METODI GENETICI NELLA IDENTIFICAZIONE DI CIANOBATTERI

Corso teorico-pratico per la sorveglianza delle fioriture dei
cianobatteri negli ambienti acquatici
Istituto Superiore di Sanità, 26-27 gennaio 2011
Susanna Vichi
Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria
Rep. Meccanismi di Tossicità
ISS
APPROCCIO MOLECOLARE nel monitoraggio ambientale
Identificazione di cianobatteri sin dalle fasi più precoci della
colonizzazione attraverso identificazione tassonomica delle specie
Rilevazione e quantificazione del potenziale tossico (eventuale)
delle specie presenti
Elevato Polimorfismo fenotipico nell’ambito di uno stesso phylum
Nell’ambito della stessa specie coesistono individui tossici e non tossici
Gli individui in grado di produrre tossina sono morfologicamente indistinguibili
da quelli che non ne sono capaci
casi di fioriture non tossiche
La capacità di produrre cianotossine:
- dipende dal make up genetico di un individuo
- è un processo dinamico
Approcci molecolari comuni
nella determinazione di cianobatteri
Analisi quali/quantitativa:
PCR
PCR-RFLP
DGGE
PNA assay
qPCR
- SYBR Green chemistry
- TNA assay, …
Bioinformatica:
Sequenziamento, Allineamento
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI CIANOBATTERI:
1. Definizione TASSONOMICA degli individui attraverso la
ricerca di specifiche sequenze “marker” diagnostiche
Determinazione del phylum di appartenenza (genere, specie, ceppo)
2. Definizione di specifiche sonde molecolari per l’identificazione
di SPECIE TOSSICHE attraverso la ricerca di geni che codificano
per la produzione delle tossine
Determinazione e quantificazione del potenziale tossico (eventuale) di
una popolazione
1. Definizione TASSONOMICA e analisi filogenetica di campioni
ambientali (a livello di genere, specie, ceppo):
Geni housekeeping come marker filogenetici:
Amplificazione dell’INTERGENIC SPACER nell’operone FICOCIANINA
PC-IGS
cpcB
cpcA
2 biline α e β
cpcC
cpcD
cpcE
3 peptidi linker
Amplificazione all’interno del gene per l’rRNA 16S:
Ottima stabilità, affidabilità
Primers universali
disegnati in regioni
ben conservate
PCR
Analisi RFLP
Rischio: L’analisi della sequenza 16S rRNA può
essere non sufficientemente sensibile nella
discriminazione di specie strettamente correlate
Amplificazione di altri marcatori (geni nif, rpoC1, gyrB)
Es: saggio qualitativo.
Identificazione di comunità cianobatteriche in campioni ambientali
Campione ambientale
Estrazione acidi nucleici (DNA-RNA)
PCR
Amplificazione della regione rDNA 16S come
marcatore genere-specfico (es. Planktothrix)
1
2 3
4
5 6
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
Lane 1 = assenza di Planktothrix
Lane 2,3,4 = Planktothrix
Lane 5 = bianco
Lane 6 = ladder
2. Definizione di specifiche sonde molecolari per la
ricerca di genotipi tossici
Produttori di MCs
Ricerca di specifici geni marker (mcy), raggruppati in cluster, che codificano per
grandi complessi multienzimatici (NRPS o Peptide Sintetasi Non Ribosomali)
coinvolti nella biosintesi delle Microcistine.
Cluster mcy per la biosintesi delle microcistine – Microcystis, Planktothrix e Anabaena:
raggruppa i geni che codificano per diversi domini del complesso multienzimatico della
MICROCISTINA SINTETASI
J. F. Humbert et al., 2010
Attenzione alla presenza di polimorfismi genetici nella scelta del marcatore!
Verificare presenza di delezioni/inserzioni nel cluster mcy in grado di alterare la
funzionalità del prodotto proteico
Es: Ricerca di microcistine in relazione alla presenza di marcatori mcy in colture di
P. agardhii e P. rubescens (S. Mbedi et al., 2005).
Ceppo

