Tecniche elettroforetiche

Tecniche elettroforetiche
Applicazione:
Proteolisi limitata
PRINCIPI GENERALI
Elettroforesi:
Migrazione di particelle cariche sotto l’azione
di un campo elettrico

Il campo elettrico è generato applicando una differenza di potenziale V
tramite due elettrodi posti ad una distanza d. Il campo elettrico è dato da
E = V/d
La forza che agisce sulla molecola di carica q è uguale a Eq.
La velocità della particella è data da:
V = Eq / f
f è il coefficiente frizionale = 6prp
La mobilità elettroforetica
La mobilità elettroforetica (m) di uno ione è data da v/E ossia dal rapporto
tra la velocità dello ione e l’intensità del campo elettrico
Quando si applica una differenza di potenziale molecole con carica totale
diversa si separano in base alla diversa mobilità elettroforetica.
Molecole con carica uguale si separano in base alle diverse dimensioni.
Legge di Ohm
Dissipazione della potenza sviluppata
V/I=R
V = voltaggio
I = intensità di corrente
R = resistenza
Nella soluzione tra gli elettrodi la corrente viene principalmente trasportata
dagli ioni del tampone. Gli ioni del campione ne conducono solo una piccola
parte
Potenza sviluppata
W = I2 R
La maggior parte di questa potenza vene dissipata sotto forma di calore
Effetti del calore sulla separazione
elettroforetica
L’aumento della tempertura nella cella elettroforetica provoca
una diminuzione della resistenza e questo effetto dipende,
almeno in parte, da un aumento della mobilità ionica
dovuto a una diminuzione di viscosità e quindi dell'attrito
esercitato dal liquido rispetto al movimento degli ioni.
Il riscaldamento provocherà, inoltre, evaporazione del
solvente dal supporto e quindi diminuzione della resistenza,
ma anche migrazione più lenta del campione per l'aumento di
concentrazione.
Strumentazione
L'apparecchiatura per l'elettroforesi è composta,
fondamentalmente da due parti: un alimentatore e una
cella elettroforetica .
L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi
applicati alla cella elettroforetica e pertanto i cationi migrano verso il
catodo (-) e gli anioni verso l'anodo (+)
Schema di una camera elettroforetica
Perché l'elettroforesi abbia luogo, il
campione va sciolto in un tampone, col
quale va inoltre saturato l'eventuale
supporto per consentire la conduzione della
corrente. Il tampone serve, inoltre, per
mantenere costante lo stato di ionizzazione
delle molecole da separare, la cui carica
cambia con il pH, soprattutto nel caso di ioni
dipolari.
Durante l'elettrolisi, al catodo si
producono ioni ossidrile e idrogeno,
mentre all'anodo si producano ioni
idrogeno e ossigeno.
al catodo:
2e-+ 2H2O 2OH- + H2
all'anodo:
H2O 2H+ + ½ O2 + 2e
Gli ioni ossidrile, prodotti al catodo, aumentano la dissociazione del componente acido debole (HA)
della miscela tampone e ciò provoca un aumento della formazione di A- che conduce corrente
all'anodo. Qui gli ioni A- si combinano con gli ioni H+ per riformare HA e vengano forniti elettroni al
circuito elettrico.
Il campione
 La velocità di migrazione aumenta all'aumentare della
carica netta del campione. La grandezza della carica
dipende, generalmente, dal pH, in base a quanto stabilito
dell'equazione di Henderson-Hasselbalch.
 La velocità di migrazione diminuisce all'aumentare del
peso molecolare e questo perché aumentano le forze
frizionali ed elettrostatiche rispetto al mezzo circostante.
 Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad
esempio proteine fibrose e proteine globulari) mostrano
differenti caratteristiche di migrazione a causa del diverso
effetto delle forze frizionali ed elettrostatiche.
Il tampone
 Il tampone determina e stabilizza il pH del mezzo di supporto e
influenza anche la velocità di migrazione dei componenti del campione.
 I tamponi dì uso comune sono il formiato, l'acetato, il citrato, il
fosfato, il Tris, l'EDTA.
 Il tampone non deve legarsi ai composti da separare, perché ne
altererebbe la velocità di migrazione.
 Il tampone agisce come solvente del campione e quindi una certa
diffusione è inevitabile, soprattutto nel caso di molecole piccole, come
aminoacidi e zuccheri. Il grado di diffusione può essere ridotto evitando
un sovraccarico di campione, applicandolo in bande mollo strette,
usando un'alta tensione per il tempo più breve possibile e rimuovendo
e fissando rapidamente il supporlo al termine della corsa.
Concentrazione del tampone
 All'aumentare della forza ionica del tampone la quota di corrente
trasportata dal tampone aumenta mentre diminuisce la quota di
corrente trasportata dal campione che abbassa, così, la sua velocità di
migrazione.
 Inoltre un'elevata forza ionica del tampone incrementa la corrente
totale e quindi la produzione di calore.
