ENZIMI
Gli ENZIMI sono proteine (eccezioni: RIBOZIMI = RNA con attività
catalitica) che sono strutturalmente suddivise in due classi:
• PROTEINE SEMPLICI (costituite solo dalla parte di natura proteica)
• PROTEINE CONIUGATE (costituite da una parte proteica e da una di
natura non proteica)
IONI ESSENZIALI
ATTIVATORI
COSTITUTIVI
COFATTORI
COENZIMI
CO-SUBSTRATI
GRUPPI PROSTETICI
Cofattori
Piccole molecole organiche o inorganiche la cui presenza è necessaria perché
un enzima sia attivo
• GRUPPO PROSTETICO se legato molto saldamente all’apoenzima
Gli ENZIMI sono costituiti da molecole di natura proteica
(eccezioni: RIBOZIMI= RNA con attività catalitica) e possono
essere suddivisi in due classi:
• PROTEINE SEMPLICI
• PROTEINE CONIUGATE
Oloenzima: complesso cataliticamente attivo enzima-cofattore
Apoenzima: la parte proteica,priva di cofattore,
cataliticamente inattiva
Cofattore: componente non proteica (IONE METALLICO o
MOLECOLA ORGANICA)
Dal punto di vista strutturale gli enzimi possono essere distinti in:
• MONOMERICI
• OLIGOMERICI
• COMPLESSI ENZIMATICI
IONI ESSENZIALI
ATTIVATORI
COSTITUTIVI
COFATTORI
COENZIMI
CO-SUBSTRATI
GRUPPI PROSTETICI
Cofattori
Piccole molecole organiche o inorganiche la cui presenza è necessaria perché un
enzima sia attivo
• In genere TERMOSTABILI, mentre la maggior parte degli enzimi perde
l’attività in seguito a riscaldamento
• Funzionano in genere da trasportatori intermedi di gruppi funzionali, di atomi
specifici o di elettroni che vengono trasferiti nella reazione enzimatica generale
• GRUPPO PROSTETICO se legato molto saldamente all’apoenzima
GLI ENZIMI SONO PROTEINE!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Alcuni enzimi che contengono o richiedono come cofattori elementi inorganici
Zn2+
Alcool deidrogenasi
Anidrasi carbonica
carbossipeptidasi
Fe2+ o Fe3+
Citocromi
Catalasi
Perossidasi
Mg2+
Esochinasi
Glucosio-6-fosfatasi
Piruvato chinasi
Mn2+
Arginasi
Ribonucleotide reduttasi
Cu2+
Citocromo ossidasi
Tirosinasi
K+
Piruvato chinasi
Na+
ATPasi della membrana plasmatica
Ni2+
Ureasi
Mo
Xantina ossidasi
Se
Glutatione perossidasi
N.B. Effetti tossici di alcuni metalli pesanti (Cd2+ e Hg2+ possono sostituire lo ione Zn2+ nel
sito attivo di alcuni enzimi, rendendoli inattivi)
VITAMINE IDROSOLUBILI
DENOMINAZIONE
FABBISOGNO
CARENZA
COENZIMA
FUNZIONE
B1
TIAMINA
1.5 mg
beri-beri
TPP
Decarbossilazione
B2
RIBOFLAVINA
1.5 mg
Dermatite,
Cheilosi
FMN, FAD
Redox
PP
NICOTINAMIDE
10 mg
Pellagra
NAD, NADP
Redox
B5
Ac. PANTOTENICO
10 mg
Affaticamento
HSCoA
Trasporto acili
B6
PIRIDOSSALE
2 mg
Anemia
microcitica
Dermatite,
Nevrite
PLP
Metabolismo Aa,
Sintesi EME
B10
Ac. FOLICO
0.4 mg
Anemia macro.
megaloblastica
FH4
Metab. Unità
monoCarboniose
B12
COBALAMINA
5 µg
Anemia
perniciosa
Adenosil B12
Metil B12
Isomerizzazione,
Metilazione
C
Ac. ASCORBICO
60 mg
Scorbuto
H
BIOTINA
0.3mg
Affaticamento,
Depressione,
Dermatite
Redox
Biocitina
Carbossilazione
Classificazione
Ø Ossidoriduttasi : reazioni di ossidoriduzione
Ø Transferasi : trasferimento di un raggruppamento chimico
(carbossile, acile, amminico, fosforico, etc.)
Ø Idrolasi : reazioni idrolitiche
Ø Liasi : rottura non idrolitica e, in molti casi, formazione di legami
covalenti C-C, C-N, C-S (decarbossilasi, aldolasi, etc.)
