Laboratorio di Bioinformatica I Visualizzazione Molecolare Dott. Sergio Marin Vargas (2014 / 2015) PDBsum http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/ Ricerca per codice PDB Ricerca testuale Ricerca per sequenza Ricerca per diversi databases PDBsum http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/ Molta informazione su struttura secondaria, ligandi e interazioni con altre proteine PROCHECK: Ramachandran Plot Proteine e catene all’interno della struttura risolta (file PDB) Ligandi Annotazione funzionale Gene Ontology (GO) Ramachandran Plot Angolo diedro Angolo diedro Psi Carbonio Alfa Angolo diedro Phi Angolo diedro Omega Serve a verificare per ciascun aminoacido se la struttura risolta o modellata è concorde agli angoli Psi e Phi Uppsala Ramachandran Server http://eds.bmc.uu.se/ramachan.html Codice PDB 5 Distanze di legame Legame a idrogeno: 2.5-3.5 Å Interazioni di van der Waals: 3-4 Å Legame ionico (ponte salino): 2.8 Å Interazioni di stacking: 4 Å Interazioni di Stacking: circa 4 Å 6 Esercizio 1: UNIPROT-PDBsum La DNA-glicosilasi umana (una particolare liasi), è un enzima che catalizza la rottura di svariati legami chimici producendo un nuovo doppio legame o una nuova struttura aromatica. Ricercare in UNIPROT la DNAglicosilasi umana il cui gene è OGG1. • • • • • • Qual è il codice uniprot della proteina? Quanto è lunga la proteina? Quante strutture esistono di questa proteina? Qual è l’entry PDB a maggiore risoluzione? Esistono strutture 3D della proteina intera? Visualizzare in PDBsum la struttura di 2XHI (ci sono link direttamente da UNIPROT?) • Scaricare il file PDB di 2XHI e analizzarlo (usare il link diretto a PDB che c’è in PDBsum). • Ci sono atomi di idrogeno nella struttura? Perchè? Esercizio 2: Ramachandran Plot Visualizzare l’entry 1EBM in PDBsum • • Questa proteina contiene α-eliche? β-sheets? Loops? Quali elementi di ss sono più numerosi? Quanti domini ci sono? Cliccare sulla figura di Procheck per visualizzare il Ramachandran plot. • • • Da questo grafico se può intuire se la proteina contiene αeliche? β-sheets? Loops? E quali sono più numerosi? I residui di Gly (triangoli blu) sono distribuiti diversamente dagli altri aminoacidi (quadratini blu)? Perché? Un solo residuo è mostrato in rosso. Quale? In che elemento di ss è presente? Idee sul perchè? Esercizio 2: Ramachandran Plot Acido Aspartico 174 posizionato nella regione gialla, una regione permessa ma non è quella comune per questo aminoacido! Glicine Esercizio 3: PDB entry Visualizzare l’entry 1EBM nel database PDB. - Quali macromolecole contiene la struttura? Quante catene ha la struttura principale? Cosa rappresenta la catena A? La proteina è mutata? Se si, Quale mutazione? E’ una proteina intera? Mancano residui? Perchè? Cliccare sul tab Sequence. Che informazioni troviamo? Esercizio 4: PDB file Visualizzare l’entry 1EBM nel database PDB ed scaricare il file PDB che descrive la proteina. • Chi sono gli autori del lavoro strutturale? • Si tratta di cristallografia a raggi X o di NMR? • Qual è la risoluzione della struttura? • Cosa si trova al REMARK 200? Hanno usato luce di sincrotrone per risolvere la struttura? • Cosa si trova al REMARK 470? • Cosa si tova nel campo SEQRES? • Quante α-eliche e β-sheets ci sono? • Trovare le coordinate del carbonio alfa di Asp174. UCSF Chimera http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ PyMOL https://www.pymol.org/ http://pymolwiki.org/index.php/Main_Page Un programma utilità per la visualizzazione di macro-molecole, il quale utilizza come input un file in formato PDB. PyMOL Finestra menu Finestra principale Menu della proteina: (A)ction, (S)how, (H)ide, (L)abel, (C)olor Esercizio 5: PyMOL introduzione Lanciamo PyMOL ed apriamo il file 1EBM.pdb precedentemente salvato. Prendiamo dimestichezza con il programma: • • • • • • Mostriamo la sequenza: Display sequence Usiamo il mouse per ruotare la molecola (tenere premuto il pulsante sx) e per lo zoom (tenere premuto il pulsante dx). Proviamo lo scroll: che fa? Cosa sono le crocette rosse? Riusciamo a nasconderle? Nascondiamo tutta la struttura cliccando a destra sul codice PDB, poi selezionamo le varie modalità di rappresentazione in “S” (Show As): lines, sticks, ribbon, spheres, surface, per rasconderle in “H” (Hide). Che differenza c’è tra l’una e l’altra? Provare “lines” e colour “Gray 60”, poi scegliere “by elements”. Provare a colorare per catena e visualizzare come “cartoon”. Esercizio 6: PyMOL selezione aa Aprire il file 1EBM mediante PyMOL: • Nascondere tutto ciò che è visualizzato e scegliere “show as cartoon” poi colorare “by secondary strucure”. • Quanti β-sheets ci sono? • Quanti filamenti β contiene ciascun foglietto? • Dal server Uppsala Ramachandran (http://eds.bmc.uu.se/ramachan.html) generare il plot di Ramachandran di questa proteina. Quanti outlier ci sono? • Visualizzare la sequenza della proteina in PyMOL. • Asp174 è un outlier nel plot di Ramachandran. Localizzare il residuo nella sequenza di PyMOL e cliccarlo. Esso viene selezionato nel panel a destra (scrita “sele). • Rinominare la selezione: Scegliere “Action rename selection” poi digitare il nome: Asp174 • Visualizzare