RT PCR NELLAGENETICA DELLA
CELIACHIA
Dott. Ignazio Brusca
U.O. di Patologia Clinica
Ospedale “Buccheri La Ferla” FATEBENEFRATELLI Palermo
Direttore d.ssa Stella Maria La Chiusa
Complex Disorders are due to the interaction between genetic
determinants and environmental factors
Genetic Determinants
Gene1
Gene3
Environmental Factors
Gene2
Gene4
►Complex Disorders do not exhibit simple Mendelian
inheritance patterns.
►A number of susceptibility loci may exist for a complex
disorder (a susceptibility locus increases the risk of
developing the disease but it is not sufficient to
produce the disease).
►Mutations at different susceptibility loci confer a small
increase in disease risk (less than 100%): Locus
Heterogeneity.
► Different loci “interact” to
increase
susceptibility: Gene-Gene Interaction
disease
►Modifier loci may influence the phenotype of a complex
disorder .
Celiac Disease : Complex Disorder
Wolters VM , Cisca W Am J Gastroenterol 2008;103:190–195
Celiac disease: strongly heritable, oligogenic, but genetically complex.
King AL, Ciclitira PJ. Mol Genet Metab. 2000 Sep-Oct;71(1-2):70-5
Principali Loci Genici di Suscettibilità alla malattia Celiaca
CELIAC1
CELIAC2
CELIAC3
CELIAC4
Regione genica 6p21
Include i geni di classe II HLA-DQ2 e HLA-DQ8
Regione genica 5q31-33
Include un cluster di geni per alcune citochine
(IL4, IL13, IL5,IL3)
Regione genica 2q33
Include i geni regolatori per i linfociti:
CD28, CTL4 e ICOS
Regione genica sul Cromosoma 19p13.1
Include il gene MY09B
CELIAC1
► Gli aplotipi B8-DR3-DQ2 e B18-DR3-DQ2 sono risultati associati
alla malattia celiaca.
► Questi aplotipi sono molto diversi tra loro (specificità allelica):
l’unica sequenza CONSERVATA è quella del DR3-DQ2
CELIAC1
A. Molecola DQ2 formata da una catena proteica α codificata dall’allele HLA-DQA1*0501 e da una
catena proteica β codificata dall’allele HLA-DQB1*0201 presenti sullo stesso cromosoma
parentale (configurazione in cis).
B. Molecola DQ2 formata da una catena proteica α codificata dall’allele HLA-DQA1*0505 e da una
catena proteica β codificata dall’allele HLA-DQB1*0202 presenti su cromosomi parentali
separati (configurazione in trans).
C. Molecola DQ8, formata da una catena proteica β codificata dall’allele HLA-DQB1*0302 e da
una catena proteica α codificata dall’allele HLA-DQA1*03 presenti sullo stesso cromosoma
parentale (configurazione in cis).
CELIAC1
Regione genica 6p21
Include i geni di classe II HLA-DQ2 e HLA-DQ8
► Nella maggior parte delle popolazioni studiate il 90% circa dei pazienti con
malattia celiaca presenta l’aplotipo DQ2 (a1*0501, b1*0201),
► il 5-8% dei pazienti presenta l’aplotipo DQ8,
► il 2-5% dei pazienti non presenta né l’aplotipo DQ2 né l’aplotipo DQ8.
► circa il 20-30% della popolazione generale presenta l’aplotipo DQ2
(a1*0501, b1*0201), ma di questi solo il 3% svilupperà la malattia celiaca,
► la condizione di omozigosi DQ2 è presente in circa il 2% della popolazione
europea e in circa il 25% dei pazienti
► altri geni non-HLA contribuiscono allo sviluppo della malattia, come
supportato dalla differenza nel rapporto di concordanza tra fratelli HLA
identici (30%ca)
Soltanto eterodimeri α/β DQ2
(DQA1*05, DQB1*02) e DQ8
(DQA1*03, DQB1*0302) legano
peptidi del glutine
CELIAC2
Regione genica 5q31-33
Include un cluster di geni per alcune citochine
(IL4, IL13, IL5,IL3)
Il locus CELIAC2 sul cromosoma 5q31–33 è stato
descritto per la prima volta da Greco et al. (2001).
