IMMUNOISTOCHIMICA
§ branca dell’istochimica in cui si ottiene la
localizzazione di sostanze nelle cellule e nei
tessuti con l’impiego di reazioni tra antigene e
anticorpo
§ Antigene è qualsiasi sostanza che, introdotta in
un organismo, è capace di stimolare la
produzione di anticorpi da parte dell’organismo
stesso e di reagire specificamente con questi
anticorpi
§ Gli anticorpi sono molecole che un organismo
produce in risposta ad un antigene e sono
capaci di reagire specificamente con esso
ANTIGENE
§ Perché una molecola funga da antigene occorre che:
§ contenga una porzione con struttura chimica diversa dalle
molecole proprie dell’organismo
§ abbia una massa sufficientemente grande
§ Aptene (o determinante antigenico) :
§ è la porzione caratteristica dell’antigene riconosciuta come
estranea dall’organismo e con cui reagiscono gli anticorpi
specifici
§ aptoforo o “carrier’:
§ la parte rimanente della molecola, aspecifica e in grado di
conferire all’antigene una dimensione sufficiente a stimolare la
risposta anticorpale
§ Solo quando l’antigene è
completo (aptene più
aptoforo) è in grado di stimolare la risposta anticorpale
ANTICORPI
§ gli anticorpi constano di:
1) una porzione capace di legarsi all’aptene
§ diversa per struttura
a seconda dell’aptene medesimo
(frammento legante l’antigene o, ‘antigen binding
fragment’, in sigla Fab)
2) una porzione costante per gli anticorpi di una
medesima classe (in sigla Fc)
§ gli anticorpi sono glicoproteine: i residui
glicidici sono legati al frammento costante
CARATTERISTICHE DELLE CLASSI
PRINCIPALI DEGLI ANTICORPI
NELL’UOMO
Caratteristiche
Catene pesanti
Catene leggere
Numero di unità costituite
da 4 catene
Classe anticorpale
IgG
IgA
γ
α
Κ oλ
Κ oλ
IgM
µ
Κ oλ
IgD
δ
Κ oλ
5
1
1
1o2
1
10
<1
75
15
<1
++++
-
++
-
-
Passaggio attraverso la
barriera ematoplacentare
-
-
+
-
-
Stabilisce legami con
macrofagi e neutrofili
-
-
+
-
-
Stabilisce legami con
mastociti e basofili
-
-
-
-
+
Percentuale del contenuto
totale di Ig nel sangue
Attivazione del
complemento
IgE
ε
Κ oλ
MATURAZIONE DEI LINFOCITI B
REAZIONE ANTIGENE ANTICORPO
§ la reazione tra antigene e anticorpo avviene
grazie a:
§ congruenza della superficie molecolare tra
i siti attivi
di entrambe le molecole
§ legami di tipo debole (ponti di idrogeno, forze di van
der Waals, attrazione tra dipoli)
§ la reazione tra antigene e anticorpo è specifica
§ un antigene reagisce solo con gli anticorpi prodotti in
risposta ad esso e diretti contro di esso
§ un anticorpo reagisce solo con l’antigene dal quale è
stato evocato e contro il quale è diretto
§ La specificità della reazione tra antigene e
anticorpo è paragonata a quella tra una chiave e
la sua serratura.
PRODUZIONE DI ANTICORPI
§ Per quanto riguarda la produzione
degli anticorpi impiegati in
immunoistochimica, si hanno a
disposizione due possibili metodi:
§ produzione di anticorpi policlonali
§ produzione di anticorpi monoclonali
§ Monoclonal antibodies for cancer. ADEPT, antibody directed
enzyme prodrug therapy; ADCC, antibody dependent cellmediated cytotoxicity; CDC, complement dependent cytotoxicity;
MAb, monoclonal antibody; scFv, single-chain Fv fragment
MARCATURA DEGLI ANTICORPI
§ gli anticorpi contro un determinato antigene
devono essere marcati con un composto
riconoscibile al microscopio
§ si possono utilizzare:
1) fluorocromi (isotiocianato di fluoresceina o di
rodamina)
2) perossidasi di rafano, (HRP)
3) fosfatasi alcalina
4) ferritina
5) oro colloidale
6) Altro..
ALLESTIMENTO DI PREPARATI IMMUNOISTOCHIMICI
§i procedimenti da eseguire sui tessuti
per dimostrare le molecole desiderate,
possono essere:
§ Metodo diretto
§ Metodo indiretto
Varianti:
§ Metodo con immunocomplessi
§ metodo diretto con avidina biotina
§ Metodo indiretto con avidina biotina
§ Metodo indiretto con avidina biotina ABC
•
La biotina (o vitamina H o vitamina B8) venne
scoperta a seguito di alcuni studi riguardanti le
alterazioni cutanee e della crescita verificatesi in
animali nutriti esclusivamente con albume d'uovo
crudo o proteine da esso estratte.
•
Il fattore responsabile della comparsa della "malattia
da bianco d'uovo" venne individuato nel 1931 e si è
visto che esso è indispensabile per la corretta crescita
dei mammiferi.
•
Oggi è noto il fenomeno alla base di tale patologia: il
legame tra la biotina e l'avidina (una glicoproteina
dell'albume d'uovo).
•
L'avidina è, infatti, resistente all'azione proteolitica
dell'appartato gastrointestinale per cui il legame con la
biotina rende quest'ultima non assorbibile.
§ L'avidina è una glicoproteina tetramerica che lega
specificamente la biotina.
§ L’avidina è un fattore antinutrizionale poiché
agisce chelando la biotina che è presente negli
alimenti costituiti da proteine di deposito, come
uova e semi.
§ Nell’uovo crudo la biotina è chelata dall’avidina;
per rompere questo legame bisogna denaturare la
glicoproteina con un'azione termica, la cottura, in
questo modo viene liberata la biotina.
§ L’avidina è cosi chiamata per l’avidità con cui tiene
la biotina.
CONTROLLI DELLE REAZIONI
IMMUNOISTOCHIMICHE
§ Alcuni esempi di controllo
§ trattamento del tessuto con il solo agente marcante
§ trattamento del tessuto solo con il primo anticorpo
§ trattamento del tessuto solo con il secondo
anticorpo (nel metodo indiretto)
§ preadsorbimento dell’anticorpo con l’antigene
prima del trattamento del tessuto
§ Solo nel caso che le reazioni di controllo
della specificità siano negative si può
accettare come specifico il risultato positivo
di una reazione inimunoistochimica.
