Lezione 08
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La cellula Chimica e Macromolecole Proteine DNA replicazione RNA trascrizione Traduzione Citoscheletro Organelli Cellulari Molti degli organelli delimitati da membrana mantengono una collocazione fissa nella cellula attaccandosi al citoscheletro (microtubuli) che fa da binario per lo spostamento degli organelli e delle vescicole oggetto di scambio tra gli organelli stessi Funzione principale dei comparti delimitati da membrana in una cellula eucariotica Compartimento Funzione primaria Citosol Contiene molte vie metaboliche; sintesi proteica Nucleo Contiene il genoma principale; sintesi di DNA e RNA Reticolo endoplasmatico (RE) Sintesi di quasi tutti i lipidi; sintesi di proteine da distribuire a vari organelli e alla membrana plasmatica Apparato di Golgi Modificazione, smistamento e confezione di proteine e lipidi o per la secrezione o per l’invio ad altri organelli Lisosomi Degradazione intracellulare Endosomi Smistamento di materiali assunti per endocitosi Mitocondri Sintesi di ATP per fosforilazione ossidativa Cloroplasti Sintesi di ATP e fissazione del carbonio per fotosintesi Perossisomi Ossidazione di molecole tossiche Volumi relativi occupati dai principali organelli delimitati da membrane (epatocita) Compartimento intracellulare Percentuale del volume cellulare totale Numero approssimativo per cellula Citosol 54 1 Mitocondri 22 1700 Reticolo endoplasmatico (RE)* 12 1 Nucleo 6 1 Apparato di Golgi 3 1 Perossisomi 1 400 Lisosomi 1 300 Endosomi 1 200 *20-30 volte l’area della membrana plasmatica La compartimentalizzazione cellulare • Le cellule svolgono migliaia di reazioni chimiche diverse (spesso di segno opposto) in ogni istante quindi devono tenerle separate tra di loro. • La cellula si è evoluta sviluppando diverse strategie per organizzare e compartimentare tali reazioni: – Aggregare in un solo complesso proteico i vari enzimi per cercare di catalizzare una certa sequenza di reazioni (v.d. DNA e RNA). – Confinare processi metabolici diversi in compartimenti diversi (organelli delimitati da membrana). La compartimentalizzazione cellulare • E’ possibile per la presenza di organelli delimitati da membrana. • E’ ottenuta mediante lo smistamento (sorting) delle proteine: – Sistema utilizzato per mantenere la composizione proteica dei vari comparti (ogni comparto possiede un corredo specifico di proteine arrivate dal citosol, sede della sintesi, per svolgere la loro funzione) – Questo processo di smistamento (sorting) si basa su appositi segnali inclusi nella sequenza aminoacidica della proteina • E’ ottenuta mediante il trasporto vescicolare – Insieme dei contatti che alcuni dei comparti delimitati da membrana intrattengono tra di loro tramite la formazione di sferule membranose che si staccano da un comparto attraversano il citosol e vanno a fondersi con un altro comparto • E’ ottenuta mediante l’utilizza delle vie secretorie – Rilascio di proteine all’esterno della cellula (esocitosi) – Assunzione di proteine dall’esterno della cellula (endocitosi) La compartimentalizzazione cellulare Sorting delle proteine • E’ possibile per la presenza di organelli delimitati da membrana. • E’ ottenuta mediante lo smistamento (sorting) delle proteine: – Sistema utilizzato per mantenere la composizione proteica dei vari comparti (ogni comparto possiede un corredo specifico di proteine arrivate dal citosol, sede della sintesi, per svolgere la loro funzione) – Questo processo di smistamento (sorting) si basa su appositi segnali inclusi nella sequenza aminoacidica della proteina TUTTI QUESTI PROCESSI NECESSITANO DI ENERGIA NEI MECCANISMI 1 E 3 LA PROTEINA MANTIENE LA SUA CONFORMAZIONE Macromolecole trasporto attivo Piccole molecole per diffusione Traslocatori proteici situati nella membrana NEL MECCANISMO 2 LA PROTEINA DEVE DISTENDERSI Viaggiano a bordo di vescicole di trasporto per andare dal