Questa regione di 250Kb contiene un cluster di geni per
alcune citokine e potrebbe avere un ruolo nella
regolazione della risposta
immune e nel processo
infiammatorio.
CELIAC2
Per la MC sono stati analizzati molti probabili geni candidati nella regione 5q31-33
ma nessuna evidenza di associazione è stata definitvamente provata.
In questa regione è presente un aplotipo TC (1507C>T e -207G>C) all’interno del
cluster OCTN associato alla malattia Crohn .
Non è stata evidenziata alcuna associazione tra la MC è l’aplotipo TC. (Ryan
2004, Curley 2006, Latiano et al 2007).
CELIAC3
Regione genica 2q33
Include i geni CTL4, CD28 e ICOS, regolatori linfociti T
CTLA4, ICOS, e CD28 sono geni coinvolti nella regolazione dell’attività
dei linfociti T.
CD28 and ICOS (inducible co-stimulator) sono coinvolti nell’attivazione
delle T-cells.
CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) è un regolatore
negativo dell’ attivazione delle T-cells e compete con CD28 per gli
stessi recettori, CD80 e CD86.
CTLA4, ICOS, e CD28
Potenziali fattori di rischio nelle malattie autoimmuni.
CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)
type 1 diabetes
multiple sclerosis
Graves disease
L’associazione tra malattia celiaca e marcatori genetici
all’interno di CELIAC3 è stata osservata in diverse popolazioni
(Brophy 2006, Van Heel 2005).
Alcuni studi tuttavia non hanno confermato una relazione tra
variante genetica e malattia (Hunt 2005).
CELIAC3
Genetics in coeliac disease
Van Heel 2005
K Brophy et al. 2006
CELIAC4
Regione genica 19p13.1
Include il gene MY09B
Genome-wide association studies hanno portato all’identificazione di una
regione genica significativa nel cromosoma 19 (19p13.1).
In questa regione è incluso il gene IXB per la miosina (MYO9B) ,che, per la
sua funzione, si presta ad essere un buon gene candidato (Wolters 2008)
MYO9B CODIFICA PER UNA PARTICOLARE MOLECOLA DI MIOSINA
COINVOLTA
NEL
RIMODELLAMENTO
DELL’ACTINA
DEL
CITOSCHELETRO E DELLE TIGHT JUNCTIONS DEGLI ENTEROCITI
Myo
L’associazione tra MYO9B e MC proposta da Monsuur (2005) non è stata replicata in studi di
associazione in United Kingdom, Spagna , Italia e Scandinavia (Amundsen 2006,Giordano 2006,
Nunez 2006, Latiano 2007, Cirillo 2007).
Recentemente è stata dimostrata una associazione tra Colite Ulcerosa e varianti di MYO9B (IBD6)
suggerendo la condivisione di alcuni geni per la suscettibilità tra le due patologie (Weersma 2008,
Wolters 2008)
CELIAC4
Giordano 2006
Latiano 2007
►CCR Chemokine receptor cromosoma 3p21
►IL2/IL21 Interleukin-2 and interleukin-21 cromosoma 4q27
►IL12A Interleukin-12 cromosoma 3q25-26
►IL18RAP Interleukin-18 receptor cromosoma 2q11-12
►LPP Lipoma-preferred partner cromosoma 3q28
►RGS1 regulator of G-protein signaling 1 cromosoma 1q31
►SCHIP1 Schwannomin interacting protein 1 cromosoma 3q25-26
►TAGAP T-cell activation GTPase activating cromosoma protein 6q25
…. MICA molecules interact with the NKG2D-activating receptor
on human NK and CD8 T cells..... Villous atrophy in Celiac
disease might thus be ascribed to an IEL-mediated damage to
enterocytes involving NKG2D/MICA interaction after gliadininduced expression of MICA on gut epithelium......
Hüe S et al
Immunity. 2004 Sep;21(3):367-77
Increased prevalence of celiac disease without gastrointestinal
symptoms in adults MICA 5.1 homozygous subjects from the
Campania area.
Tinto N et al
Dig Liver Dis. 2008 Apr;40(4):248-52.