Ø Isomerasi : riorganizzazioni intramolecolari (reazioni
monomolecolari)
Ø Ligasi : formazione di legami covalenti in reazioni fortemente
endoergoniche, che avvengono grazie all’utilizzo di ATP (sintetasi,
carbossilasi, etc.)
Gli enzimi: catalizzatori biologici
- La catalisi è necessaria per permettere a molte reazioni biochimiche essenziali di
procedere ad una velocità compatibile con le esigenze fisiologiche in condizioni di
temperatura e pH molto blande
- Gli enzimi aumentano la velocità di una reazione chimica senza subire trasformazioni
durante l’intero processo
- Gli enzimi non influiscono sulla posizione dell‘equilibrio di una reazione
- Un processo termodinamicamente favorito non viene reso più favorito, né un
processo sfavorito viene reso favorito, dalla presenza di un catalizzatore
LO STATO DI EQUILIBRIO VIENE SOLO RAGGIUNTO PIU’
VELOCEMENTE
AUMENTANO LA VELOCITA’ DI REAZIONE
ABBASSANDO L’ENERGIA DI ATTIVAZIONE
Velocità di una reazione
Quantità del prodotto formatosi, o del substrato scomparso,
nell’unità di tempo
A
B
d[A]
d[B]
v=
=dt
dt
Velocità di una reazione irreversibile di primo ordine
Quantità del prodotto formatosi, o del substrato scomparso,
nell’unità di tempo
A
B
d[A]
d[B]
v==
dt
dt
Il ΔG è utile per comprendere il funzionamento degli enzimi
• L’energia libera (G) è una funzione termodinamica che
rappresenta una misura dell’energia utile, cioè dell’energia
in grado di compiere un lavoro
• L’equilibrio della reazione
dipende da ΔG°
ΔG° <0 spontanea
• La velocità di reazione
dipende dalla barriera
energetica ΔG‡ :
l’energia di attivazione
Affinché una reazione chimica abbia luogo:
A --à B
ΔG° negativo
GA > GB
reazione esoergonica
1. I reagenti devono entrare in collisione
2. La collisione deve avvenire con un
orientamento corretto
3. I reagenti devono avere energia
sufficiente per poter reagire
4. ENERGIA DI ATTIVAZIONE
energia libera supplementare che le
molecole devono possedere per
raggiungere una condizione reattiva nota
come stato di transizione
Energia
di
attivazione
Gli enzimi catalizzano le reazioni
abbassando la barriera di attivazione
piuttosto che aumentando l’energia
media dei reagenti. Essi legano
saldamente gli intermedi allo stato di
transizione e l’energia di legame di
questa interazione riduce l’
ENERGIA DI ATTIVAZIONE.
Enzimi
SITO ATTIVO
Sito di legame (microambiente tridimensionale
della struttura della proteina dove
vi è l’interazione con il substrato)
Sito catalitico (porzione limitata del sito attivo
costituito dagli aminoacidi coinvolti
direttamente nella reazione enzimatica)
Specificità di reazione
Le molecole non devono incontrarsi casualmente ma vengono ospitate nel sito attivo e quindi il loro
incontro è facilitato inoltre vengono a confrontarsi in una posizione utile (corretto orientamento).
Come lavorano gli enzimi
La velocità di una reazione, misurata come quantità di prodotto ottenuto in un tempo
definito, dipende dall’energia di attivazione.
Gli enzimi abbassano l’energia di attivazione.
Gli enzimi modificano solo la velocità della reazione e non gli equilibri.
Quando un Substrato (S) interagisce con il suo specifico Enzima (E) per la formazione del
complesso (ES) si tratta di interazioni deboli con rilascio di energia libera e
abbassamento dell’energia di attivazione della reazione
Cosa fa l’enzima ?
- forma il complesso ENZIMA-SUBSTRATO (ES)
- abbassa il livello energetico dello STATO DI TRANSIZIONE
- diminuisce quindi l‘ENERGIA DI ATTIVAZIONE
- aumenta la velocità della reazione aumentando la frazione di molecole
che hanno sufficiente energia per raggiungere lo stato di transizione
Ø In mancanza di enzima solo una piccola proporzione di molecole possiede
un’energia sufficiente a raggiungere lo stato di transizione
Ø La velocità di una reazione dipende dal numero di molecole che possono
raggiungere lo stato di transizione
Ø In genere, quanto più è bassa l’energia di attivazione, tanti più numerose
saranno le molecole dotate di un’energia sufficiente e, quindi, tanto più veloce
sarà la reazione.