 Viceversa a bassa forza ionica la quota di corrente trasportata dal
tampone diminuisce e aumenta la quota di corrente trasportata dal
campione che incrementa, così, la sua velocità dì migrazione.
 Una bassa forza ionica del tampone riduce la corrente totale e
determina quindi una minor produzione di calore. Tuttavia la diffusione
e la conseguente perdita di risoluzione sono maggiori.
 Perciò la scelta della forza ionica dovrà, in sostanza, rappresentare un
compromesso tra questi due estremi: essa è infatti normalmente
compresa tra 0,05 e 0,10 M.
Il materiale di supporto
Ha la funzione di stabilizzare il mezzo in cui avviene la separazione elettroforetica
Il mezzo di supporto elimina le correnti convettive e la diffusione in modo che i
componenti rimangano concentrati in bande strette
Cellulosa
Acetato di cellulosa
Silice (gel)
Amido (gel)
Agarosio (gel): DNA
poliacrilamide (gel)
Sephadex (gel)
L’elettroendosmosi
Durante la corsa elettroforetica si può assistere all'insorgenza di un
fenomeno chiamato elettro-endosmosi che è la conseguenza di una
differenza di carica tra le molecole di acqua del tampone e la
superficie del mezzo di supporto. Ciò genera una forza motrice che
provoca il movimento verso il catodo degli ioni ossonio del tampone
che, per un effetto di trascinamento del solvente, portano con sè
anche molecole prive di carica. Questo fenomeno accelera il
movimento dei cationi e ritarda quello degli anioni essendo contrario
alla loro migrazione
Gel di Poliacrilammide (PAGE)
Vengono preparati per polimerizzazione di un monomero di acrilammide in
presenza di N,N’-metilenbisacrilammide: si formano legami crociati
Polimerizzazione dell’acrilammide
La polimerizzazione è di tipo testa-coda, dando luogo a catene in cui l’inserimento
occasionale di bis-acrilammide fa sì che venga introdotto un nuovo di attacco per
l’estensione della catena: catalisi radicalica.
L’inizatore della polimerizzazione è l’ammonio
persolfato. Il TEMED (N,N,N’,N’tetrametilendiammina) catalizza la
decomposizione dello ione persolfato con
formazione di un radicale libero
R˙ + M
RM˙ + M
RM˙
RMM˙
Elettroforesi di proteine: SDS-PAGE
E’ una elettroforesi in condizioni denaturanti
SDS = sodio dodecil solfato
CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+
I campioni vengono bolliti per 5 minuti in un tampone (sample buffer)
contenente SDS e b-mercaptoetanolo: vengono ridotti i ponti disolfuro e la
proteina viene denaturata. Il tampone contiene blu di bromofenolo, usato
come tracciante, e saccarosio o glicerolo per aumentare la densità
L’SDS si lega alle proteine con lo stesso rapporto: una molecola di SDS
ogni due residui aminoacidici, (1,4:1 g)
Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa
Stacking gel e Running gel
Le proteine vengono separate nel gel di separazione (running gel), di
appropriata concentrazione di acrilammide (15-30 %) dove migrano in
base alla differenza di massa molecolare relativa.
Esse vengono caricate in un gel di impaccamento (stacking gel) posto al di
sopra del running gel, alto poco più di 1 cm, a bassa percentuale di acrilammide
(5-6 %)
Il gel di impaccamento serve a concentrare il campione in una banda sottile
prima che entri nel gel di separazione.
Funzione dello stacking gel
Quando si applica il campo elettrico gli ioni presenti nei campioni iniziano
a muoversi: nel gel di impaccamento, ad un pH 6.7, gli ioni cloruro
tendono a muoversi molto velocemente, seguiti dai complessi proteinaSDS mentre la glicina, essendo al suo punto isoelettrico, è praticamente
ferma. La glicina si oppone quindi alla corsa dei Cl - e del complesso; per
mantenere il circuito, le proteine, che sono in concentrazione molare
molto più bassa rispetto agli ioni Cl - , tendono a concentrarsi in un volume
molto piccolo e nel gel si osserva proprio la formazione di una strato molto
sottile e molto concentrato al limite tra gel di impaccamento e gel di corsa.
Questo impaccamento iniziale serve a rendere migliore la separazione.
Quando la glicina entra nel gel di separazione a pH 8,9 il complesso inizia
la sua corsa e si separa in base al suo peso molecolare grazie alla
proprietà di setaccio molecolare del gel di acrilamide.
Colorazione e decolorazione del gel
Il colorante generalmente usato è il trimetilamino solfato Comassie brilliant Blue:
Viene usato allo 0,1% in metanolo, acqua e acido acetico glaciale. Il colorante
fissa le proteine nel gel.
Quindi il gel viene lavato in una soluzione decolorante che porta via il colorante
che non si è legato alle proteine, lasciando le proteine visibili come bande blu
Determinazione della massa
molecolare di proteine
Scelta della giusta concentrazione del gel di poliacrilammide: per proteine di Mr tra
10000 e 100000 si utilizzano concentrazioni pari a circa 15 %,
Per proteine di Mr sopra a 100000 si devono utilizzare concentrazioni più basse di
poliacrilammide (7,5-10%) in modo da far penetrare le proteine nel gel.
