VI Convegno Nazionale SOFIVET – Stintino (SS) 2005
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I TEMPI DI RIESPANSIONE DELLA CAVITA’ BLASTOCELICA
RAPPRESENTANO UN INDICE DELLA QUALITA’ DEGLI EMBRIONI
PRODOTTI IN VITRO
F Berlinguer1, GG Leoni2, S Succu1, M Galioto1, F Mossa1, D Bebbere1, L Bogliolo3, S
Ledda3, S Naitana1
1
Dipartimento di Biologia Animale, 2Dipartimento di Scienze Fisiologiche, Biochimiche e
Cellulari, 3Istituto di Patologia, Ostetricia e Clinica Chirurgica, Università Degli Studi di
Sassari, Via Vienna 2, 07100 Sassari
Summary
The aim of our study was to assess if in vitro produced ovine embryo quality could be
determined by blastocoelic cavity re-expansion rates after vitrification, thawing and in vitro
culture. Vitrified embryos were divided into two groups: 1) expanded within 8 hours of in
vitro culture after thawing; 2) expanded within 16 hours of in vitro culture after thawing.
In both groups we have determined:
a) hatching rates: blastocysts expanded within 8 h of culture showed higher hatching
rates (72.5%) if compared to blastocysts expanded within 16 h of culture (40.7%);
b) pregnancy after transfer in synchronized recipient: 40% vs 0% for embryos expanded
within 8 h of culture and within 16 h of culture, respectively;
c) gene expression;
d) DNA fragmentation (TUNEL assay);
e) cell number.
Taken together these results evidenced that blastocoelic cavity re-expansion rates after
vitrification, thawing and in vitro culture can be considered as a reliable index of in vitro
produced ovine embryo quality.
(Cofin 2003)
Parole chiave: vitrificazione, tempi di riespansione, qualità embrionale.
Key words: vitrification, re-expansion time, embryo quality.
Introduzione
La crioconservazione degli embrioni attraverso la metodica della vitrificazione (Naitana et al.,
1997) viene ormai applicata routinariamente in campo zootecnico, sia nella specie ovina che
in quella bovina, con buone percentuali di sopravvivenza dopo scongelamento. Questa
metodica previene i danni cellulari causati dalla formazione di cristalli di ghiaccio attraverso
l’utilizzo di elevate concentrazioni di crioprotettori abbinate con una elevata velocità di
raffreddamento e ripristino della temperatura. D’altra parte, però, i crioprotettori causano
comunque danni cellulari a causa dello stress osmotico e della loro tossicità.
La capacità di sopravvivenza alla vitrificazione è quindi considerata un indice della qualità
degli embrioni.
Lo scopo del presente lavoro era quello di valutare se il tempo di ri-espansione della cavità
blastocelica in seguito a vitrificazione, ripristino della temperatura e coltura in vitro potesse
essere considerato un indice della qualità degli embrioni prodotti in vitro e potesse quindi
essere relazionato alla successiva competenza allo sviluppo in vivo.
Materiali e metodi
Gli embrioni utilizzati in questo esperimento sono stati prodotti interamente in vitro a partire
da oociti recuperati da ovaie di soggetti regolarmente macellati.
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Gli oociti venivano maturati, fertilizzati e coltivati in vitro in condizioni standard fino allo
stadio di blastocisti espansa. A questo punto venivano vitrificati secondo Naitana e coll.
(1997).
