Enzimi nella diagnostica

GLI ENZIMI
Sono molecole che catalizzano le reazioni
in modo specifico.
Fattori che influenzano una reazione enzimatica
1) Concentrazione del substrato
Se la [E] è in eccesso rispetto al substrato
P (det. spettrofotometricamente)
[S] crescenti
S
Velocità iniziale = dc/dt
CURVA DI MICHAELIS MENTEN
Quando [S] satura tutti i siti enzimatici,
si raggiunge la velocità di reazione max
(cinetica di Ordine Zero)
Se l’enzima è in eccesso,
la velocità di reazione aumenta all’aumentare
del substrato (cinetica di Primo Ordine)
Velocità di reazione
v = dc/dt
Cinetica di reazione di ordine zero
V = K [E]
Cinetica di reazione di primo ordine
V = K [S]
ENZIMA MICHAELIANO
Enzima come indicatore di danno
Enzima come reagente
Fattori che influenzano una reazione enzimatica
2) Concentrazione dell’enzima: quando la [S] è in eccesso
rispetto alla [E], la velocità della reazione è proporzionale alla [E]
3) pH
4) Temperatura
5) Cofattori
6) inibitori
Il pH ottimale viene accuratamente mantenuto con
l’utilizzo di tamponi appropriati
Fattori che influenzano una reazione enzimatica
2) Concentrazione dell’enzima: quando la [S] è in eccesso
rispetto alla [E], la velocità della reazione è proporzionale alla [E]
3) pH
4) Temperatura
5) Cofattori
6) inibitori
Alcuni enzimi necessitano di cofattori inorganici
e/o cofattori organici (coenzimi)
I cofattori devono essere sempre aggiunti in eccesso
nella miscela di reazione
Coenzimi piridinici
Fattori che influenzano una reazione enzimatica
2) Concentrazione dell’enzima
3) pH
4) Temperatura (analisi a temp strett controllate)
5) Cofattori (sempre in eccesso)
6) inibitori
http://www.youtube.com/watch?v=PILzvT3spCQ&feature=fvwrel
INIBIZIONE COMPETITIVA
Kmi > Km
Vmaxi = Vmax
INIBIZIONE NONCOMPETITIVA
Kmi = Km
Vmaxi < Vmax
Dosaggi enzimatici
Per essere dosati nel siero, urina o altri fluidi gli enzimi
devono essere:
Stabili durante la conservazione e l’analisi del campione;
Significativi dal punto di vita diagnostico
Facilmente dosabili
La concentrazione degli enzimi viene calcolata in base alla
loro attività enzimatica.
La determinazione deve essere effettuata finchè la formazione
del prodotto aumenta linearmente nel tempo (i primi minuti).
[E4]
[E3]
[E2]
[E1]
A) La miscela di reazione viene fatta
reagire per un tempo prestabilito,
finito il quale si determina la quantità
di prodotto ottenuto o di substrato
consumato.
B) La reazione viene seguita in
continuo (saggio cinetico) mediante
misurazioni successive ad intervalli
di tempo prestabiliti
Le misurazioni in continuo sono preferibili perché permettono
di individuare qualsiasi deviazione dalla linearità.
L’esempio piu’ comune di deviazione dalla linearità si verifica
quando la concentrazione di E nel campione è cosi’ elevata
che consuma tutto il substrato in tempi rapidissimi.
I livelli enzimatici vengono riportati come
Unità enzimatiche (non concentrazione)
E’ stato proposto l’utilizzo dell’UNITA’ INTERNAZIONALE (UI):
1UI è quella quantità di enzima che catalizza la trasformazione
di 1 mmole di substrato in 1 minuto.
La concentrazione enzimatica viene espressa come UI/L
TEST OTTICO SEMPLICE
incolore
giallo
TEST OTTICO ACCOPPIATO
Consiste nell’accoppiamento della reazione primaria
con una seconda NAD- o NADP-dipendente (reazione
indicatrice).
Quando il prodotto dell’enzima da dosare non è
distinguibile otticamente dal substrato.
