Clonaggio(del(DNA(

Clonaggio(del(DNA(
Il#clonaggio#perme(e#di#produrre#un#numero#elevato#di#copie#iden2che#
dello# stesso# frammento# di# DNA,# u2lizzando# il# normale# processo# di#
replicazione#di#una#cellula,#di#solito#ba(erica.##
È# una# tecnica# importante,# usata# sia# per# applicazioni# di# ingegneria#
gene2ca,#sia#per#studi#di#biologia#molecolare;#perme(e#infa@#di#
A####analizzare#specifiche#sequenze#di#DNA;#
A  studiare#le#funzioni#di#un#prodo(o#genico#(es.#RNA,#proteine);#
A  ingegnerizzare# organismi# per# scopi# specifici,# ad# esempio# per#
produrre#di#insulina.#
L’introduzione# del# DNA# e# il# suo# mantenimento# all’interno# della# cellula#
ospite# sono# possibili# grazie# ai# ve2ori,# in# genere# plasmidi# o# virus,#
opportunamente#ada(a2#allo#scopo.#Per#il#clonaggio#del#DNA#in#cellule#
ba(eriche,#normalmente##
si#usa#un#plasmide:##
una#piccola#molecola#
circolare#di#DNA#che##
con2ene#almeno#le#
tre#regioni#descri(e##
nella#figura#a#destra.#
La# figura# a# sinistra# schema2zza# un# clonaggio# mediante# ve(ore#
plasmidico# di# un# frammento# di# DNA# d’interesse# (che,# in# questo# caso,#
codifica#per#una#proteina).#Per#produrre#grandi#quan2tà#del#frammento(
di(DNA(da#clonare,#si#ricorre#ad#una#PCR.#Il#prodo(o#dell’amplificazione#
viene#poi#purificato#e#digerito#con#gli#stessi#enzimi(di(restrizione(A(e(B(
u2lizza2# per# tagliare# il# plasmide;# dopo# la# diges2one,# il# frammento# di#
DNA# d’interesse# e# il# plasmide# presentano# estremità# compa2bili,# che#
possono# quindi# essere# saldate# da# una# DNA# ligasi,# che# catalizza# la# loro#
ligazione.# Il# plasmide( ricombinate# o(enuto,# può# essere# quindi#
introdo(o#all’interno#di#cellule#ba(eriche,#mediante#trasformazione.#
#
Molte# specie# di# ba2eri# non# naturalmente# competen=# si# possono#
trasformare# ar2ficialmente# in# laboratorio# con# metodi# fisici#
(ele(roporazione)# o# chimici# (cloruro# di# calcio# seguito# da# shock(
termico)# che# perme(ono# alle# molecole# di# DNA# di# a(raversare# la#
parete# e# la# membrana# delle# cellule# ba(eriche.# Per# individuare# le#
cellule# trasformate,# i# ba(eri# vengono# piastra2# su# un# terreno( di(
crescita( sele@vo# che# con2ene# l’an2bio2co# a# cui# l’ospite# diventa#
resistente#grazie#al#plasmide.#Dopo#una#no(e#a(37°C#(temperatura#
o@male# per# la# crescita# dei# ba(eri),# sopravvivono# solo# le# cellule#
trasformate,# che# sono# state# in# grado# di# crescere,# mol2plicarsi# e#
generare# una# popolazione# clonale,# che# assume# la# forma# di# un#
piccolo# ammasso# di# cellule,# de(o# colonia.# Ciascuna# delle# colonie#
o(enute# è# cos2tuita# da# cellule# iden2che# (clone)# contenen2# tu(e###
###########lo#stesso#plasmide.#
#
Al# termine# del# clonaggio# il# DNA# plasmidico# di# alcuni#
cloni# viene# purificato# e# analizzato# (mediante# PCR# o#
diges2one# con# enzimi# di# restrizione# o# anche#
sequenziamento),# per# determinare# se# i# plasmidi# di#
queste#colonie#sono#quelli#ricombinan2#contenen2#il#
frammento#di#DNA#desiderato.#(Può#accadere#infa@#
che# un# ba(erio# trasformato# contenga# un# plasmide#
non#digerito#o#che#si#richiude#senza#inserto).#