Infezioni emergenti

Le nuove tecniche di laboratorio
per la diagnosi veloce
di patologie infettive emergenti
Giada Rossini
Centro Riferimento Regionale Emergenze Microbiologiche (CRREM)
U.O. Microbiologia
Azienda Ospedaliero-Universitaria S.Orsola-Malpighi, Bologna
Global examples of Emerging and Re-emerging infectious disease
Infezioni emergenti:
Infezioni sostenute da patogeni “nuovi” – non
precedentemente associati a infezioni
nell’uomo (HIV, SARS, MERS)
Infezioni ri-emergenti:
Incremento incidenza e/o estensione verso nuove aree
geografiche (Dengue, Ebola, CHIKV, WNV, ZIKV)
Emerging infectious disease threats during the past decade
SARS CoV
2003
Flu H5N1
2004
Flu H1N1
2009
MERS CoV
2012
Flu H7N9
2013
Ebola
2014
Zika
2016
 Outbreak di Chikungunya e Zika nelle Americhe,
 Epidemia da virus Ebola in Africa occidentale,
 Un'altra possibile pandemia causata da un nuovo virus influenzale
↓
reminder della nostra vulnerabilità agli agenti patogeni virali emergenti.
Nuove tecnologie diagnostiche sono in continua e rapida evoluzione
Marston HD. et al. Sci Transl Med 2014
Progresso tecnologico ha notevolmente rafforzato la nostra
capacità di difenderci dai patogeni
Queste tecnologie costituiscono un armamentario robusto per
affrontare le sfide delle nuove infezioni emergenti
Diagnostics
 clarify the etiology of the patient’s illness,
 influence treatment modalities,
 enable public health surveillance.



Classical diagnostic cycle consisting
steps → >24 h
Molecular microbiology (and mass
have contributed to shortening the
diagnostic procedure → few hours
 (crucial information to orient
regimen)
of several time-consuming
spectrometry technologies)
time required to perform
the patient's therapeutic
Rapid point-of-care (POC) microbiology shall further decrease the
length of the diagnostic cycle in order to accelerate infectious
disease management. → < 1h
Real-time PCR è stata la prima tecnologia biomolecolare che ha
consentito di rilevare e/o identificare patogeni in poche ore
Detection
Nucleic Acid Extraction
(RT)-PCR Amplification
La velocità e la sensibilità hanno reso la PCR reso uno dei metodi di
scelta per rilevamento/identificazione di nuovi patogeni
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
Chikungunya
Dengue
Zika
West Nile
Influenza A/B
CCHF virus
Ebola virus
Malaria
…..
Africa – Epidemia
Ebola
European Mobile Lab ha contribuito alla gestione e
sorveglianza dei pazienti, e ha fornito l'esperienza
necessaria per sostenere la ricerca e lo sviluppo di
nuovi test diagnostici.
La diagnosi rapida dei casi sospetti è stata
fondamentale nel controllo dell’epidemia di
infezione da Ebola
 rapida identificazione dei casi EVD
 avvio più immediato del contact-tracing
 diminuzione del tempo che un caso sospetto trascorre
in un centro di trattamento o altra struttura sanitaria
Ebola-correlata→ diminuisce la probabilità di infezione
da virus Ebola durante l'attesa per il risultato del test
Test Rapidi – Point of Care (POC)
Test immunocromatografici per la rapida individuazione di antigeni microbici
Malaria
Dengue – NS1 AG
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Filariasis
HIV
Influenza A/B
RSV
S. pneumoniae
Legionella
 Group A Streptococcus
TAT: 15-30 min
Corgenix ReEBOV Antigen Rapid Test Kit.