E1
L
E2
S
P
E1 = enzima da dosare
E2 = enzima ausiliario (reazione rivelatrice)
TEST OTTICO ACCOPPIATO
Affinchè la misura sia proporzionale al contenuto di E1 presente nel
campione da dosare si devono realizzare 3 condizioni:
-
La reazione catalizzata da E1 deve essere di ordine zero rispetto a [L].
si realizza con un eccesso di L ([L]>> KmL)
-
La reazione catalizzata da E2 deve essere di primo ordine rispetto a [S].
si realizza utilizzando E2 in largo eccesso ([S]<<Kms)
- Entrambe le reazioni devono essere irreversibili
E1
L
E2
S
P
L’enzima E1 deve costituire il fattore limitante
TRANSAMINASI
Alanina
piruvato
Aspartato
ossalacetato
Enzimi nella diagnostica: le transaminasi
AST = aspartato amminotrasferasi
AST
Aspartato + a-chetoglutarato  ossalacetato + glutammato
MDH
Ossalacetato + NADH + H+  malato + NAD+
AST (GOT) = Aspartato aminotrasferasi
Reazione indicatrice
accoppiata
AST (sinonimo GOT)
Indice di funzionalità epatica e muscolare
Valori ematici normali (8-20 UI/l)
Principalmente localizzata nel tessuto cardiaco, scheletrico ed
epatico.
La concentrazione intracellulare di AST è 1000 volte piu’
elevata rispetto alla concentrazione extracellulare.
Aumenta nell’epatite acuta e cronica, nell’infarto del miocardio,
nella distrofia muscolare, nella pancreatite acuta.
Dopo danni gravi, i livelli di AST possono alzarsi in 6/10 ore e
rimanere alti per circa 4 giorni.
AST (sinonimo GOT)
Dopo danni gravi, i livelli di AST possono alzarsi in 6/10 ore e
rimanere alti per circa 4 giorni.
Utile nella diagnosi e nel controllo della terapia delle malattie
epatiche.
Nell’epatite acuta: aumenta in tempi brevi (150-500 UI/l)
Nell’epatite cronica: scarso aumento (20-100 UI/l)
Enzimi nella diagnostica: le transaminasi
ALT = alanina amminotrasferasi
Alanina + a-chetoglutarato
Piruvato + NADH +
H+
LDH

ALT

piruvato + glutammato
Lattato + NAD+
LDH = Lattico Deidrogenasi
ALT (GPT) = Alanina aminotrasferasi
Reazione indicatrice
accoppiata
ALT (sinonimo GPT)
Indice di funzionalità epatica
Valori ematici normali (10-25 UI/l)
Principalmente localizzata nel tessuto epatico.
Aumenta nell’epatite acuta e cronica.
Nel danno infiammatorio acuto il livelli di ALT sono
superiori ai livelli di AST e rimangono elevati nel sangue
piu’ a lungo.
Enzimi nella diagnostica: la lattato deidrogenasi
Piruvato + NADH + H+
LDH

Lattato + NAD+
Valori ematici normali (100-200 UI/l)
I Livelli aumentano in patologie epatiche, cardiache,
muscolari, renali ed ematologiche
Molti farmaci possono indurre un aumento sierico di tale
enzima: anestetici, dicumarolici, nitrofurantoina, ecc
Gli eritrociti hanno una concentrazione di LDH 100-150
volte maggiore rispetto a quella che si trova nel sangue
Isoenzimi
Sono forme multiple di un enzima che catalizzano la
stessa reazione, ma differiscono nella struttura (sono
codificate da geni distinti).
Hanno spesso costanti catalitiche (Km, Vmax) diverse.
Sono presenti in tessuti diversi (cuore, fegato, ecc.)
Glucokinase and Hexokinase are typical examples of isoenzymes.
In fact, there are four Hexokinases: I, II, III and IV. Hexokinase I is present
in all mammalian tissues, and Hexokinase IV (Glucokinase) is found
mainly in liver.
Both enzymes catalyze the phosphorylation of Glucose:
Glucose + ATP  Glucose 6 P + ADP
G6P
x
È irreversibile
Esochinasi I:
Glucochinasi (esochinasi IV):
È presente in tutte le cellule
Reagisce anche con altri monosaccaridi
Km = 0.1 mM
È indipendente da insulina
Inibita da G6P
È presente solo nel fegato
Reagisce solo con glucosio (è specifica)
Km = 10 mM
È inducibile con insulina
Non inibita da G6P
Glucokinase and Hexokinase are typical examples of isoenzymes.
