Colture cellulari - Dipartimento di Farmacia

Sezione di Farmacologia, Dipartimento Farmacobiologico
Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Bari Aldo Moro
Colture cellulari
Prof. Diana Conte
Prof. Jean-François DESAPHY
COLTURE CELLULARI
Sistemi semplificati per mantenere in vitro (ex-vivo) cellule in vita
Cellule procariotiche: batteri
Cellule eucariotiche: cellule animali o vegetali
Norme di Sicurezza per l’uso delle
colture cellulari
Norme di Sicurezza per l’uso delle
colture cellulari
Es.
Cellule geneticamente modificate
Virus altamente infettivi
Cellule tumorali
COLTURE CELLULARI
Alcuni applicazioni
Studi di fenomeni biologici legati alla crescita, differenziamento, e morta cellulare
(cancerogenesi, apoptosi, …)
Studi di genetica, della struttura e della funzione dei geni
Studio dei meccanismi molecolari/cellulari coinvolti nelle funzioni cellulari
Strumenti per la biologia molecolare (amplificazione genica, produzione/estrazione
di proteine …)
Strumenti per test di tossicità (Test di AMES, …)
Strumenti per la terapia
(Terapia cellulare, cellule staminali, terapia genica, rigenerazione tessutale,
produzione di farmaci biotecnologici)
COLTURE CELLULARI
Alcuni vantaggi
Aspetto etico: permette di ridurre la sperimentazione animale o umana
Standardizzazione facile, elevata riproducibilità dei risultati
Semplificazione del sistema: meccanismi cellulari e molecolari
Semplicità d’uso, costi limitati
Alcuni svantaggi
Semplificazione del sistema: limiti nell’applicazione del risultato in vivo
Rischi di contaminazione richiedono attenzioni particolari e controllo qualità
con relativi costi
CONDIZIONI DI COLTURA
Riprodurre al meglio le condizioni fisico-chimiche di sopravivenza delle cellule:
fabbisogno energetico: (nutrienti, minerali, ioni, aminoacidi, glucosio, vitamine …)
pH, Temperatura, osmolarità
Fattori di crescita per favorire la proliferazione cellulare
Ormoni ed altre molecole indispensabili per mantenere funzioni cellulari specifiche
Protezione
Terreni di coltura
Strumenti di incubazione
celllule
AMBIENTE STERILE e CONTROLLATO
SUPPORTI PER COLTURE CELLULARI
Fiasche o piastre di vetro o plastica
Piastre con pozzetti
Supporti sterili
vetro a 150°C/autoclavato
plastica monouso sterile
Supporti per colture
di cellule adese
Supporti aderenti trattati chimicamente
#
Coltura in sospensione
Permettono scambi gassosi
La scelta dipende dal tipo cellulare e dalla
quantità di cellule
Fiasche col tappo permettono il trasporto
al di fuori dell’ambiente sterile
Beuta per colture
di cellule
in sospensione
nell’incubatore
ad agitazione
TERRENI DI COLTURA
TERRENI DI COLTURA
combustibile Antibiotici per la protezione
Fattori di crescita
Indicatore colorato del pH
Osmolarità, normale funzione cellulare
Sistema tampone del pH: bicarbonate/CO2
Precursori metabolici, numerosi funzioni cellulari
Sintesi proteica, precursori metabolici
giallo acido
rosso a pH 7.4
viola basico
Antibiotici (streptomicina/penicillina)
Siero
Terreno di coltura
Sistema filtrante: diametro dei pori 0.22 µm
INCUBATORI
Gli incubatori sono strumenti che permettono di mantenere costanti:
la temperatura (spesso 37°C)
varia in funzione del tipo cellulare e dell’organismo originario
la concentrazione in anidra carbonica CO2
l’atmosfera interno all’incubatore è composto da 5% CO2 / 95% aria
corrisponde alla pressione parziale di CO2 nei tessuti di mammiferi
permette di mantenere il pH a 7.4 con il bicarbonato
tasso di umidità saturo
CAPPA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE
Tavolo da lavoro per la manipolazione delle
cellule, attrezzato da una cappa che
mantiene la sterilità dell’ambiente:
Filtro d’estrazione HEPA
30%
Lampada UV
Accesa tra i periodi di attività
FAN
70%
Filtro di lavoro HEPA
High Efficiency Particulate Air
aria
sterile
cell
aria contaminata
Operatore
30%
camicie
guanti
mascherina
TIPI DI COLTURA CELLULARI
Colture primarie:
Cellule isolate dall’organismo
Conservano le proprietà funzionali delle cellule in vivo
Sopravivenza limitata a qualche ore
Colture secondarie:
derivano da colture primarie per divisione
Attività funzionale ridotta, de-differenziamento
vita limitata
Linee cellulari continue
cellule in continua proliferazione
cellule de-differenziate
proprietà pressoché costanti
durata illimitata
COLTURE CELLULARI PRIMARIE
Organismo (uomo, animale, pianta, embrione)
prelievo
tessuto (biopsia) o liquido
Dissezione
Isolamento,
frammentazione del tessuto
(ferri)
Incubazione, Lieve agitazione Dissociazione
Enzimi proteolitici (tripsina, collagenasi …)
Chelanti del Ca2+
rottura della matrice extracellulare
distacco delle cellule
Selezione
Coltura primaria
centrifugazione, gradienti di densità
adesione su uno substrato specifico
Cell sorter, microdissezione a laser
Fluorescent cell sorter
Microdissezione con laser
COLTURE CELLULARI SECONDARIE
La maggior parte delle cellule primarie possono
dividersi fino a raggiungimento della confluenza
(molte cellule tumorali e staminali vanno oltre)
Subcolture (passaggi)
Incubazione con tripsina-EDTA per qualche minuti
Agitazione meccanica
Ri-sospensione in medium di coltura
Semina
Colture secondarie
ESPRESSIONE DELLA TELOMERASI
Enzima che mantiene e stabilizza i telomeri, strutture che terminano i cromosomi
proteggendogli dalla degradazione progressiva che si verifica dopo ogni divisione
cellulare.