Linkage studies
Genome Wide
Linkage studies
Association studies
using SNP’s
Genomewide
Association studies
2008
2000
Oltre ai geni HLA II, almeno 20 altri geni sembrano essere coinvolti nella
suscettibilità alla MC, ognuno con un effetto relativo sul rischio di malattia
Geni coinvolti nell’ immunità
innata ed acquisita
Geni coinvolti nel mantenimento
dell’integrità della mucosa intestinale
Quanti sono i geni per la suscettibilità alla Malattia Celiaca ?
Sicuramente molti!
Il fattore genetico più importate a tutt’oggi è la specificità
HLA di classe II
Correlated sero-sensitivity
with Modified Marsh
Classification
31% sensitivity for serology
100% sensitivity
Rostami, Mulder et al. American J Gastroenterol 1999;94:888-894
Tipizzazione HLA
when?
Come supporto alla diagnosi in pazienti con sierologia negativa
Pazienti clinicamente sintomatici
Pazienti con quadro istologico intestinale
compatibile con celiachia
In pazienti con patologie associate a celiachia e con sierologia
negativa
•Anemia
•Stanchezza cronica
•Bassa statura
•Anoressia
•Epilessia
•Atassia
•Alopecia
•Ipertransaminasemia
•Abortività ripetuta
Tipizzazione HLA
when?
Per individuare soggetti da controllare nel tempo
In gruppi a rischio
Malattie autoimmuni
Sindrome di Down
Sindrome di Turner
Sindrome di Williams
Nei familiari di I grado
….437 Italian children with celiac disease, 834 firstdegree relatives, and 551 controls……Of patients, 91%
carried DQ2 and/or DQ8 heterodimers, 6% only had
beta2 chain, 2% was alpha5 positive, and four were
DQ2/DQ8/beta2/alpha5 negative……
Considering 1:100 disease prevalence, we obtained a
risk gradient ranging from 1:7 for DQ2 and DQ8
individuals down to 1:2518 for subjects lacking all
predisposing factors.
……The DQB1*02 and DQB1*0302 concurrence (p = 9 x
10(-4)), besides the DQB1*02/*02 homozygosity, had
an additional role in disease genetic determination.
…..The CD prevalence rose to 17.6% in sisters, 10.8%
in brothers, and 3.4% in parents….. In the three
groups, the subjects carrying high-risk HLA molecules
were 57%, 71%, and 58%; among them, 29%, 15%,
and 6% respectively had CD
Megiorni F et al. Hum Immunol. 2009 Jan;70(1):55-9
....homozygosis for the DQB1*0201 allele is associated with a
higher severity of the histological score (p<0.008)….
Jores RD et al Scand J Gastroenterol. 2007 Jan;42(1):48-53
……Patients with at least 1 DQB1*02 allele showed more
often a typical CD and diffuse histological lesions than did
patients in the other groups…..
…..tTGAb titers are HLA-DQB1*02 dose dependent, with
significantly higher levels in homozygous individuals.
Nenna R et al. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008 Sep;47(3):288-92
…..Development of tolerance to gluten
seems possible in some patients with
CD. Further follow-up will show whether
this tolerance is permanent or only a
long-term return to latency. This feature
may be associated with genetic
characteristics, especially with HLA
genotypes that differ from DQ2 or
DQ8…..
Hopman EG et al. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2008 ;20(5):423-9
PCR convenzionale
Amplificazione del cDNA tramite
PCR
1.
Sequenza di DNA target
2.
DNA polimerasi termostabile
(Termophilus aquaticus, Taq
polimerasi)
3.
4.