In fact, there are four Hexokinases: I, II, III and IV. Hexokinase I is present
in all mammalian tissues, and Hexokinase IV (Glucokinase) is found
mainly in liver.
Both enzymes catalyze the phosphorylation of Glucose:
Glucose + ATP  Glucose 6 P + ADP
Hexokinase I has a low Km and is inhibited by glucose 6 (P).
Glucokinase is not inhibited by Glucose 6 (P) and his Km is high.
Since Glucokinase is not inhibited by glucose 6 phosphate, in conditions
of high concentrations of glucose this enzyme continues phosphorylating
glucose, which can be used for glycogen synthesis in liver. Additionally,
since Glucokinase has a high Km, its activity does not compromise the
supply of glucose to other organs; in other words, if Glucokinase had a
low Km, it would continue converting glucose to glucose 6 phosphate in
the liver, making glucose unavailable for other organs (remember that
after meals, glucose arrives first to the liver through the portal system).
Lattico Deidrogenasi (LDH) è un tetramero costituito da 2 tipi di subunità (H e M)
45%
18%
3%
1%
Isoenzima H4 nel cuore M4 nel muscolo scheletrico
Nel siero di individui sani
33%
È un modo per ri-ossidare il NADH
http://www.youtube.com/watch?v=edozxR4Hxjw
In myocardial infarction, total LDH increases, and since heart muscle
contains more LDH1 than LDH2, LDH1 becomes greater than LDH2
between 12 and 24 hours, after the infarction, so the ratio LDH1/LDH2
becomes higher than 1 and will stay flipped for several days.
http://www.youtube.com/watch?v=edozxR4Hxjw
Enzimi nella diagnostica: la creatin chinasi
l’isoenzima CPK2 compare nel siero generalmente 4-8 ore dopo l’episodio acuto
e raggiunge un massimo dopo 24 ore
scompare dal plasma dopo 48 h (degradato)
Vie di produzione dell’ATP
Fosforilazione
ossidativa
Glicolisi
anaerobica
Fosforilazione
a livello del substrato
nel ciclo di Krebs
Creatina
chinasi
ATP
Adenilato
chinasi
ATP
ADP
Phosphocreatine
Creatine
Creatine
kinase
Creatine
Phosphocreatine
ADP
ATP
Vie di produzione
Substrati
Velocità di
produzione di ATP
(mmol/g/s)
ATP ricavabile dalla Tempo per la totale
completa
scomparsa dei
utilizzazione dei
substrati
substrati
(mmol/g)
Creatina chinasi
Fosfocreatina
4.0
30
7.5 s
Glicolisi anaerobia
Glicogeno
2.0
100
2.5 min
Fosforilazione
ossidativa
mitocondriale
Glicogeno e
glucosio
0.6
100
90 min
Fosforilazione
ossidativa
mitocondriale
Acidi grassi
0.3
12 milioni
83 ore
E. Newsholme, The Biochemist, 14-17, June 1998
glicolisi
% of total contribution
to ATP production
100
Fosforilazione ossidativa
80
60
40
20
fosfocreatina
0
0
50
100
150
200
Time (sec.)
250
300
350
Enzimi nella diagnostica: la creatin chinasi
l’isoenzima CPK2 compare nel siero generalmente 4-8 ore dopo l’episodio acuto
e raggiunge un massimo dopo 24 ore
scompare dal plasma dopo 48 h (degradato)
Determinazione spettrofotometrica della creatin chinasi
Sintesi della creatina
CK3
CK2
CK1
CK-MB nella diagnosi dell’infarto acuto
Isoenzimi della CK
- catodo
+ anodo
L’esempio presentato mostra la separazione elettroforetica di diversi campioni di
plasma su gel di agarosio. Le isoforme sono state rese visibili aggiungendo
direttamente i substrati sulla lastrina ed evidenziando l’NADPH, prodotto dalla
catena di reazioni enzimatiche, in base alla sua fluorescenza. La banda MM3 è in
posizione catodica ed è la più lenta, mentre la banda MB1 è in posizione anodica
ed è quella con maggiore mobilità elettroforetica. Una determinazione
semiquantitativa della concentrazione relativa delle diverse isoforme può essere
ottenuta per mezzo di un fotometro a scansione.