RE all’Apparato di Golgi, endosomi, lisosomi e superficie cellulare Sequenze segnale (15-60 aa) In genere vengono poi rimosse una volta a destinazione Sono necessarie e sufficienti a dirigere una proteina in un determinato luogo Funzione del segnale Esempio di sequenza segnale Importazione nel RE +H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Iie-Leu- Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-ValPhe-Gln Ritenzione nel lume del RE -Lys-Asp-Glu-Leu-COO- Importazione nei mitocondri +H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro- Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu Importazione nel nucleo -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- Importazione nei perossisomi -Ser-Lys-Leu Gli aa carichi positivamente sono scritti in rosso e quelli carichi negativamente in azzurro, in arancione un gruppo cospicuo di aa idrofobici. Spesso conta di più le proprietà fisiche degli aa (idrofobicità, posizione degli aa) che la sequenza in senso stretto per lo smistamento La sequenza segnale è necessaria e sufficiente per inviare una proteina nel RE Viene rimossa dalla proteina finita una volta che è stata smistata TUTTI QUESTI PROCESSI NECESSITANO DI ENERGIA NEI MECCANISMI 1 E 3 LA PROTEINA MANTIENE LA SUA CONFORMAZIONE Macromolecole trasporto attivo Piccole molecole per diffusione Traslocatori proteici situati nella membrana NEL MECCANISMO 2 LA PROTEINA DEVE DISTENDERSI Viaggiano a bordo di vescicole di trasporto per andare dal RE all’Apparato di Golgi, endosomi, lisosomi e superficie cellulare Nucleo cellulare Dimensione 5 micron. Doppia membrana a distanza di 20-40 nm Pori nucleari di 100 nm, in cui membrana interna ed esterna si fondono Membrana interna è costituita da lamina nucleare-intreccio di filamenti intermedi Contiene DNA complessato con proteine=nucleosomi…spiralizzato in cromosomi Sintesi di RNA da DNA: passa attraverso i pori nucleari per essere tradotto in proteine Figure 1-15 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010) La membrana nucleare interna contiene proteine che agiscono da legame per i cromosomi e per la lamina nucleare (rete di filamenti che conferisce rigidità al nucleo) La composizione dell’involucro nucleare esterno non differisce da quella del RE di cui ne è la continuazione I pori nucleari (100 proteine) sono i portali da cui entrano ed escono dal nucleo tutte le molecole, il traffico dai pori circola in entrambi i sensi Il complesso del poro Circa 30 diverse proteine Filamenti intermedi della lamina nucleare • Sono costituiti da LAMINE • Nucleo si disgrega nella divisione cellulare insieme alla lamina anche che viene fosforilata, mentre la defosforilazione al termine della divisione le fa riassociare assemblare. • Fosfo-defosforilazione TESTE GLOBULARI dei filamenti intermedi • Mutazioni genetiche associate a mancanza di lamine - Progeria invecchiamento precoce da danno al nucleo, apoptosi generalizzata - Neuropatie - Cardiomiopatie Sam Burns • In rosso segnale di localizzazione nucleare • Le fibrille guidano nel poro il complesso recettore verso il vettore • Il trasporto è attivo ed utilizza energia liberata dall’idrolisi del GTP • I pori nucleari trasportano le proteine già montata nella loro conformazione nativa (in altri organelli le proteine devono distendersi per entrare) TUTTI QUESTI PROCESSI NECESSITANO DI ENERGIA Macromolecole trasporto attivo Piccole molecole per diffusione NEI MECCANISMI 1 E 3 LA PROTEINA MANTIENE LA SUA CONFORMAZIONE Traslocatori proteici situati nella membrana NEL MECCANISMO 2 LA PROTEINA DEVE DISTENDERSI Viaggiano a bordo di vescicole di trasporto per andare dal RE all’Apparato di Golgi, endosomi, lisosomi e superficie cellulare Mitocondrio • Il genoma mitocondriale contiene 17.000 coppie di basi e possiede 37 geni codificanti per due RNA ribosomiali (rRNA), 22 RNA di trasporto (tRNA) e 13 proteine che fanno parte dei complessi enzimatici