l’amino acido selezionato come “sfere” e colorarlo per elemento Esercizio 7: PyMOL surface Aprire il file 1EBM mediante PyMOL: • Rappresentare 1EBM come “surface”. • Il residuo Asp174 si trova sulla superficie? • Rappresentare 1EBM come “struttura secondaria” e colorarlo di rosso. • Selezionare i residui di triptofano con il comando: “select TRP, resn trp” trp rappresentarli in stick e colorarli di giallo. • I Trp sono prevalentemente esposti al solvente? Perchè? • Rappresentare nuovamente 1EBM come “surface” e cambiare il setting della trasparenza dal menù in alto: Setting Transparency Surfare 50% e visualizzare nuovamente i triptofani. • Il residuo Trp47 è esposto al solvente? Da cosa lo capisco? Cosa succede con il Trp313? • Salvare l’image della proteina in formato PNG. Esercizio 8: PyMOL interazione Scaricare e visualizzare la struttura corrispondente al PDB entry 1BRS. • Di che struttura si tratta? • Quante catene sono presenti? Si può dire che si tratta di un esamero? Perchè? Creare due nuovi oggetti corrispondenti alle catene A e D, mediante il comando “select cat_A/D, chain A/D”, poi sulle selezioni generate fare “A copy object” e poi rinomimare i nuovi oggetti. Cancellare l’oggetto 1BRS “A delete object”. • Quanti foglietti beta ci sono nella catena D? • Identificare una coppia di residui dell’interfaccia proteinaproteina che fanno un legame di stacking? • Qual è la distanza (Wizard Measurement) più corta tra un qualsiasi atomo di His102 (cat.A) e un qualsiasi atomo di Tyr29 (cat. D)? Esercizio 8: PyMOL interazione H102 (Cat A) Y29 (Cat D) VMD http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ VMD Caricare molecole http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ Finestra Menu Principale Rappresentazione grafica Finestra Display VMD tutorial http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/vmd/tutorial-html/ R T S C modalità rotazione modalità traslazione modalità scala Per centrare dove c’è il mouse Esercizio 9: VMD introduzione Scaricare la struttura del complesso transferrin receptor 1 e transferrin legato al ferro (codice PDB 3S9L). • • • • • • • • Quante catene ha la struttura? Quale catena appartiene a quale proteina? In “Graphics Representations”, cliccando sulla selezione “all”, mettere “Drawing Method” a “NewCartoon” e “Coloring Method” a “Chain”. Selezionare solo la catena “A” mediante “Create Rep” poi scrivere “chain A” e con doppio click su “all” nascondere tutta la proteina. Quale colore corrisponde a quale catena? Analizzare il file PDB, a quale numero di residuo “#” corrisponde lo ione “Ca++” e a quale catene è legato? In VMD evidenziare il “Ca” mediante “Create Rep” poi scrivere “resid #”, poi “Drawing Method” a “VDW” (van der walls) e “Coloring Method” a “ColorID” e poi scegliere giallo. Mettere a trasparenza le catene. Analizzando la struttura in PDBsum a quali aminoacidi è legato il Ca? L’informazione riportata su PDBsum è veritiera? Cioè verificare nella struttura 3D che gli aminoacidi indicati siano negli intorni del Ca (Suggerimento: “Drawing Method” “Licorice” e “Coloring Method” “Element” poi etichettarli con “Label”). Esercizio 9: VMD introduzione Esercizio 10: VMD distanze Con la stessa struttura del complesso transferrin receptor 1 e transferrin legato al ferro (3S9L) dell’esercizio precedente. • Individuare il numero di residuo corrispondente allo ione Fe++. A quale catene è legato? • Analizzare la struttura in PDBsum a quali catene è legato il Fe? A quali amino acidi?. • Caricare la struttura in VMD, colorare e visualizzare nel modo più conveniente, visualizzare solo una delle catene che legano il Fe e poi evidenziare il Fe. • Trovare la distanza tra il Fe e il carbonio alfa di ciascuno degli aminoacidi con cui si lega. (Suggerimento: utilizzare Mouse Label Bonds) Esercizio 11: VMD surface Caricare in VMD la struttura dell’emoglobina (PDB 2W6V). • Controllare quante catene ci sono e a cosa corrisponde ogni catena, individuare il “resid” del gruppo EME (HEM). • In “Graphics Representations” eliminare le acque con “not water”. • Creare nuove rappresentazioni una per ogni catena e colorare le catene A,B,C e D di Blu, Red, Gray e Orange rispettivamente utilizzando la trasparenza ed impostare “Drawing method” a QuickSurf. • Per una visione più chiara dei gruppi EME nascondere completamente la struttura “lines” di tutta la proteina (all). • Creare nuove rappresentazioni per I gruppi “EME”, impostare “Drawing method” a Licorice, colorare per “elemento” e materiale “opaco”. • Misurare la distanza tra il Fe++ legato al gruppo EME della catena B con quello della catena C. Quanti Å ci sono ? Esercizio 12: VMD interazione Caricare in VMD la stessa struttura utilizzata nell’esercizio 8 (PDB 1BRS). • Visualizzare solo le catene A e D, visualizzarle come “New Cartoon” e colorarle come “struttura secondaria”. • Utilizzando l’estensione “Extensions Analysis Sequence Viewer” selezionare gli aminoacidi His102 della catena A e Tyr29 della catena D. • Qual è la distanza tra il carbonio E1 di His102 e il carbonio E1 di Tyr29? Corrisponde alla distanza di un legame di stacking? Esercizio 12: VMD interazione H102 (Cat A) Y29 (Cat D)