Proteine mutate nelle
distrofie muscolari
Enzimi nella diagnostica: la g-glutamil trasferasi (GGT)
Enzima presente in tutti i tessuti, particolarmente nel rene e nel fegato,
a livello dei dotti biliari.
[GGT] aumenta:
1) Ostruzione dei dotti biliari
2 ) Abuso cronico di alcol
Negli alcolisti, la GGT sierica aumenta per un meccanismo di induzione
enzimatica, quindi indipendentemente dalla presenza o meno di danno
epatico alcol-correlato (se presente, comunque, l'aumento della GGT è
più consistente).
Determinazione spettrofotometrica della GGT
COO-
GGT
colorato
COO-
Misura in
bicromatismo
(405 e 600 nm)
Per migliorare il metodo, Persijn studiò i derivati del Glu-4-NA e scoprì che il γ-glutamil-3carbossi-4-nitroanilide era superiore al Glu-4-NA dal punto di vista della solubilità e stabilità.
Le fosfatasi sono enzimi che determinano l’idrolisi di
fosfomonoesteri (idrolizzano il legame estereo).
Si distinguono in base al pH ottimale d’azione
ALCALINA (pH 9-10)
ACIDA (pH 5)
FOSFATASI ALCALINA (ALP)
ALP è presente soprattutto nel fegato (canalicoli biliari) e nelle
ossa (osteoblasti), placenta e rene.
FOSFATASI ALCALINA (ALP) aumenta nelle:
• affezioni del sistema epato-biliare (poco in cirrosi, epatite);
• Alterazioni della sostanza ossea (rachitismo, metastasi
ossee, Morbo di Paget);
• Iperparatiroidismo
• Patologie infiammatorie croniche intestinali
Determinazione spettrofotometrica della fosfatasi alcalina ALP
pH 10
incolore
giallo
CARATTERISTICHE DEI PRINCIPALI ISOENZIMI
DELLA ALP
FOSFATASI ACIDA (ACP)
ACP è presente soprattutto nella prostata, milza rene, globuli
rossi, piastrine
FOSFATASI ACIDA (ACP) aumenta nel:
Carcinoma della prostata
Determinazione spettrofotometrica della fosfatasi acida ACP
pH 5
incolore
Incolore
Diventa giallo dopo
aggiunta di alcali
Per determinare l’ACP prostatica si sfrutta la sua caratteristica di essere
inibita da L-tartrato.
Si sottopone campione a dosaggio in assenza e in presenza di L-tartrato e
si misura la differenza tra i due.
ACP prostatica = ACP totale – ACP dopo inibizione con tartrato
Enzimi nella diagnostica: amilasi
Indice di funzionalità pancreatica
Valori 100-300 UI/L
Sono enzimi idrolitici implicati nella scissione dei polisaccaridi
Vengono prodotti in vari organi da cui prendono il nome (isoenzimi):
• salivare (ptialina) presente anche nel sudore, lacrime, liquido amniotico;
• pancreatica, viene rilasciata nell’intestino
AMILASI aumenta nelle:
Pancreatiti acute (livelli 20-30 volte superiore rispetto a
individui sani, raggiunge il massimo dopo 24 h);
Determinazione spettrofotometrica dell’amilasi
Enzimi nella diagnostica: lipasi
Indice di funzionalità pancreatica
Valori 100-300 UI/L
Sono enzimi che catalizzano l’idrolisi dei trigliceridi
Vengono prodotti principalmente dal pancreas
LIPASI aumenta nelle:
Pancreatiti acute (è più specifica dell’amilasi, si libera più
tardivamente e permane più a lungo in circolo);
Determinazione della lipasi
Metodo titrimetrico
Una emulsione di olio d’oliva viene incubata con un campione di
plasma. Gli acidi grassi eventualmente formati vengono titolati
con NaOH (indicatore timolftaleina)
Metodo turbidimetrico
Più rapido e semplice, si basa sul fatto che i grassi in ambiente
acquoso creano un’emulsione.
Enzimi nella diagnostica: la tripsina
Prodotta esclusivamente dalle cellule acinose
pancreatiche.
Si dosa solo con metodi radioimmunologici, il che riduce
la sua applicabilità in emergenza clinica.
I livelli aumentano 5-10 volte nel corso di panceatite
acuta e permangono elevati per 4-5 giorni dall’inizio dei
sintomi.