deputati alla fosforilazione ossidativa. • In ogni mitocondrio si trovano da due a dieci copie del genoma circolare. • Il resto delle proteine presenti nel mitocondrio deriva da geni nucleari i cui prodotti vengono appositamente trasportati. Le proteine destinate al mitocondrio generalmente vengono riconosciute grazie ad una sequenza leader presente sulla loro parte N-terminale. • Tale sequenza contiene da 20 a 90 amminoacidi, di cui nessuno carico negativamente, con all'interno alcuni motivi ricorrenti, e sembra che abbia un'elevata possibilità di dare origine ad una α-elica anfipatica. Figure 1-8b Essential Cell Biology (© Garland Science 2010) Figure 1-18 Essential Cell Biology (© Garland Science 2010) Per entrare nei mitocondri dal citosol le proteine perdono la conformazione originale Peptidasi e proteine secondatrici scindono la sequenza segnale e ridanno alla proteina la sua forma TUTTI QUESTI PROCESSI NECESSITANO DI ENERGIA NEI MECCANISMI 1 E 3 LA PROTEINA MANTIENE LA SUA CONFORMAZIONE Macromolecole trasporto attivo Piccole molecole per diffusione Traslocatori proteici situati nella membrana NEL MECCANISMO 2 LA PROTEINA DEVE DISTENDERSI Viaggiano a bordo di vescicole di trasporto per andare dal RE all’Apparato di Golgi, endosomi, lisosomi e superficie cellulare Reticolo endoplasmatico • • • • • • Il Reticolo Endoplasmatico è il sistema di membrane più esteso delle cellule eucariotiche (20-30 volte quello della membrana plasmatica) Il RE è una struttura cellulare costituita da sacche e invaginazioni adese senza soluzione di continuità alla membrana nucleare. Lo spazio interno che si identifica tra le pieghe del reticolo è detto lume e presenta una serie di enzimi che catalizzano diverse reazioni chimiche. Il termine reticolo si riferisce alla sua forma articolata nello spazio, il termine endoplasmatico sta a indicare che si trova all'interno (endo) del citoplasma. Il RE presente all'interno delle fibre muscolari prende il nome di "Reticolo sarcoplasmatico liscio" e "Reticolo sarcoplasmatico rugoso" a seconda della propria composizione. Vi è una distinzione tra reticolo endoplasmatico rugoso (RER) e reticolo endoplasmatico liscio (REL). Entrambi i reticoli hanno come compiti quelli di modificare molecole precedentemente sintetizzate in altri distretti. I ribosomi Cosa sono • I ribosomi (al singolare ribosoma o ribosomio) sono granuli scuri presenti nel citosol, sulla membrana nucleare e sul reticolo endoplasmatico rugoso (RER). • Sono composti da RNA ribosomiale (r-RNA) e materiale proteico, e la loro funzione è quella di sintetizzare, partendo da una catena di RNA messaggero (m-RNA), le proteine. • Furono messi in evidenza per la prima volta al microscopio elettronico nel 1953. I ribosomi • Il ribosoma della cellula eucariote (fatta eccezione per quelli contenuti nei mitocondri e nei cloroplasti), invece, è più grande ed ha una massa molecolare di 4000 kDa, un diametro di 23 nm ed un coefficiente di sedimentazione di 80 S. – Anch'esso è composto da due unità (60 S e 40 S) che in complessivo presentano più di 80 proteine. I ribosomi • I ribosomi liberi – Sono così denominati i ribosomi che si trovano liberi nel citoplasma cellulare o che fanno parte dei mitocondri o dei cloroplasti. Generalmente sono deputati alla sintesi di proteine che verranno rilasciate ed utilizzate nel citoplasma o nella parte interna della membrana cellulare negli organelli precedentemente citati ed anche nei perossisomi. Più ribosomi sono in grado di unirsi tra loro, utilizzando come legame una stessa molecola di RNA messaggero attraverso la quale si muovono dal codone iniziale fino a quello finale, in direzione 3', a formare un poliribosoma (o polisoma). • I ribosomi legati alle membrana – Si trovano legati alle membrane costituenti il nucleo cellulare od il reticolo endoplasmatico rugoso. Si occupano di sintetizzare e rilasciare proteine all'interno delle