In seguito a ripristino della temperatura, gli embrioni venivano coltivati in vitro per un totale
di 72 ore in medium TCM-199 addizionato con il 20% di siero ed antibiotici, a 39°C col 5%
CO2 in massima umidità e divisi nei due gruppi sperimentali: 1) blastocisti ri-espanse tra 0-8
ore di coltura in vitro; 2) blastocisti ri-espanse tra 8-16 ore di coltura in vitro. Al fine di poter
efficacemente valutare eventuali differenze qualitative tra i due gruppi di embrioni sono state
eseguite una sere di prove sperimentali:
1) prova di sopravvivenza in vitro: valutata come percentuale di schiuse nell’arco delle 72 ore
di coltura n vitro;
2) conta cellulare: calcolata al memento della schiusa in seguito a fissazione in etanolo e
colorazione con ioduro di propizio (1μg/ml) per permettere la conta dei nuclei;
3) determinazione dello stato ossidativo: è stato valutato attraverso una incubazione per 20’
con una sonda fluorogenetica (dicloro-diidro-fluorosceina: DCFDA). La quantificazione
dei radicali liberi è proporzionale all’aumento della fluorescenza della sonda, che emette
un verde intenso solo dopo la deacetilazione e successiva ossidazione causata
principalmente dal perossido di idrogeno;
4) TUNEL test (frammentazione del DNA): per mettere in evidenza un danneggiamento a
livello del patrimonio genetico delle cellule embrionali, è stato eseguito il TUNEL test.
Questa metodica permette di marcare i frammenti terminali 3’-OH attraverso una reazione
catalizzata da una transferasi (deossi-nucleotide-transferasi) utilizzando un nucleotide
marcato (fluorescina-dUTP);
5) espressione genica: è stata analizzata tramite RT-PCR (trascrizione inversa) e PCR
semiquantitativa l’espressione di un set di geni importanti nello sviluppo delle blastocisti
ovine, quali: E-caderina, poli(A)polimerasi, ubiquitina e trasportatore del glucosio;
6) sintesi proteica: è stata effettuata una analisi quali-quantitativa della sintesi proteica
mediante l’incorporazione di metionina radioattiva nei due gruppi di blastocisti;
7) prova di sopravvivenza in vivo: un gruppo di pecore è stato sincronizzato mediante
l’applicazione di una spugna vaginale contenente 45 mg di fluorgestone acetato e
lasciata in situ per 14 giorni; 7 giorni dopo l’insorgenza dell’estro le blastocisti sono
state trasferite mediante laparotomia.
Risultati
La prova di sopravvivenza in vitro è stata eseguita su un totale di 338 blastocisti. In seguito a
72 ore di coltura in vitro, le blastocisti ri-espanse entro la 8° ora di coltura (173/338: 51.1%)
mostravano una percentuale di schiuse pari al 67.6% (117/173), significativamente più alta se
paragonata al gruppo di blastocisti espanse entro la 16° ora di coltura (58/338: 17.1%;
percentuali di schiuse 25/58: 43.1%) (Test χ2; p<0.01). Sulle blastocisti schiuse è stata poi
eseguita la conta del numero cellulare totale, che è risultato significativamente maggiore nel
gruppo di blastocisti espanse entro la 8° ora di coltura se paragonate a quelle espanse entro la
16° ora di coltura (140.74±8.34 vs 102.28±8.47, rispettivamente; test ANOVA (mean±SE):
p<0.01).
Al momento della ri-espansione, ossia alla 8° ed alla 16° ora di coltura per i due gruppi, sono
stati inoltre valutati:
1) il grado dello stato ossidativo: cellule positive per embrione 0.625 vs 21.2
rispettivamente per gli embrioni espansi entro la 8° e la 16° ora di coltura (rapporto e
trasformazione arcseno: p<0.05);
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2) la presenza di cellule con frammentazione del DNA: cellule positive per embrione 0
vs 1.36 rispettivamente per gli embrioni espansi entro la 8° e la 16° ora di coltura
(rapporto e trasformazione arcseno: p<0.05);
3) espressione genica: i risultati evidenziano come la loro espressione sia in tutti i casi
maggiore nelle blastocisti espanse entro la 8° ora di coltura in vitro, rispetto a quelle
espanse entro la 16° ora di coltura in vitro (p<0.01);
4) sintesi proteica: mentre non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nel
pattern di sintesi proteica, è stata invece riscontrata una differenza statisticamente
significativa nella quantità di proteine sintetizzate, che è risultata maggiore nel gruppo
di blastocisti espanse entro la 8° ora di coltura, se paragonate a quelle espanse entro la
16° ora di coltura (test ANOVA: p<0.05);
5) prova di sopravvivenza in vivo: le percentuali di impianto al 30° giorno di gravidanza
in seguito al trasferimento di blastocisti sottoposte a vitrificazione e ripristino della
temperatura ed espanse entro 8 e 16 ore di coltura in vitro sono pari rispettivamente a
6 impianti su 15 embrioni trasferiti e 0 impianti su 8 embrioni trasferiti. Anche in
questo caso quindi le blastocisti espanse entro la 8° ora di cultura hanno dato un
numero di gravidanze significativamente maggiore rispetto al gruppo di embrioni
espansi entro la 16° ora di coltura (test χ2: p=0.037).
