebbe il ciclo lisogeno.
C30. Anzitutto farebbe aumentare la proteina cro, per cui sarebbe favorito il ciclo litico.
C31. Una cellula che porta il profago λ produce una quantità significativa di repressore. Se un altro
fago infetta la cellula, il repressore di λ inibisce la trascrizione da PR e PL e perciò inibisce gli stadi
precoci che sono comuni al ciclo litico e ciclo lisogeno.
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C32. Nessuno dei due cicli avrebbe seguito, perchè come si vede nella Figura 14.14 la proteina N è
necessaria per ottenere un trascritto lungo da PL e avere il ciclo lisogeno, ma anche per ottenere un
trascritto lungo da PR e avere il ciclo litico.
C33. Un interruttore genetico è una sequenza di DNA che governa la scelta tra due percorsi
genetici. Il segmento di DNA di solito contiene molti operatori, che sono riconosciuti da due o più
proteine di regolazione trascrizionale. Un interruttore genetico si comporta come un operatore,
perché il legame delle proteine al DNA è l’evento che controlla la trascrizione. La differenza
principale è il livello di complessità. Un operatore di solito controlla un singolo gene o un singolo
operone, invece l’interruttore genetico possiede molti operatori e controlla la scelta tra due o più
promotori.
C34. Se il ceppo F- è lisogeno per il fago λ, la cellula possiede anche il repressore. Se la cellula Friceve il materiale genetico dal ceppo Hfr, questo non dovrebbe avere un effetto sul ciclo lisogeno
che è stato già stabilizzato nella cellula F-. Invece se il ceppo Hfr è lisogeno per il fago λ, ma non lo
è il ceppo F-, viene trasferito il profago integrato, ma la cellula ricevente F- non contiene nel proprio
citoplasma il repressore di λ. Perciò questo DNA di λ potrebbe avviare sia il ciclo litico che il ciclo
lisogeno. Se sceglierà il ciclo litico, avverrà la lisi della cellula ricevente.
Domande sperimentali
S1.
A. Per misurare il livello di espressione dell’operone lac è stato utilizzato β-ONPG. Nello specifico,
il taglio enzimatico di β-ONPG, che produce la sostanza gialla, richiede l’azione della βgalattosidasi. Perciò il saggio misura indirettamente la quantità di questo enzima. La ragione per cui
non c’è colore giallo in una delle provette è che il repressore previene l’espressione dell’operone
lac, e questo a sua volta impedisce l’espressione dell’enzima β-galattosidasi. Altri metodi che
possono misurare i livelli di espressione dell’operone possono essere quello di eseguire un Northern
blot per misurare i livelli di mRNA prodotti dall’operone lac, oppure eseguire un Western blot per
riconoscere una delle tre proteine prodotte dall’operone lac, o infine misurare l’incorporazione di
lattosio marcato con radioisotopi da parte delle cellule batteriche. In quest’ultimo caso verrebbe
valutata l’attività della permeasi.
B. Il merozigote ha due copie del gene lacZ, per cui produce β-galattosidasi in quantità duplice.
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S2. Nei campioni caricati nelle corsie 1 e 4 ci attendiamo che il repressore sia legato all’operatore,
perché il lattosio non è presente. Nel campione della corsia 4 la proteina CAP può ancora legarsi a
cAMP, perché manca il glucosio. Tuttavia non c’è una vera differenza tra la corsia 1 e 4, per cui
non risulta che CAP possa attivare la trascrizione se il repressore lac è legato. Se confrontiamo i
campioni caricati nelle corsie 2 e 3, il repressore lac non si lega in ambedue i casi, e nel campione
della corsia 3 non si lega neppure CAP. C’è meno trascrizione nella corsia 3 rispetto alla 2, ma
siccome la trascrizione avviene anche nella corsia 3 dobbiamo concludere che la rimozione di CAP,
dovuta alla riduzione del livelli di cAMP, non prevenga completamente la trascrizione. Nel
complesso, i risultati indicano che il legame del repressore lac è più efficace nell’impedire la
trascrizione dell’operone lac rispetto alla rimozione di CAP.
S3. Nel ceppo normale l’operone lac sarebbe indotto e l’espressione dell’mRNA sarebbe massina
(corsia 1). Lo stesso avverrebbe nella corsia 2, perché il repressore lac è stato inattivato. Nella
corsia 3 non avremmo visto nessun mRNA perché il repressore lac non si lega all’allolattosio.
Perciò il repressore resta legato all’operatore anche in presenza di lattosio. Nella corsia 4 la proteina
CAP non attiverebbe la trascrizione. Probabilmente vedresti un livello minimo di trascrizione. Nei
terreni senza lattosio potresti vedere una banda solo nella corsia 2. Il solo ceppo che verrebbe
indotto sarebbe quello mancante del repressore lac funzionale.
S4.
A. Sì, se non effettui la sonicazione la β-galattosidasi non sarà rilasciata dalla cellula per cui non si
osserverà la colorazione giallastra. Potresti osservare solo una lieve colorazione dovuta a una
minima incorporazione di β-ONPG nella cellula.
B. No, dovresti ancora osservare la colorazione giallastra nelle prime due provetta anche se avessi
dimenticato di aggiungere il lattosio, perché il ceppo che non ha coniugato non ha un repressore lac
funzionale.
C. Sì, se hai dimenticato di aggiungere β-ONPG non avresti la colorazione, che viene prodotta dalla
scissione di questo composto da parte della β-galattosidasi.
S5. I dati indicano che i due operatori sono necessari perché per avere alti livelli di repressione hai
bisogno di O1 più O2 oppure O3. Se sono necessari i tre operatori, la delezione di ciascuno di essi
avrebbe dovuto prevenire elevati livelli di repressione, ma questo non è stato osservato.
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S6. Potresti far coniugare con il ceppo mutante un ceppo che porta un fattore F’ con un operone lac
normale e un normale gene lacI. Siccome la mutazione è nell’operatore, dovresti avere
l’espressione della β-galattosidasi anche in assenza di lattosio.
S7. Sembra essere una mutazione nel sito operatore, per cui un repressore non si può legare e
impedire l’espressione dell’operone lac in assenza di lattosio.
S8. In questo caso le cose sono più complicate, perché AraC è sia una proteina repressore che un
attivatore. Se mancasse AraC a causa di una mutazione, non ci sarebbe repressione o attivazione
dell’operone ara, in presenza o assenza di arabinosio. L’operone sarebbe espresso solo a bassi
livelli costitutivi. L’introduzione di un gene araC normale nel batterio, su di un fattore F’, dovrebbe
ripristinare la normale regolazione (un effetto in trans).
S9. I risultati suggeriscono che c’è una mutazione nella proteina AraC. per cui essa non lega
l’arabinosio anche se si lega ancora correttamente ai siti dell’operatore.