Due primers specifici per la
sequenza target
(oligonucleotidi di 15-25 bp)
dNTPs
Tradizionale reazione
multiciclica suddivisa in 3 fasi:
1. DENATURAZIONE
(94-96°C)
2. ANNEALING
(50-65°C)
3. EXTENSION
(72°C)
Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi)
Gli ampliconi ottenuti dopo uno specifico numero di cicli di
amplificazione
Vengono fatti migrare su un gel di agarosio
• quantità: ad occhio o mediante densitometria
In teoria:
il numero di molecole prodotte (P) incrementa esponenzialmente con
il numero di cicli di PCR (n)
Il prodotto di PCR dipende da T, numero di copie di template di
partenza
Resa teorica: 2n
P = (2)n T
l'efficienza della reazione dipende da:
– strutture secondarie dell'amplicone
– lunghezza dell'amplicone
– interazioni non specifiche (Primer, Dimers)
Resa effettiva: effetto
plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:
Quantità dei primers
Attività della Taq polimerasi
Log[DN
A]
Reannealing dei filamenti
Esponenzial
e
Plateau
Lineare
Prodotto
variabile
N° cicli
termici
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti
Vantaggi
1. Velocità e facilità d’uso
In poche ore si possono ottenere milioni di
copie della sequenza di DNA target
1. Sensibilità
Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di
una singola cellula come template
(contaminazione)
1. Robustezza
Amplificazione possibile anche utilizzando
DNA di bassa qualità
Svantaggi della PCR-end point
-tempo (PCR, gelcasting, loading,
running, staining, analysis)
-endpoint detection
-rischi di contaminazione
--Tossicità dell’ Ethidium bromide
-sensibilità variabile
-basso range dinamico < 2 logs
--non automatizzabile
--precisione discutibile
-risultati non numericamente
quantitativi
Soluzioni
Utilizzare i dati ottenuti durante la
fase esponenziale quando il
prodotto di PCR è proporzionale
al template iniziale
Questo è reso possibile mediante
il
rilevamento,
di
una
fluorescenza, che è proporzionale
al prodotto di PCR
La fluorescenza, durante ogni
ciclo di amplificazione, può
essere rilevata utilizzando uno
strumento quantitativo, ma anche
dei marcatori fluorescenti il cui
accumulo segue la stessa cinetica
della reazione di PCR
Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in
tempo reale durante la
fase esponenziale della
PCR, quando cioè
l ' e f f i c i e n z a d i
amplificazione è
influenzata minimamente
dalle variabili di reazione,
aumentando l’accuratezza
analitica rispetto alla PCR
tradizionale "end point "
PCR CONVENZIONALE
1. DNA extraction
2. amplification
4. Southern blotting
3. electrophresis
Real-time PCR
1. DNA extraction 2. Amplification and
quantitative result
Real-Time PCR: vantaggi
La metodica a sistema chiusa diminuisce la possibilità di
contaminazioni
Consente un notevole risparmio di tempo ( ultra-rapida (da 2 ore
fino a 30 minuti), nessuna fase post-PCR
Le analisi di melting consentono una rapida genotipizzazione e
l’identificazione di mutazioni di resistenza
non è influenzata da prodotti aspecifici
l'amplificazione può essere monitorata in real-time
ampio range dinamico di rilevazione (fino a 1010)
richiede 1000-volte meno RNA rispetto ai saggi convenzionali
(3 picogrammi)
può mettere in evidenza differenze di appena 2 volte
molto specifica, sensibile e riproducibile
non molto costosa
Real-Time PCR:
applicazioni
Quantificazione virale
Quantificazione dell’espressione genica
Efficacia della terapia farmacologica
Misura dei danni al DNA
Controllo di qualità e validazione dei saggi
Detenzione dei patogeni
Controllo degli OGM
Genotyping
MRD
Chimiche fluorescenti
per PCR Real-Time
•La fluorescenza si genera durante la PCR per
effetto di diverse possibili reazioni chimiche
•La PCR real-time si avvale di tre chimiche principali:
1.DNA-binding agents (SYBR Green)
2.Hydrolysis probes (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions)
3.Hybridization probes
Metodi di rilevamento della fluorescenza
SYBR Green
Dual-labeled (TaqMan)
Molecular beacons
Scorpion
Sonde FRET
Utilizza una molecola fluorescente aspecifica che si lega al
solco minore del dsDNA, dando luogo ad emissione
fluorescente nel verde (530nm)
Oligonucleotide che presenta
all’estremità 5’ un fluoroforo
p
“Reporter”(R) ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher” (Q)
vengono digerite durante la fase di elongazione
Contengono un fluoroforo (R) e un quencher (Q) alle estremità
opposte di un oligonucleotide, ma non vengono digerite
durante la fase di elongazione
Simile alle molecular probes, con la differenza che al 3’
terminale del probe vi è una sequenza primer specifica per
l’estensione del target.