Dopo vari cicli di divisione, i telomeri di una cellula normale si consumano fino ad
impedire la replicazione del DNA. La cellula diventa senescente, perde la
capacita di dividersi.
Nelle cellule germinali, staminali, ed in numerosi cellule maligne, la sovraespressione della telomerasi mantiene i telomeri, permettendo la continua
divisione cellulare.
2008© J.F. DESAPHY
IMMORTALIZZAZIONE
LINEE CELLULARI CONTINUE
CONGELAMENTO / SCONGELAMENTO
Le sub-colture di linee cellulari favoriscono l’insorgenza di mutagenesi spontanea ed
aberrazioni cromosomiche
Il mantenimento di cellule in coltura costa e non serve durante periodi di inattività
Il congelamento è necessario per
- risparmiare spazio e costi
- limitare l’invecchiamento delle cellule
Incubazione con tripsin-EDTA
Ri-sospensione in un terreno specifico
(terreno di crescita, 30% siero, 1% DMSO)
Trasferimento in cryovials
Congelamento a -20°C
Conservazione a -180-190 °C
(azoto liquido o freezer)
Scongelamento rapido nel cryovial
(acqua calda del rubinetto)
Aggiunta di terreno di coltura
Centrifuga (1000 rpm, 5 min)
Eliminazione sovranatante
Ri-sospensione del pellet in terreno
Semina
Colture cellulari utilizzate nella Sezione di Farmacologia
Facoltà di Farmacia, Bari
Colture primarie
Cellule muscolari scheletriche:
test di tossicità
patch-clamp
citofluorescenza
Cellule beta pancreatiche:
patch-clamp
test di tossicità
Linee cellulari continue
HEK293
(human embryonic kidney cells)
SH-SY5Y
(cellule di neuroblastoma umano)
C2C12
(cellule satelliti muscolari murine)
espressione eterologa di proteine
patch-clamp
test di tossicità
test di tossicità
patch-clamp
test di tossicità
patch-clamp
ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE
Permette di fare esprimere ad una linea cellulare la proteina che si vuole studiare
attraverso il trasferimento del gene codificante la proteina (trasfezione genica).
Incubazione
per qualche ore
Cellule al 70% di confluenza
Plasmide contenente il cDNA
codificante la proteina
Gene di resistenza ad un antibiotico
Trasfezione transitoria
Il gene penetra in cellula
ma non si integra nel genoma
Selezione clonale
Trasfezione
permanente
Il clone deriva
da una cellula unica.
Sono tutte uguali
alla cellula madre,
Esprimono tutte la proteina
Il gene si è integrato
nel genoma della cellula
Dopo 24 ore, le cellule
esprimono la proteina.
Dopo 3-4 giorni,
l’espressione cessa.
Incubazione con antibiotico
Solo le cellule esprimenti
il gene di resistenza sopravvivono
Isolamento di un clone
ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE
Alcuni metodi di trasfezione
• Trasfezione mediante DEAE-destrano
• Trasfezione mediante calcio-fosfato (il DNA penetra nel citoplasma
per endocitosi e viene trasferito al nucleo)
• Elettroporazione (impulsi elettrici ad alto voltaggio portano alla
formazione di pori in nm nella membrana plasmatica che permettono
l’ingresso del DNA)
• Trasfezione mediante liposomi (DNA ed RNA incapsulato in
liposomi entrano nella membrana cellulare in seguito a fusione delle
membrane)
• Microiniezione (trasferimento diretto in vitro), bombardamento con
particelle metalliche microscopiche rivestite di DNA (in vivo)
• Trasduzione impaccamento del DNA all’interno dei virus animali
ESPRESSIONE ETEROLOGA DI CANALI IONICI
Canali ionici
gene del canale
PLASMIDE
SINTESI PROTEICA
recettore di membrana
proteina fluorescente
nucleo
Permette di individuare facilmente
sotto microscopio le cellule trasfettate
gene reporter
La linea cellulare non deve esprimere canali ionici endogeni simili al canale trasfettato
Permette di studiare canali ionici umani o animali, senza ricorrere a biopsie
Permette di studiare canali mutati (fabbricati in vitro mediante mutagenesi):
mutazioni “naturali”, responsabili di malattia nell’uomo:
cosa determina la mutazione ? (relazione genotipo/fenotipo)
la mutazione modifica l’azione dei farmaci ? (farmacogenetica)
mutazioni “non naturali”:
come funziona il canale ? (biofisica molecolare)
come viene modulata ? (fisiologia)
dove si lega il farmaco ? (farmacologia molecolare)
FINE