Si usano proteine a peso molecolare noto
per costruire una retta di calibrazione.
Log(Mr) vs mobilità relativa
Controllo delle fasi di purificazione
Elettroforesi in condizioni native
Non c’è SDS, le proteine non vengono denaturate!!
Le proteine vengono separate in base alla carica nativa al pH del gel (di solito
8,7) e in base alle proprietà di setaccio molecolare del gel, si usano basse
conentrazioni di poliacrilammide (7,6%) .
Isoelettrofocusing. Questa tecnica è dotata di un elevatissimo potere
risolutivo ed è impiegata per la separazione di composti anfoteri, ad esempio
amminoacidi e peptidi, e in particolare di isoenzimi: è infatti sufficiente una
differenza in punti isoelettrici di sole 0,01 unità di pH per ottenere una
separazione apprezzabile.
Aminoacidi e peptidi anfoteri sono separati in un campo elettrico lungo il quale
vi è un gradiente sia di potenziale sia di pH
Elettroforesi bidimensionale su gel di
poliacrilammide
E’ una tecnica che combina
l’isoelettrofocalizzazione (IEF)
con la SDS-PAGE
Si ha la separazione sia in base
al pI delle proteine che in base
alla loro massa molecolare
relativa
Elettroforesi bidimensionale
Permette di risolvere tra le 5000 – 10000 proteine da un patrimonio di circa
10000-20000 proteine che può esprimere una cellula
PROTEOMA = Proteine espresse da un genoma
Isoelettrofocalizzazione: viene eseguita in tubi
stretti (1-2 mm diametro) contenenti gel di poliacrilammide, anfoliti,
urea e un detergente non ionico
Separa le proteine in base al loro pI, che può variare anche solo 0.01
unità di pH.
Anfoliti = acidi poliammino-policarbossilici sintetici
Relazione carica netta/pH di una
proteina
Isoelettrofocalizzazione in gradienti di
pH immobilizzati
Il sistema utilizza una serie di derivati di acrilammide
(Immobiline) aventi la struttura
=
O
generale CH2=CH-C-NH-R dove R contiene sia gruppi
carbossilici che amminici. La copolimerizzazione di questi
monomeri con diverso pKa in diversa concentrazione permette
di creare dei gradienti preformati di pH all'interno del gel.
IPG Immobilized pH gradient
Si formano partendo da
due soluzioni di
acrilammide, a cui è
attaccato il gruppo R
tamponante, a diverso pH.
Quindi si forma il gradiente
di pH che polimerizza
formando una matrice di
poliacrilammide a cui sono
attaccati i gruppi
tamponanti R
La seconda dimensione
Dopo l’IEF, il gel viene recuperato dal tubo, incubato con un tampone
contenente SDS e quindi viene caricato nel gel contenente SDS
La separazione avviene quindi in base alle dimensioni
Applicazioni della 2D-PAGE
Mappatura delle proteine realmente espresse in un tessuto (modificazioni
post-traduzionali)
I dati ottenibili dalla 2D-PAGE sono molti e complessi
Software dedicati all’analisi dei dati
Possibilità di confrontare due gel 2D
Costruzione di database di espressione proteica di vari tipi di tessuto e cellule
Risposta dell’espressione di proteine da parte della cellula a vari “trattamenti”
(farmaci, ormoni, tossine)
Caratterizzazione delle proteine
separate
Sequenziamento proteico diretto della macchia tramite degradazione di Edman
analizzatore automatico
Profili di masse peptidiche tramite spettrometria di massa
Determinazione della sequenza tramite spettrometria di massa
Ricerca di sequenze con SWISS-PROT
Western blotting
Questo sistema permette di trasferire macromolecole da un gel in cui sia
avvenuta la separazione elettroforetica ad una membrana immobilizzante
(nitrocellulosa o PVDF (PolyVinylDiFluoride))
Le proteine devono trasferirsi dal
gel alla membrana mantenendo la
forma e il livello di diffusione
acquisiti alla fine della prima
separazione elettroforetica.
elettroblotting
Sandwich di gel e nitrocellulosa
Compresso tra due fogli di plastica rigidi
Immerso in un tampone
Tra due elettrodi paralleli
Analisi del blot: Si sfrutta l’interazione specifica di
una proteina con un anticorpo
Prima di trattare la membrana con l’anticorpo essa viene incubata con una
soluzione proteica di BSA al 10% per bloccare i siti della membrana che
possono ancora dare interazioni idrofobiche.
• Incubazione del blot con un
anticorpo primario
• Incubazione con un anticorpo
secondario coniugato con un
enzima
Rivelazione della perossidasi con ECL
(Enhanced ChemiLuminescence)
La perossidasi ossida il substrato luminolo in presenza di H2O2 producendo
luce che va ad impressionare una lastra fotografica