membrane di queste strutture, dove poi saranno condotte alla loro destinazione finale che può essere sia intra- che extracellulare (nel qual caso vengono spesso espulse per esocitosi). È da segnalare che i ribosomi attaccati alle membrane sono una sezione dell'insieme dei ribosomi liberi, la quale viene poi reclutata non appena iniziano a sintetizzare proteine specifiche. Reticolo endoplasmatico • I ribosomi citosolici vengono indirizzati al RE se la proteina che stanno sintetizzando presenta una sequenza segnale per il RE, riconosciuta nel citosol da una particella di riconoscimento del segnale (SRP): il legame tra il complesso ribosoma-SRP e un recettore posto sulla membrana del RE innesca il processo che guida il polipeptide in allungamento oltre la membrana del RE attraverso un apposito canale di traslocazione. • Le proteine solubili destinate alla secrezione o al volume interno di un organello passano completamente nel lume del RE, mentre le proteine transmembrana destinate alla membrana del RE o ad altre membrane cellulari restano ancorate al doppio strato lipidico dalle eliche α che lo attraversano uno o più volte. Un unico parco di ribosomi serve a sintetizzare le proteine destinate a rimanere nel citosol e quelle da trasportare agi organelli delimitati da membrane (RE compreso L’SRP (signal recognition particle) è presente nel citosol e si lega alla sequenza segnale per il RE, un recettore per SRP immerso nella membrana del RE riconosce la SRP e rallenta la sintesi proteica, il canale di traslocazione risucchia la catene polipeptidica nella membrana e la trasloca dall’altro lato, la sequenza segnale viene poi tagliata da una peptidasi Le sequenze di trasferimento e di arresto determinano la formazione di una proteina transmembrana Le sequenze di trasferimento e di arresto determinano la formazione di una proteina transmembrana • La maggior parte delle proteine che entrano nel RE va incontro a modificazioni chimiche: • Ponti disolfuro stabilazzano la struttura (Cys-Cys) • Glicoproteine (glicosilazione) la catena laterale oligosaccardiica si attacca come blocco unico di 14 zuccheri ad una Asp poi vengono modificate per dare forma finale sia nel RE che nel Golgi Le proteine secondatrici (chaperon) trattengono nel lume del RE proteine mal conformate o assemblate in modo incompleto Se le proteine mal conformate non riescono ad assumere la struttura tridimensionale giusta vengono trasportate nel citosol e demolite Unfolded protein response Il trasporto vescicolare Ogni vescicola di trasporto deve portare con se solo le proteine necessarie al destinatario e deve fondersi soltanto con la membrana bersaglio appropriata Le vescicole mostrano un rivestimento sulla faccia rivolta verso il citosol (vescicole rivestite) che conferisce la conformazione a gemma e contribuisce ad inglobare le molecole da trasportare Tipo di vescicola rivestita Proteina di rivestimento Origine Destinazione Clatrina Clatrina + adaptina 1 Apparato di Golgi Lisosomi (via endosomi) Clatrina Clatrina + adaptina 2 Membrana plasmatica endosomi COP (coat protein) Proteine COP RE cisterna di Golgi apparato di Golgi Apparato di Golgi cisterna di Golgi RE Le proteine v-SNARE (vesicle) e t-SNARE (target) svolgono un ruolo fondamentale nel guidare le vescicole di trasporto alle membrane bersaglio (ogni organello ed ogni tipo di trasporto ha la usa SNARE) Soluble NSF (N-ethylmaleimide Sensitive Fusion proteins) Attachment REceptor Il trasporto vescicolare-esocitosi • Una via secretoria maestra (rosso) diretta verso l’esterno arriva alla superficie cellulare partendo dalla regione della biosintesi e della traslocazione proteica nella membrana del RE attraverso l’apparato di Golgi • Una via endocitica maestra (verde) diretta verso l’interno preposta l’ingestione e degradazione di molecole extracellulari porta materiale dalla membrana plasmatica ai lisosomi passando per gli endosomi Entrata (verso il citosol) Uscita (verso la membrana cellulare) Sacche appiattite delimitate da membrane dette cisterne (o dittiosomi). Ogni pila (insieme di cisterne a forma di sacca) contiene da 3 a 20 cisterne. Le pile vanno da 1 a qualche centinaio, dipende dal tipo di cellule. Lato di ingresso nella pila (lato cis adiacente al RE), lato di uscita dalla pila (lato trans rivolto verso la membrana plasmatica. Esocitosi • • • • • • L’apparato di Golgi riceve proteine di nuova fabbricazione provenienti dall’RE, ne modifica la parte oligosaccaridica, le smista e le spedisce dal reticolo di Golgi alla membrana plasmatica, ai lisosomi o alle vescicole secretorie. In tutte le cellule eucariotiche dal reticolo di Golgi gemmano continuamente vescicole di trasporto, che vanno a fondersi con la membrana plasmatica in un processo denominato esocitosi costitutiva. In tal modo pervengono alla superficie cellulare i rifornimenti di lipidi e proteine di membrana e si riversano anche molecole fuori dalla cellula: in questo ultimo caso si parla di secrezione. Le cellule specializzate nella secrezione hanno anche un percorso di esocitosi regolata, nel quale le molecole, immagazzinate in apposito vescicole secretorie, si liberano fuori dalla cellula per esocitosi quando la cellula riceve il segnale di secernere. Le cellule assumono liquidi, molecole e talvolta anche particelle per endocitosi, nel corso della quale zone di membrana plasmatica si invaginano e si distaccano formando vescicole endocitiche. Gran parte del materiale internalizzato per endocitosi passa negli endosomi e quindi nei lilsosomi, che lo digeriscono con i loro enzimi idrolitici; invece i componenti della membrana vescicolare vengono in gran parte riciclati in vescicole di trasporto che tornano alla membrana plasmatica. Esocitosi costitutiva ed esocitosi regolata (ormoni, muco , enzimi digestivi) Esocitosi regolata (aumenti ematici di glucosio inducono la secrezione dell’ormone insulina) Nelle vescicole secretorie regolate le proteine si aggregano e quindi possono trovarsi in grandi quantità cosa che non avviene nelle vescicole costitutive Endocitosi • Endocitosi: assunzione di liquidi e molecole dall’esterno • Due tipi di endocitosi: - Pinocitosi (parti di mambrana plasmatica e liquidi <150nm) - Fagocitosi (particelle di grandi dimensioni >250 nm-microorganismi, detriti, a carico di cellule specializzate) • Cellule intestinali (grosse particelle di cibo) • Cellule fagocitiche del sangue: macrofagi e neutrofili. I batteri espongono dei recettori riconosciuti da anticorpi. I batteri ricoperti da anticorpo vengono fagocitati da macrofagi Le vie endocitiche e le vescicole endocitiche Due macrofagi: a destra un macrofago sta fagocitando due eritrociti Endocitosi mediata da recettori (LDL-colesterolo, Vit. b12, Ferro, HIV) LDL= low density lipoprotein complessate a colesterolo, idrofobico nel sangue • Gli endosomi smistano le molecole internalizzate per endocitosi (pinocitosi) • Il comparto endosomico funge da centrale di smistamento della via endocitica diretta verso l’interno (Golgi smistamento via secretoria, endosoma smistamento via endocitica) • Esistono due gruppi di endosomi: • Endosomi precoci subito sotto la membrana plasmatica • Endosomi tardivi subito sotto il nucleo • Esitono tre vie di destino finale riciclaggio, degradazione, transcitosi (1/2/3) • Il lisosoma contiene enzimi idrolitici ed una pompa per H+ • Degradazione proteine, oligosaccaridi e lipidi • Proteine di trasmembrana affacciate nel lumen dell’organello associate a carboidrati complessi per proteggersi dalla denaturazione • Enzimi lisosomali: complessati in RE e Golgi con mannoso-6-fosfato che con recettore vengono racchiusi in vescicole e destinati al lisosoma Per arrivare ai lisosomi i materiali destinati alla degradazione fanno percorsi diversi Fagocitosi Pinocitosi Autofagia (degradazione di parti consumate della cellula)