Coppia di oligonucleotidi legati ciascuno ad un fluoroforo
“accettore” al 3’ della prima sonda e “donatore” al 5’ della
seconda. In fase di annealing le due sonde si legano al target in
posizione tale da rendere possibile il trasferimento di energia di
risonanza. Le due sonde non vengono idrolizzate.
Molecular Beacons
È un oligonucleotide che contiene
un fluoroforo (reporter) e un
quencher non fluorescente
alle
estremità
opposte,
disegnate in modo da essere
complementari tra loro in modo
da formare una struttura stemloop
Fluoroforo
reporter
Il loop è complementare
ad
una
sequenza
all'interno del prodotto
amplificato
quencher
La vicinanza del quencher
al reporter fluorescente
impedisce l’emissione di
fluorescenza
Quando il beacon si linearizza Il
quencher
si
allontana
fal
reporter
e quest’ultimo può
funzionare da fluorocromo
Celiac RT PCR Diagene
Celiac screen
Simultanea rivelazione degli alleli HLA di
classe II: DQA1*0201, DQA1*03,
DQA1*05, DQB1*02, DQB1*0301/04,
DQB1*0302, DRB1*03, DRB1*04,
DRB1*07, DRB1*11, Omozigosi per gli
alleli DQB1*02 e DQB1*0302
A PRACTICAL AND RAPID METHOD FOR HLA DQ2-DQ8
GENOTYPING IN CELIAC PATIENTS AND IN SUBJECTS AT-RISK
........Methods: 39 patients with CD and 32 first-degree relatives were studied
using genetic diagnostic methods manufactured by DiaGene (Palermo, Italy). DNA
extracted from both dried and fresh blood was amplified in a PCR program using
allele specific primers and visualized on pre-cast agarose gel. A DQ-CD Screen kit
was initially used for the identification of DQ2 and/or DQ8 positive samples.
Positive samples were then tested with DQ-CD Typing kit for the identification of
HLA class-II alleles (DQA1*0201,*03,*05, DQB1*02,*0302, DRB1*03,*04,*07) and
finally a DQ-CD Zygosis test was used for the determination of DQB1*02
homozygosis.
Results: All 39 CD patients and 21/32 (66%) first-degree relatives carried the CDassociated HLA antigens. Forty-nine were positive for HLA DQ2 (31 DQ2-DR3, 11
DQ2-DR7, 3 DQ2-DR3/DR7, 1 DQ2-DR4/DR7, 2 DQ2, 1 DQ2-DR4), 9 for DQ8
(DQ8-DR4), and 2 for DQ2 /DQ8 (1 DQ2/DQ8-DR3/DR4, 1 DQ2/DQ8-DR7/DR4);
14/51 (27%) of the DQ2-positive patients were DQB1*02 homozygotes.
Conclusions: This new diagnostic method for HLA DQ2DQ8 typing is practical and reliable, and allows alleles
and zygosis identification in a very short time.
Bizzaro et al Porto 2008
DR3-DQ2/DR11-DQ7
DQB1*02 homozygous status
DRB1*12
DRB1*11
DRB1*07
DRB1*04
DRB1*03
DQB1*0302
DQB1*0301/04
DQB1*02
DQA1*05
DQA1*03
DQA1*0201
Celiac Gene Typing
DR3/DR7-DQ2 homozygous
DQB1*02 homozygous status
DRB1*12
DRB1*11
DRB1*07
DRB1*04
DRB1*03
DQB1*0302
DQB1*0301/04
DQB1*02
DQA1*05
DQA1*03
DQA1*0201
Celiac Gene Typing
DR4-DQ8
DQB1*02 homozygous status
DRB1*12
DRB1*11
DRB1*07
DRB1*04
DRB1*03
DQB1*0302
DQB1*0301/04
DQB1*02
DQA1*05
DQA1*03
DQA1*0201
Celiac Gene Typing
Special tanks to: Dr. Giorgio Mancuso
Dr. Lavinia Mulè, Dr. Maria Barrale