Meccanismo catalisi enzimatica
Le interazioni deboli sono ottimali allo stato di transizione della reazione;
i siti attivi non sono complementari al substrato come tale, ma allo stato di transizione
che il substrato deve raggiungere per convertirsi in prodotto
Gli enzimi aumentano la velocità
di reazione abbassando l’energia
di attivazione, senza modificare
lo stato energetico finale dei
reagenti e dei prodotti e, quindi,
l’equilibrio della reazione
Specificità di catalisi: specificità di legame “Il sito attivo”
Modello chiave-serratura:
il meccanismo di riconoscimento tra enzima e substrato è di tipo CHIAVESERRATURA;
Specificità di catalisi: specificità di legame “Il sito attivo”
Modello di adattamento indotto:
In virtù dell’elasticità di cui è dotata la catena proteica, l’enzima si
adatta alla forma del substrato, anche attraverso assestamenti
successivi, come si osserva in figura.
Un enzima lega due reagenti
assicurando un corretto
orientamento reciproco e la
loro vicinanza. Li unisce
inoltre più saldamente nello
stato di transizione.
Effetto della temperatura sulla velocità di una reazione
enzimatica
Effetto del pH sulla velocità di una reazione enzimatica
• Ionizzazione del sito attivo
• Denaturazione dell’enzima
• pH ottimale
La teoria di Michaelis-Menten
Le basi della cinetica enzimatica per una semplice reazione enzima-singolo substrato furono
poste dalla teoria di Michaelis e Menten (1913) che prevede che:
•
il substrato si lega con l’enzima in corrispondenza del sito attivo per formare il
complesso enzima-substrato (ES), un composto intermedio poco stabile che molto
rapidamente si scinde per dare il prodotto di reazione e rigenerare l’enzima.
Si tratta di un modello basato su di una cinetica di saturazione poiché i siti attivi
dell’enzima vengono progressivamente tutti occupati dalle molecole di substrato. Il
complesso enzima-substrato è in equilibrio con l’enzima libero ed il substrato.
Equazione di Michaelis-Menten
v0 =
Vmax [S]
Km + [S]
N.B. La velocità di una reazione
è direttamente proporzionale
alla concentrazione dell’enzima
La teoria di Michaelis-Menten
Tale teoria si basa sui seguenti punti:
1) La velocità della reazione dipende sia dalla concentrazione del substrato che da quella
dell’enzima; quando il substrato ha saturato completamente l’enzima presente, formando il
complesso enzima substrato (ES), la velocità raggiunge un valore massimo, e un ulteriore
aumento della concentrazione del substrato non porta ad un aumento della velocità di
reazione
La teoria di Michaelis-Menten
Tale teoria si basa sui seguenti punti:
2) L’enzima E reagisce dapprima con il substrato S, per dare il complesso ES
secondo una reazione reversibile:
K1
E + S ⇌ ES
K-1 in cui:
K1 = costante specifica di velocità della reazione diretta
K2 = costante specifica di velocità della reazione inversa
3) A sua volta il complesso ES si decompone, trasformandosi nei prodotti finali P e
liberando l’enzima nella sua forma primitiva E: si trascura in questo caso la reazione
inversa, che avviene con velocità minima, essendo minima la quantità di prodotto nello
stadio iniziale:
K2
ES → E + P
In cui K2= costante specifica di velocità
Il processo globale consiste quindi di due reazioni consecutive, per la prima delle quali
esiste uno stato di equilibrio:
E + S ⇌ ES →E + P La costante di Michaelis (KM)
La costante di Michaelis-Menten (KM) è un indice di affinità tra l'enzima e
il substrato.
K1
K2
E + S ⇌ ES → E + P K-1
KM =
K-1 + K2
K1
La Costante di Michaelis-Menten è una grandezza caratteristica di ciascun
enzima. Essa indica quantitativamente l'affinità tra un Enzima e il suo Substrato:
più basso sarà il valore di Km e più bassa sarà la concentrazione di substrato che
permette di raggiungere una velocità di reazione pari alla metà della velocità
massima (il che indica un'alta affinità enzima-substrato).
La costante di Michaelis (KM)
kM kM
affinità
kM kM
kM kM
kM
La costante di Michaelis (KM)
Quindi la KM è la concentrazione del substrato alla quale la metà dei siti per il
substrato sono saturati. Quindi KM fornisce una misura della concentrazione
di substrato richiesta affinchè la catalisi abbia luogo.
• Il valore di Km caratterizza l’interazione di un enzima con un dato substrato
• Molti enzimi hanno valori di Km vicini alle concentrazioni
fisiologiche dei loro substrati
PERCHE’????
