Scarica - liceo maffei

IL CLONAGGIO DEI GENI
Sofia Butti, Margherita Garonzi, Filippo Mailizia, Paolo Scaduto
Anno Scolastico 2015/2016
Classe IG
PER INIZIARE…
Per ottenere copie multiple di un
piccolo frammento di DNA è
possibile sfruttare le capacità dei
plasmidi di introdursi nelle cellule
ospiti e duplicarsi.
Il clonaggio di geni implica tre fasi:
• RICOMBINAZIONE
• TRASFORMAZIONE
• SELEZIONE
RICOMBINAZIONE
DNA campione
1
Ricombinazione
Estratto da una genoteca
Ottenuto da RNA messaggero
Grazie agli enzimi endonucleasi di
restrizione (altamente specifici)
2
Gene
Regolatore
Umano
Grazie a
Sintetizzatore automatico
di polinucleotidi
Taglio
Rimpiazzato da
gene regolatore
batterico
Miscela dei frammenti con il DNA
plasmidico anch’esso tagliato
3
Trascrittasi inversa
Perché?
Ciò assicura un elevato
tasso di trascrizione e di
sintesi del prodotto del
gene in un sistema
batterico
Aggiunte al donatore di DNA
Estremità
coesive
Corte sequenze di
nucleotidi (da tre a sei basi)
Localizzano le sequenze
complementari sul DNA del
plasmide ricevente
RICOMBINAZIONE
DNA
ricevente
È tipicamente un
plasimde batterico
Cosa gli succede?
È stato «aperto» in
corrispondenza della sequenza
complementare alle estremità
coesive del DNA donatore
grazie a
Contiene anche un gene che conferisce
resistenza ad uno specifico antibiotico
Endonucleasi di restrizione
4
Grazie all’enzima DNA ligasi
Uniti DNA donatore e plasmide
DNA
ricombinante
Le estremità coesive
si sovrappongono
Portatore di un gene
umano all’interno del
plasmide vettore
TRASFORMAZIONE
La cellula batterica viene trattata con Ca2+
 Viene resa così permeabile
 Può ricevere il plasmide vettore
Miscela d’incubazione
Contiene plasmidi per
favorire la captazione da
parte della cellula
Solo l’1% delle cellule risulta
tuttavia modificata
Cellula batterica
SELEZIONE
Plasmide resistente ad
un antibiotico
Solo alcuni batteri hanno
incorporato il plasmide
vettore.
I batteri sono coltivati in
terreni contenenti lo
specifico antibiotico al
quale il plasmide è
resistente.
Si sviluppano
solamente le colture
che hanno incorporato
il plasmide.
Coltura
batterica
sviluppata
NB: Se il frammento di DNA da duplicare è piuttosto lungo per ottenere
le numerose copie si usa il procedimento di clonaggio tramite virus o la PCR.
Un esempio concreto
3
tetR
1
Plasmide di E.
coli pSC101
Sito di
EcoRI
G A A
T
C T
A A G
T
interruzione
T C
Gene da
studiare
Origine della duplicazione
Siti di EcoRI
4
DNA umano
Gene da studiare
Estremità coesive
Vettore
ricombinante
Gene da
studiare
2
Terreno di coltura
contentente
tetraciclina