I nuovi approcci biomolecolari e l'analisi del
rischio in sicurezza alimentare: quali
problemi e quali prospettive
La genomica funzionale come
approccio innovativo nella definizione
della qualità degli alimenti e nello
studio della risposta a stress
ambientali
Genomica funzionale: la Tecnologia
Microarray
Profili globali di espressione genica
senza limitazione ad un singolo endpoint
Possibilità di analizzare fenomeni
biologici complessi
Approccio funzionale innovativo che
consente di aumentare i campi di
indagine e il numero di informazioni
ottenibili
Microarray: il principio
capacità che ogni acido nucleico a singolo filamento
ha di appaiarsi alla sequenza complementare,
rispettando le regole di base A-T C-G.
L’RNA, estratto dai campioni di interesse, viene
ibridizzato, previa marcatura con opportuni
fluorocromi, alle sequenze rappresentative dei geni
in esame, che possono essere deposte su supporto di
varia natura.
La lettura del microarray si realizza impiegando uno
scanner dotato di laser in grado di eccitare i
fluorocromi e misurarne l’intensità della
fluorescenza, fornendo quindi una analisi della
relativa modulazione genica
Microarray, aspetti della
sperimentazione
Definizione degli obiettivi
sperimentali
Studio del disegno sperimentale
e della dimensione del campione
Familiarita’ con le procedure
sperimentali
Analisi statistica dei dati
Interpretazione biologica dei dati
Nutrigenomica e trascrittomica
Nell’ambito della nutrigenomica, che
include diversi approcci tipo “omics” in
scienze dell’ alimentazione, la
trascrittomica costituisce uno
strumento efficace oggetto di
molteplici studi in costante aumento.
Restrizione calorica
Obesità
Attività di vitamine, minerali e fibre
Effetto di catechine, flavonoidi ed erbe
Kato et al., Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 8:516-522, 2005
Microarray e qualità alimentare
Verifica rischi legati ai
contaminanti
Individuazione proprietà
nutrizionali
Identificazione effetti preventivi
e protettivi per la salute umana.
Microarray e qualità alimentare
Caratteristiche di qualità
Palatabilità
Profumo,
Stagionalità
Potere nutrizionale
Effetti sulla salute dell’alimento consumato.
Caratteristiche di qualità di importanza sanitaria
Sicurezza alimentare
contaminanti naturali o di origine antropica
catena di produzione e distribuzione
Caratteristiche di qualità di importanza economica
Provenienza
Caratterizzazione di alimenti interessanti per la
rappresentatività nell’alimentazione italiana e per i
possibili rischi/benefici sulla salute
Piattaforma Agilent
Un laser SHG-YAG
(532nm) e un laser a Elioneon (633nm), per
eccitare i fluorocromi Cy3
e Cy5.
Carosello a 48 posizioni
Sistema distintivo di
continua messa a fuoco
automatica dei laser sul
piano esatto del campione
durante la scansione
Software di Feature
Extraction
Feature Extractor
Localizzazione di tutti gli spot sull’array (Find Spot
Algorithm), provvedendo poi allo scarto dei pixel outlier
(con intensità troppo alta o troppo bassa rispetto a una
statistica di popolazione dell’intero array).
Segnalate le feature saturate (più del 50% dei suoi pixel
ha un’intensità oltre 65502), non uniformi e con
background (BG) non uniforme che, possono poi essere
eliminate nella successiva filtrazione dei dati.
Normalizzazione, con il metodo LOWESS (locally weighted
linear regression curve fit).
Calcolo della log(ratio) dei segnali nel rosso e nel verde
associando, ad ogni valore, un errore che verrà utilizzato
per calcolare un p-value finale, PVlog(ratio), che testa
l’ipotesi che il valore delle log(ratio) non sia differente da
zero (ipotesi nulla).
Normalizzazione
Rendere confrontabili i campioni etichettati con Cy3 e
Cy5 ed ibridati congiuntamente su un singolo
microarray.
Eliminare errori sistematici dovuti a:
diversa quantità di mRNA associata ad ogni marcatore
diversa efficienza di incorporazione dei due marcatori
diversa intensità di radiazione emessa dai due marcatori
differentemente misurata dal tubo fotomoltiplicatore
differenti intensità misurate in diverse parti del microarray
a causa del posizionamento non perfettamente orizzontale
del microarray rispetto al laser dello scanner
differenze tra gruppi di spot creati da differenti penne
L’algoritmo si basa sull’ipotesi che la mediana del
rapporto delle intensità di tutte le feature sia zero.
Interferenti Endocrini : Tamoxifen
L'antiestrogeno non steroideo tamoxifen
(TAM), utilizzato da una ventina d'anni
nella terapia adiuvante e palliativa del
tumore della mammella.
Effetti collaterali della molecola con
insorgenza di tumori dell'endometrio ed
evidenze sperimentali nell'animale e in
vitro a sostegno di una attività mutagena
e di effetti promoventi esercitati da
questo antiestrogeno.