Discussione
La capacità di sopravvivenza degli embrioni post-vitrificazione viene comunemente valutata
attraverso la verifica della vitalità in vitro e della percentuale di blastocisti in grado di
continuare nello sviluppo fino alla schiusa entro 72° ore di coltura. Come evidenziano i nostri
risultati, le blastocisti che si ri-espandono già entro la 8° ora di coltura presentano poi
percentuali significativamente maggiori di schiusa. La velocità di ri-espansione della cavità
blastocelica assicura quindi, migliori capacità di recupero in seguito all’insulto causato dalla
vitrificazione.
D’altra parte, le percentuali di sopravvivenza in vitro e di impianto non possono essere
direttamente correlate alle percentuali di schiusa ottenute in vitro e quindi per poter valutare
effettivamente eventuali differenze qualitative tra i due gruppi di embrioni sono state eseguite
una serie di indagini più approfondite. Il numero cellulare totale, valutato al momento della
schiusa, significativamente più alto nelle blastocisti espanse alla 8° ora di coltura, testimonia
una maggiore attività replicativa dell’embrione. Contemporaneamente, gli embrioni espansi
entro la 16° ora di coltura in vitro presentavano un numero di cellule positive, sia presenza di
radicali liberi che alla frammentazione del DNA, significativamente maggiore .
L’espressione dei geni coinvolti nello sviluppo embrionale e nel metabolismo cellulare è
considerato un ottimo indicatore della qualità degli embrioni. Noi abbiamo analizzato i livelli
di mRNA di un set di geni marker coinvolti nello sviluppo embrionale: tutti questi trascritti
risultano essere maggiormente espressi nel gruppo di blastocisti espanse entro la 8° ora di
coltura.
La sintesi proteica delle cellule embrionali viene alterata dal processo di vitrificazione (Leoni
et al., 2003). I nostri risultati hanno evidenziato che negli embrioni espansi entro la 8° ora di
coltura in vitro la quantità di proteine secrete era significativamente maggiore rispetto agli
embrioni espansi entro la 16° ora di coltura in vitro, e questo dato potrebbe testimoniare una
più veloce ripresa della funzionalità metabolica da parte del primo gruppo di blastocisti. In
ultima analisi, è stata effettuata la prova di trasferimenti in vivo su pecore riceventi
opportunamente sincronizzate. Le percentuali di impianto ottenute sono risultate
significativamente maggiori nel gruppo di blastocisti espanse entro la 8° ora di coltura.
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Questi dati preliminari supportano un’altra volta l’ipotesi che le blastocisti espanse già entro
le prime 8 ore di coltura in vitro sarebbero poi in grado in maggiore percentuale di portare
avanti una gravidanza.
Bibliografia
Naitana S, Ledda S, Loi P, Leoni G, Bogliolo L, Dattena M, Cappai P. Polyvinyl alcohol as a
defined substitute for serum in vitrfications solutions to cryopreserve ovine embryos at
different stages of development. Animal Reproduction Science 1997; 48: 247-256.
Leoni G, Berlinguer F, Rosati I, Bogliolo L, Ledda S, Naitana S. Resumption of metabolic
activity of vitrified/warmed ovine embryos. Molecular, Reproduction and Development 2003;
64: 207-213.
