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L'elettroforesi è una tecnica di separazione che si basa sulla diversa mobilità di
ioni in un substrato sottoposto ad un campo elettrico. Gli ioni si muovono più o
meno rapidamente lungo il substrato in funzione della loro carica, dimensione,
forma. A seconda della tecnica usata, la strumentazione consiste in:
 2 vaschette contenenti un elettrolita (tampone),
 un supporto (es. carta da filtro, striscia di acetato di cellulosa, gel di
poliacrilamide, gel di agarosio, tubo capillare),
 un alimentatore elettrico in CC
 2 elettrodi.
L'elettroforesi viene ampiamente utilizzata per separare sostanze
quali ad esempio amminoacidi, proteine, spezzoni di DNA, etc. Come
nel caso della cromatografia, anche in questa tecnica si utilizzano
substrati e solventi diversi a seconda delle sostanze da separare e
delle tecniche seguite.
L'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di
migrazione di particelle elettricamente cariche attraverso una soluzione, sotto
l'influenza di un campo elettrico.
Il principio base è quello di un setaccio molecolare attraverso il quale le
diverse molecole vengono fatte passare: la velocità di migrazione dipende dalla
massa, dalla dimensione, dalla carica e dalla forma delle varie particelle, ossia
dalla loro mobilità elettroforetica. Questa grandezza è il rapporto tra la
velocità della particella (cm/s) e il campo elettrico utilizzato (V/cm).
La mobilità elettroforetica, essendo una funzione del rapporto tra carica e
raggio, è diversa da una particella ad un'altra. Applicando un campo
elettrico ad una miscela ionica le varie specie migreranno con velocità
diversa a seconda delle rispettiva mobilità.
L'elettroforesi è un metodo di separazione eccellente per
macromolecole ed in particolare per proteine e
frammenti di DNA; la sua semplicità e la sua velocità
rendono tale sistema il più diffuso ed utilizzato.
Esempio di migrazione elettroforetica di una soluzione ionica.
Le particelle cariche positivamente migrano verso il polo
negativo e viceversa.
A seconda delle dimensioni le particelle si dispongono in zone
diverse del supporto: le più grandi più vicine ai pozzetti di
caricamento e le più piccole più avanti.
LE APPLICAZIONI ANALITICHE
Proteine
1. Determinazione del peso molecolare
2. Determinazione di sostituzioni, inserzioni o delezioni di aminoacidi
3. Criteri di purezza
Acidi nucleici
1. Determinazione del peso molecolare
2. determinazione di sostituzioni, inserzioni o delezioni di basi
3. Analisi di sequenza
PRINCIPI GENERALI
•
L'apparecchiatura per l'elettroforesi è composta, fondamentalmente da due parti: un
alimentatore e una cella elettroforetica. L'alimentatore fornisce un flusso di
corrente continua agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica e pertanto i cationi
migrano verso il catodo (-) e gli anioni verso l'anodo (+) a una velocità che dipende
dall'equilibrio tra la forza di spinta del campo elettrico e le forze frenanti (frizionali ed
elettrostatiche) esistenti tra ioni e mezzo circostante.
•
Perché l'elettroforesi abbia luogo, il campione va sciolto in un tampone, col quale
va inoltre saturato l'eventuale supporto per consentire la conduzione della corrente. Il
tampone serve, inoltre, per mantenere costante lo stato di ionizzazione delle molecole
da separare, la cui carica cambia con il pH, soprattutto nel caso di ioni dipolari.
•
La corrente è mantenuta lungo il circuito dall'elettrolisi che ha luogo agli elettrodi,
entrambi i quali pescano in capaci recipienti contenenti il tampone. Durante l'elettrolisi,
al catodo si producono ioni ossidrile e idrogeno, mentre all'anodo si producano ioni
idrogeno e ossigeno
•
L'elettroforesi può essere condotta in soluzione libera, senza supporto (nel qual caso si
osserva una resistenza frizionale molto piccola tra ioni e soluzione e quindi un'elevata
velocità di migrazione, questa condizione si verifica nell'elettroforesi a flusso continuo)
oppure con un supporto inerte e omogeneo. Si parla di elettroforesi a fronte mobile
•
Quando l'elettroforesi è condotta su un supporto, i componenti del campione migrano
come bande o "zone" distinte che, al termine della corsa, possono essere rivelate
mediante opportune tecniche analitiche. Questo metodo che prende, quindi, il nome di
elettroforesi zonale.
Il campione
 La velocità dì migrazione aumenta all'aumentare della carica netta
del campione. La grandezza della carica dipende, generalmente, dal
pH, in base al grado di dissociazione dell’analita.
 La velocità di migrazione diminuisce all'aumentare del peso
molecolare e questo perché aumentano le forze frizionali ed
elettrostatiche rispetto al mezzo circostante.
 Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad esempio
proteine fibrose e proteine globulari) mostrano differenti caratteristiche
di migrazione a causa del diverso effetto delle forze frizionali ed
elettrostatiche.
Il tampone
 Il tampone determina e stabilizza il pH del mezzo di supporto e
influenza anche la velocità di migrazione dei componenti del campione.