Studio degli effetti di TAM sulle U87
Glioblastoma-Astrocitoma GRADO III
Studi funzionali:
Test di vitalità
Curva di
proliferazione
Crescita in agar
Test di apoptosi
E-screen
Espressione ER
Studio preliminare
di espressione
genica:
Analisi in
microarray:
NTvsTAM 9µM
(GI50)
NTvsTAM 15µM
(TGI)
Esperimento preliminare microarray
Sono stati utilizzati vetrini Agilent Human 1A Oligo DNA
Microarrays. Ogni array comprende 22.575 oligonucleotidi 60-mer
rappresentativi di 17.803 geni umani appartenenti al Genomics
Foundation Database della Incyte
NTvsTAM 9µM (GI50) -
NTvsTAM 15µM (TGI)
Solo i geni ottenuti dalla Feeature Extraction con un significatività
per la log(ratio) minore di 0,01 sono stati selezionati per la
successiva analisi
GoMiner, un tool di interpretazione biologica dei dati di
microarray, disponibile in rete. Questo programma organizza la
lista di geni modulati nel contesto di Gene Ontology (GO), un
database che contiene una classificazione dei geni in categorie
gerarchiche basate su processo biologico, funzione molecolare e
compartimento cellulare. GoMiner opera confrontando due liste di
geni, e una che riporta i geni significativamente modulati
Classi di geni modulati dal trattamento
con TAM 9µM
Fattore arricchimento
Re = (geni variati in una classe/geni totali nella classe)
**
**
Signal Transducer
Activity
Defence/Immunity
Protein Activity
*
Cell Adhesion
Molecule Activity
*
**
Extracellular
5
4
3
2
1
0
Development
Re
(geni variati nel chip/geni totali nel chip)
Biological process
Cellular component
Molecular Function
Classi di geni modulati dal trattamento
con TAM 15µM
Fattore arricchimento
Re = (geni variati in una classe/geni totali nella classe)
(geni variati nel chip/geni totali nel chip)
5
Re
4
3
2
*
1
*
*
Obsolete
Transporter
Activity
0
Extracellular
Cellular component
Molecular Function
Time-course tamoxifen:disegno
sperimentale
T0
U87
30’
TAM 20µM
2h
Vetrini Agilent Human 1A
(V2) oligo DNA microarray
4h
6h
16 h
24 h
Package Maanova di R
Una tipica analisi di dati che utilizza gli strumenti
disponibili nel package può essere suddivisa in quattro
fasi principali:
I. operazioni di prefiltraggio dei geni: (spot saturati e di
controllo)
II. elaborazione preliminare dei dati grezzi: (operazioni di
trasformazione utili alla normalizzazione interna dei
microarray e quella necessaria a rendere i dati adatti ad un
modello lineare)
III. fit del modello lineare ai dati: nel modello l’effetto
d’interesse è l’interazione tra la varietà (nel nostro caso le
varietà sono sei cioè i tempi di trattamento) e il gene
IV. test statistici: (nel package sono disponibili quattro
diversi test statistici. Questi test differiscono sulla base di
come viene stimata la varianza associabile al livello di
espressione di ciascun gene di una data varietà)
Geni modulati da TAM in cellule U87
Regolazione delle interazioni cellulamatrice
Alterazione delle componenti
citoscheletriche
Controllo del ciclo cellulare: fase
G1/S
Controllo del ciclo cellulare: fase
G2/M
Controllo della trascrizione
Controllo dei sistemi di riparo del DNA
Controllo dell’apoptosi
Considerazioni finali
La maggior parte dei geni differentemente
espressi indotti dal trattamento con tamoxifen,
fino ad ora analizzati, ha interessato elementi
coinvolti in vari pathway biologici fra cui il
controllo del ciclo cellulare (checkpoint in G1/S
e G2/M), la regolazione trascrizionale, il
processo apoptico e le interazioni cellulamatrice
L’alterata espressione genica, valutata
nell’esperimento di time-course, ha individuato
alcuni dei probabili geni candidati biomarkers
che sottendono la risposta
a tamoxifen nel
nostro sistema cellulare di astrocitomaglioblastoma
estratti da matrice
PROGETTO MITICA
Triennale
Multicentrico
Differenti matrici
Contaminanti
PCB
Diossine
Triazoli
Micotossine
Tecnologie
caratterizzazione
chimica
PCB
valutazione
biologica
micotossine
diossine
triazoli
batteri
cellule
caratterizzazione
molecolare
LC/MS
Microarray
Proteomica
genomica funzionale
proteomica
Fonte
PCB
Caratterizzazione
chimica
Suolo
estratto
PROGETTO ARCADE
Biennale
ARPA-ER
Differenti matrici
Contaminanti
PCB
Metalli Pesanti
Diossine
Acqua
LC/MS
Trasformazione
cellulare
Comunicazioni GJ
Microarray
Caratterizzazione
chimica
Test biologici e
molecolari
Crostacei
Tecnologie
estratto
Test biologici e
molecolari
estratto
Caratterizzazione
chimica
Test biologici e
molecolari
PCB
Metalli Pesanti
Biotossine
Caratterizzazione
chimica
Mitili
estratto
Test biologici e
molecolari
Fattori ormonali
potrebbero essere
necessari per mediare gli
effetti antiossidanti del
licopene
ac. clorogenico
eugenolo
falcarindiolo
naringenina
falcarinolo
ac. gentisico
24-metilene
cicloartenolo
quercetina
ac. p-cumarico
kempferolo
vaniglina
rutina
lanosterolo
Licopene
FATTORI AMBIENTALI
Principi
Attivi
Genomica&Qualità
Principi
Attivi
ARPA ER
AUSL BO
TEST
BIOLOGICI
TEST
BIOLOGICI
GENOMICA
FUNZIONALE
GENOMICA
FUNZIONALE
VALUTAZIONE RISCHIO-BENEFICIO
