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IL CLONAGGIO DEI GENI Sofia Butti, Margherita Garonzi, Filippo Mailizia, Paolo Scaduto Anno Scolastico 2015/2016 Classe IG PER INIZIARE… Per ottenere copie multiple di un piccolo frammento di DNA è possibile sfruttare le capacità dei plasmidi di introdursi nelle cellule ospiti e duplicarsi. Il clonaggio di geni implica tre fasi: • RICOMBINAZIONE • TRASFORMAZIONE • SELEZIONE RICOMBINAZIONE DNA campione 1 Ricombinazione Estratto da una genoteca Ottenuto da RNA messaggero Grazie agli enzimi endonucleasi di restrizione (altamente specifici) 2 Gene Regolatore Umano Grazie a Sintetizzatore automatico di polinucleotidi Taglio Rimpiazzato da gene regolatore batterico Miscela dei frammenti con il DNA plasmidico anch’esso tagliato 3 Trascrittasi inversa Perché? Ciò assicura un elevato tasso di trascrizione e di sintesi del prodotto del gene in un sistema batterico Aggiunte al donatore di DNA Estremità coesive Corte sequenze di nucleotidi (da tre a sei basi) Localizzano le sequenze complementari sul DNA del plasmide ricevente RICOMBINAZIONE DNA ricevente È tipicamente un plasimde batterico Cosa gli succede? È stato «aperto» in corrispondenza della sequenza complementare alle estremità coesive del DNA donatore grazie a Contiene anche un gene che conferisce resistenza ad uno specifico antibiotico Endonucleasi di restrizione 4 Grazie all’enzima DNA ligasi Uniti DNA donatore e plasmide DNA ricombinante Le estremità coesive si sovrappongono Portatore di un gene umano all’interno del plasmide vettore TRASFORMAZIONE La cellula batterica viene trattata con Ca2+ Viene resa così permeabile Può ricevere il plasmide vettore Miscela d’incubazione Contiene plasmidi per favorire la captazione da parte della cellula Solo l’1% delle cellule risulta tuttavia modificata Cellula batterica SELEZIONE Plasmide resistente ad un antibiotico Solo alcuni batteri hanno incorporato il plasmide vettore. I batteri sono coltivati in terreni contenenti lo specifico antibiotico al quale il plasmide è resistente. Si sviluppano solamente le colture che hanno incorporato il plasmide. Coltura batterica sviluppata NB: Se il frammento di DNA da duplicare è piuttosto lungo per ottenere le numerose copie si usa il procedimento di clonaggio tramite virus o la PCR. Un esempio concreto 3 tetR 1 Plasmide di E. coli pSC101 Sito di EcoRI G A A T C T A A G T interruzione T C Gene da studiare Origine della duplicazione Siti di EcoRI 4 DNA umano Gene da studiare Estremità coesive Vettore ricombinante Gene da studiare 2 Terreno di coltura contentente tetraciclina
![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