 I tamponi dì uso comune sono il formiato, l'acetato, il citrato, il
barbitone, il fosfato, il Tris, l'EDTA la piridina.
 Il tampone non deve legarsi ai composti da separare, perché ne
altererebbe la velocità di migrazione. In casi particolari, tuttavia,
questo fenomeno può essere opportunamente sfruttato.
 Il tampone agisce come solvente del campione e quindi una certa
diffusione è inevitabile, soprattutto nel caso di molecole piccole, come
aminoacidi e zuccheri. Il grado di diffusione può essere ridotto
evitando un sovraccarico di campione, applicandolo in bande molto
strette, usando un'alta tensione per il tempo più breve possibile e
rimuovendo e fissando rapidamente il supporlo al termine della corsa.
Forza ionica del tampone
forza ionica 
1
 cz 2
2
 All'aumentare della forza ionica del tampone, aumenta la quota
corrente trasportata dal tampone mentre diminuisce la quota
corrente trasportata dal campione che abbassa, così, la sua velocità
migrazione. Inoltre un'elevata forza ionica del tampone incrementa
corrente totale e quindi la produzione di calore.
di
di
di
la
 Viceversa a bassa forza ionica la quota di corrente trasportata dal
tampone diminuisce e aumenta la quota di corrente trasportata dal
campione che incrementa, così, la sua velocità dì migrazione. Una
bassa forza ionica del tampone riduce la corrente totale e determina
quindi una minor produzione di calore. Tuttavia la diffusione e la
conseguente perdita di risoluzione sono maggiori.
Perciò la scelta della forza ionica dovrà, in sostanza,
rappresentare un compromesso tra questi due estremi: essa è
infatti normalmente compresa tra 0.05 e 0.10 M.
Il pH
 Ha poco effetto sui composti completamente ionizzati, ad esempio i
sali inorganici, mentre determina il grado di ionizzazione dei composti
organici dissociabili. La dissociazione degli acidi organici aumenta
all'aumentare del pH, mentre il contrario accade per le basi organiche.
In entrambi i casi la velocità di migrazione risulta peraltro dipendente
dal pH. Per composti come gli aminoacidi, che hanno proprietà sia
acide sia basiche (anfoliti) si avranno entrambi gli effetti del pH
 Pertanto, sia la direzione sia la velocità di migrazione degli anfoliti
dipendono dal pH. I tamponi usati per la loro separazione hanno un pH
compreso fra 1 e 11.
 Se il tampone presente nelle due camere è lo stesso utilizzato per
saturare il supporto, si parla di sistema continuo.
 Se il tampone presente nelle due camere non è lo stesso utilizzato per
saturare il supporto, si parla di sistema discontinuo.
Il supporto
Sebbene come supporto vengano utilizzati materiali relativamente
inerti, essi possono presentare effetti di adsorbimento, di elettro-osmosi e
di filtrazione molecolare che modificano la velocità di migrazione dei
componenti.
I supporti comunemente usati per l'elettroforesi zonale sono:
1. Cellulosa (carta)
2. Acetato di cellulosa
3. Silice (gel)
4. Amido (gel)
5. Agarosio (gel)
6. Poliacrilamide (gel)
7. Sephadex (gel)
Nelle separazioni di sostanze ad alto peso molecolare, come le proteine e
gli acidi nucleici, l'uso dei gel come mezzo di supporto ha ampiamente
sostituito i sistemi elettroforetici a basso voltaggio su carta e su strato
sottile, in quanto questo mezzo offre un maggior potere risolutivo. Le
molecole più piccole si possono invece separare solo su gel di Sephadex.
I gel si preparano subito prima dell'uso partendo da solidi in polvere quali
amido, agar, acrilamide.
Rivelazione e identificazione
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Generalmente si sfrutta l'assorbimento e o la fluorescenza nell'ultravioletto.
Ad esempio per gli acidi nucleici e le proteine in gel di poliacrilamide si
sfrutta l'assorbimento a 260-280 nm.
Per un'analisi nel visibile si ricorre a una colorazione preventiva. L'eccesso di
colorante deve essere rimosso. Prima di ogni colorazione però
l'elettroforegramma deve essere fissato per ridurre la diffusione delle
bande.
La soluzione di fissaggio può essere ad esempio acido
tricloroacetico al 10% (per 30 minuti). Poi i campioni vengono colorati
per 10 minuti col colorante appropriato (Blu Coomassie Brilliant R-250 per
le proteine ad esempio). L'eccesso di colorante deve essere rimosso con
ripetuti lavaggi in un decolorante (una soluzione acquosa di etanolo al
25% e acido acetico all'8%). Un'altro tipo di colorazione prevede l'uso del
nitrato d'argento. La sensibilità in questo caso è due volte maggiore che
col Coomassie (può rivelare 1 ng di proteina)
La rivelazione degli enzimi avviene non fissando l'elettroforegramma e
impiegando le tecniche di istochimica, facendo avvenire la reazione tra
l’enzima e il substrato e formando un prodotto colorato insolubile. Il gel
quindi viene fatto venire in contatto col substrato in condizioni tali che
l'attività enzimatica sia ottimale.
Se invece il composto è radioattivo si può dosare con tecniche
radiochimiche.