Method:Dipstick immunoassay
Target: Detecting VP40 matrix protein
TAT: 15 to 25 minutes
Sostituzione dei test rapidi antigenici con POC molecolari per l’identificazione di patogeni in tempo reale
 Dispositivi basati su cartucce
 Tempi minimi di lavorazione (1-2 minuti)
 Minime competenze tecniche
 Forniscono risultati in tempi brevi (1-5 h)
 Bassa processività
Fully automated: Extraction, Amplification, Detection
geneXpert Ebola PCR Assay
• TAT: 90 minutes
• Ultrasensitive: 0.13 PFU/mL of Ebola Zaire Virus
• ideal for emergency use
• whole blood (EDTA or finger-stick) or buccal swab specimens
 excellent performance compared to an established RT-PCR benchmark on WB and BS samples
in a field laboratory setting
 Rapid Turnaround time (2,5h vs 4h RT-PCR)
 Can truly be deployed at POC?
 Future studies should evaluate feasibility and performance outside of a biocontainment laboratory
setting
Two-hour detection of MTB and
Rifampin resistance mutation
Detection of Flu A and Flu B with
A/H1 pdm 2009 call out in 75 min
Detect and differentiate the most prevalent
carbapenemase gene families in just 48
minutes.
Test rapido molecolare Illumigene® Malaria
direct detection of Plasmodium spp. DNA in human
venous EDTA whole blood
 Simple sample preparation from whole blood
 TAT: < 60 min
 Very high sensitivity
MULTIPLEX SYNDROMIC
TESTING
 Diverse infezioni (sepsi, inf. respiratorie o inf. gastrointestinali) sono potenzialmente causate da un
ampio spettro di patogeni (virus, batteri, funghi o parassiti)
 La gestione di queste infezioni può essere accelerata da piattaforme di rilevamento multiparametriche,
che possono analizzare un campione per la presenza di diversi microrganismi patogeni invece di
eseguire test multipli che aumenterebbero il costo e il tempo.
 Co-infezioni possono essere più comune di quanto precedentemente rilevato con un approccio
singleton
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•
•
 Few minutes of hands-on-time
 Turnaround time is just about an hour
Integrates:
extraction
amplification
detection
analysis
FilmArray® - Biofire
1 test → more pathogens
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
Respiratory panel (11 viral + 3 bacterial pathogens)
Blood Culture identification panel (24 pathogens + 3 antibiotic resist.)
Gastrointestinal panel (22 pathogens)
Meningitis/Ecephalitis panel (14 pathogens)
Biothreat panel (17 pathogens)
Tecniche Multiplex per diagnosi sierologica
Next-Generation Sequencing
Nuove tecniche di sequenziamento del DNA, denominato sequenziamento "di nuova generazione"
(NGS), producono un enorme volume di sequenze con molte possibili applicazioni nel campo della
ricerca e delle diagnostica
 sequenziamento di genomi virali/batterici completi
 identificazioni di varianti e evoluzione intra-host (HIV e HCV quasispecie)
 monitoraggio mutazioni associate a farmaco -resistenza.
 scoperta di nuovi virus umani
NGS Workflow
→
Clinical sample
→
Nucleic acid
extraction
→
→
cDNA/DNA library
preparation
NGS
Bioinformatic
analysis
→
Alignment against
GenBank
 NGS requires extensive bioinformatics for data interpretation
 Turnaround time: hours – days (versus days – weeks)
Nanopore sequencing for real-time
pathogen identification and surveillance
Sorveglianza genomica è un nuovo strumento per assistere difficili indagini
epidemiologiche
NGS costituisce un passo in avanti nella nostra capacità di svolgere la sorveglianza
genomica durante le epidemie anche in condizioni di risorse limitate
MinION (Oxford Nanopore Technologies)
Possibilità di identificare in tempo reale catene di trasmissione precedentemente
sconosciute.
Es. Integrando in tempo reale dataset di sequenziamneto in Sierra Leone
con dataset in Guinea sono state fornite le prove di frequente trasmissione
infezione EBOV tra i due paesi
Questo può migliorare l'efficienza della allocazione delle risorse e la tempestività
delle indagini epidemiologiche
Conclusioni
Le nuove tecnologie consentono il rilevamento, identificazione e quantificazione di patogeni di
con:
 nuova velocità
 sensibilità
 semplicità di utilizzo.
Necessità di una “nuova” diagnostica che promuova l'assistenza clinica e la sanità pubblica!