La dipendenza della velocità dalla concentrazione del substrato e quindi il
controllo che il substrato può esercitare sulla velocità di reazione verrà esercitato
soltanto se la concentrazione del substrato cade in quel range in cui la cinetica si
approssima al I ORDINE
Effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di una
reazione enzimatica
Trasformazione di Lineweaver-Burk
(o dei doppi reciproci)
Vmax ⋅[S]
v0 =
K M + [S]
Y
1 K M + [S]
=
v 0 Vmax ⋅ [S]
1
KM
[S]
=
+
v 0 Vmax ⋅ [S] Vmax ⋅ [S]
1 KM 1
1
=
⋅
+
v 0 Vmax [S] Vmax
X
equazione di una retta: y = ax + b
Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
1
KM 1
1
=
⋅
+
v0 Vmax [S] Vmax
1/v0
1/Vmax
-1/KM
1/[S]
Rappresentazione grafica delle reazioni
enzimatiche
Grafico di Lineweaver-Burk
V0
1/V0
Vmax
Vmax/2
1/Vmax
KM
[S]
-1/KM
1/[S]
Grafico di Lineweaver-Burke (o dei doppi reciproci)
Vmax [S]
v0 =
1
v0
Km + [S]
=
Km + [S]
Vmax [S]
Gli inibitori enzimatici sono tra i più importanti Agenti
Farmaceutici conosciuti (es. ACIDO ACETILSALICILICO inibisce
l’enzima che catalizza la prima reazione della sintesi delle prostaglandine).
Lo studio degli inibitori enzimatici ha fornito importanti informazioni sul
MECCANISMO DI CATALISI ENZIMATICA ed ha aiutato a definire le
singole reazioni di alcune vie metaboliche.
INIBIZIONI ENZIMATICHE
Vi sono due grandi classi di INIBITORI ENZIMATICI:
a. REVERSIBILI
(rapida dissociazione del complesso EI)
b. IRREVERSIBILI (si combinano o distruggono un gruppo
funzionale dell’enzima che è essenziale per la sua attività catalitica,
diminuendo così la quantità assoluta di enzima libero)
Inibizione competitiva (I si lega solo a E)
Un inibitore competitivo diminuisce la velocità di catalisi diminuendo il numero di molecole enzimatiche
disponibili per legare il substrato in quanto competono per lo stesso sito di legame sull’enzima
P
• Diminuisce la vo (vo = k2 [ES])
• La vmax resta inalterata (vmax = k2[Et])
• Aumenta la Km ed il nuovo valore è generalmente
detta Km apparente
Inibitori come farmaci: i sulfamidici
Inibitori enzimatici come agenti terapeutici
Inibitore
Enzima
Applicazione
AZT
Trascrittasi inversa
HIV
Ritonavir, saquinavir
Proteasi HIV
HIV
Sulfonammidi
Diidrofolato sintasi
Infezioni batteriche
Trimetoprim, methotrexate
Diidrofolato reduttasi
Infezioni batteriche
Allopurinolo
Xantina ossidasi
Gotta
Statine
HMG CoA reduttasi
Sintesi colesterolo
Cicloossigenasi
Sintesi prostaglandine
Aspirina
Inibitori come farmaci:
inibitori delle HIV proteasi
• Il virus HIV utilizza aspartato proteasi per scindere poliproteine
• Le proteasi tagliano legami particolari (Phe-Pro; Tyr-Pro)
• occorrono inibitori ad alta specificità
Le statine, agenti anti-iperlipidemici, sono
farmaci che agiscono da inibitori
COMPETITIVI
Inibizione incompetitiva o acompetitiva (I si lega solo a ES)
L’inibitore incompetitivo si lega ad un sito diverso da quello del substrato, presente solo nel complesso ES
vmax
vo
+I
+ 2I
P
Km
[S]
• Diminuisce la vo (vo = k2 [ES])
• Diminuisce la vmax (vmax = k2[Et])
• Diminuisce la Km
INIBIZIONE IRREVERSIBILE
• Gli inibitori irreversibili sono quelli che si combinano o che distruggono un gruppo funzionale
dell’enzima che è essenziale per la sua attività catalitica o che formano un’associazione non
covalente particolarmente stabile.