cianotossina
mcyT
mcyTD
mcyA
mcyB
P. agardhii HUB076/A1
+
+
+
+
+
+
P. agardhii LAN2
-
-
-
-
-
-
P. agardhii Max01
-
+
+
-
-
-
P. agardhii Max02
-
+
-
-
-
-
P. agardhii Max08
-
+
+
-
-
-
P. rubescens BL1
+
+
+
-
+
+
P. rubescens BL11
+
+
+
+
+
+
P. rubescens HUB148
+
+
+
-
+
+
+
= falsi positivi
- = falsi negativi
mcyE

Produttori di CYN
Depiction of the aoaA, aoaB and aoaC genes from Aphanizomenon
ovalisporum (da Rasmussen et al. 2008).
Identificate 2 sequenze coinvolte nella produzione di CYN, con funzione ps e
pks, all’interno dei geni aoaA, aoaB, e aoaC.
Indicatori di tossicità in ceppi di Cylindrospermopsis raciborskii, Anabaena
bergii e Aphanizomenon ovalisporum.
- Fergusson and Saint 2003, Multiplex PCR Assay specie-specifico per
cianobatteri produttori di CYN appartenenti a C. raciborskii (colture isolate
e campioni ambientali)
J.P. Rasmussen et al, 2008
Es. Approccio quantitativo.
Ricerca e quantificazione di genotipi tossici appartenenti a P. rubescens in
campioni ambientali mediante qPCR.
Campione ambientale
Cellule concentrate su filtro e congelate a -20°C
Risospensione cellule
Centrifugazione - pellet
Estrazione DNA totale
Determinazione concentrazione e purezza
Taq Nuclease Assay
Taq Nuclease Assay (TNA)
Il TaqMan probe si lega alla sequenza target nella fase
di annealing e viene idrolizzato dall’attività 5′→3′
esonucleasica della Taq polimerasi.
Il rilascio del segnale reporter ad ogni ciclo di
amplificazione permette la
rilevazione/quantificazione del DNA target.
16S
Amplificazione selettiva DNA regione rDNA 16S: total-P. rubescens
Amplificazione selettiva DNA mcyB: only toxic-P. rubescens
Quantificazione dei risultati: metodo della standard curve basata su
diluizioni seriali di DNA a concentrazione nota (equivalenti di cell.)
mcyB
n copie mcyB / n copie 16S = frazione cell tossiche
Consultazione database di sequenze: supporto indispensabile nella identificazione di
comunità microbiche
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
BLAST è un algoritmo ottimizzato per ricercare regioni di locale omologia tra
sequenze presenti nel database.
Target
gene
PC-IGS
*
mcyA
mcyE
PC-IGS
(Real time
PCR)
mcyB
(Real time
PCR)
Designation
Sequences to
PC_F
PC_R
mcyA_F
mcyA_R
mcyE_F
mcyE_R
PlPc_F
PlPc_R
PlPc_probe
Pl-mcyB_F
Pl-mcyB_R
mcyB_prob
e
TGCTGTCGCCTAATTTTTCA
CCACTGATCAGGCTGTCAGA
ATCAAACAGATGTACTGACAGGT
AGGCCAGACTATCCCGTT
TTACCTAATTATCCCTTTCAAAG
CAATGGGTAAGGTTTGCTT
GCAGGAATTACTCCTGGAGATTGT
GCCGCAGCGAGATCAAAG
FAM-CGCTCTGGCTTCTGAAGTCGCCG-TAMRA
ATTGCCGTTATCTCAAGCGAG
TGCTGAAAAAACTGCTGCATTAA
FAM-TCAGAGGAAAGAGCTTCACCTCCACAAAAA-TAMRA
Amplicon
size (bp)
271
Ref.
174
9
589
12
71
10
76
10
9
Manganelli et al., Water research 2010;44(5):1297-1306.
Rapporto ISTISAN 08/6
http://www.iss.it