Es. 1. azione dei gas nervini sull’acetilcolinesterasi
2. inibizione irreversibile della chimotripsina
Diisopropilfluorofosfato
• Sono particolarmente utili per lo studio dei meccanismi delle reazioni enzimatiche
Es. reagenti dei gruppi sulfidrilici: iodoacetamide,
agente alchilante
O
Enz
CH2SH + ICH2 C NH2
iodoacetamide
O
Enz
CH2S CH2 C NH2 + HI
GLI ENZIMI REGOLATORI
modulazione dell’attività
quantità di proteina enzimatica
regolazione
Regolazione dell'attività enzimatica
Controllo a livello di substrato
•
•
Da concentrazione di substrato
Inibizione da prodotto
Interazione con ligandi
•
•
•
Cooperatività di legame
Regolazione allosterica
Associazione-dissociazione
Regolazione a breve termine
Modifica covalente
•
•
•
•
•
Fosforilazione
Acetilazione
Adenilazione
Metilazione
Proteolisi
Induzione
Repressione
Turnover
Regolazione a lungo termine
(variazione della concentrazione dell’enzima)
ENZIMI REGOLATORI
• Gli enzimi regolatori sono capaci di modulare la attività catalitica in
risposta di certi segnali. Nei metabolismi possono lavorare insieme in
modo sequenziale, ma almeno uno determina la velocità complessiva
catalizzando la reazione più lenta (enzima regolatore).
• In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni sequenza è un enzima
regolatore.
Vi sono due classi di enzimi regolatori:
•
Enzimi allosterici che agiscono mediante il legame reversibile di un
metabolita chiamato modulatore
•
Enzimi regolati mediante modificazioni covalenti reversibili
La regolazione dell’attività enzimatica
Un esempio di regolazione allosterica da parte di un effettore
eterotropico negativo: l’inibizione retroattiva di una via metabolica.
Gli enzimi allosterici sono regolati da molecole chiamate effettori (o
modulatori), che si legano in modo non covalente in un sito diverso da quello
attivo.
La regolazione dell’attività enzimatica
Regolazione da
modifica covalente:
fosforilazione e
defosforilazione
ISOENZIMI
Si definiscono isoenzimi (o isozimi) quegli enzimi che catalizzano la stessa
reazione, ma hanno differente sequenza primaria. Molti isoenzimi contengono
subunità diverse in varie combinazioni. Organi (e tessuti) differenti spesso
contengono isoenzimi differenti
Regolazione mediante
COMPARTIMENTAZIONE
- È utile per tenere separati i substrati o i
prodotti di reazioni tra loro in competizione
Proprietà degli enzimi
•
•
•
•
•
•
Siti attivi
Efficienza catalitica
Specificità
Cofattori
Regolazione
Compartimentazione
Meccanismi responsabili di un aumento degli enzimi nel plasma
1) necrosi o danno cellulare indotto da fattori tossici o da ischemia, in cui gli enzimi
normalmente contenuti nel citoplasma fuoriescono dalle cellule per citolisi
2) variazione della quantità di tessuto: aumentato turnover cellulare che si realizza
normalmente durante l'accrescimento, la rigenerazione cellulare o anche in corso di neoplasie
3) alterata sintesi: induzione enzimatica in cui aumenta la sintesi proteica dell'enzima
4) ostruzione dei dotti escretori per cui enzimi normalmente presenti nelle secrezioni esocrine
si riversano nel plasma
5) variazione nella permeabilità cellulare
6) alterazione nella velocità di inattivazione/ degradazione
7) altri fattori che influenzano l’attività (inibitori, carenza di cofattori...)
Dosaggi enzimatici in Biochimica Clinica
• Enzimi plasmatici a scopo diagnostico
• carenze/difetti enzimatici responsabili di alterazioni metaboliche e
patologie correlate
Dosaggi enzimatici
• Valutazioni cinetiche
• Valutazioni cliniche
• Dosaggio di metaboliti
• Valutazioni merceologiche (alimentari)
Gli enzimi nella diagnosi clinica
N.B. Il plasma è la parte fluida non cellulare del sangue. Il siero è
la parte liquida ottenuta centrifugando il sangue dopo averlo
lasciato coagulare.
Localizzazione Enzimatica
Gli enzimi si possono trovare:
• Liberi nelle cellule di diversi tessuti ed organi
• Confinati in particolari strutture all’interno delle cellule stesse
• In un determinato tessuto od organo specifico.
Quando le strutture cellulari vengono danneggiate gli enzimi cellulari si
liberano e si riversano nel circolo sanguigno.
In questo modo, un aumento della loro concentrazione nel campione può
rappresentare un indice abbastanza preciso di un danno cellulare.
Enzimi plasmatici da dosare:
• enzimi attivi nel plasma (fattori della coagulazione)
• enzimi attivi in fluidi extra-cellulari (ad esempio, enzimi
digestivi)
• enzimi del metabolismo cellulare
– ubiquitari
– organo (tessuto)-specifici
