Università di Pisa
Facoltà di Medicina e Chirurgia
Dip.to Morfologia Umana e Biologia Applicata
Anatomia del corpo umano di Juan Valverde de Amusco, Roma 1559
COSA S’INTENDE PER RICERCA DI BASE?
LA RICERCA DI BASE:
IMPIEGA MODELLI SPERIMENTALI IN VIVO E/O IN VITRO
ANALIZZA I FINI MECCANISMI CON CUI SI REALIZZANO
DETERMINATI FENOMENI BIOLOGICI
INDAGA SULLA CAPACITA’ DI VARI AGENTI CHIMICO-FISICI
DI MODULARE (CONTRASTARE O FAVORIRE) UN DETERMINATO
PROCESSO BIOLOGICO
VIA!
QUESITO SPERIMENTALE
PROGETTO
DI
RICERCA
QUESITO SPERIMENTALE (1):
QUESITO SPERIMENTALE (2):
Il trattamento X può essere
efficace nella cura di un
determinato disturbo
muscolare?
Con quale meccanismo il
trattamento X consente il
recovery?
PROGETTO DI RICERCA
IPOTESI SPERIMENTALE
-Chiaramente formulata
-Verificabile
-Risponde direttamente al quesito iniziale
PROCEDURA SPERIMENTALE
TESI SPERIMENTALE
-Scaturisce dai risultati sperimentali
-Implica (con vario grado di forza) la verità/falsità dell’ipotesi
Il trattamento X può essere efficace nella cura di
un dato disturbo muscolare?
IPOTESI
SPERIMENTALE
IPOTESI
SPERIMENTALE
-Chiaramente formulata
Il trattamento X è efficace nella cura dell’atrofia
-Verificabile
di un muscolo
-Risponde direttamente al quesito iniziale
MODELLO
PROCEDURA
SPERIMENTALE
SPERIMENTALE
TESI SPERIMENTALE
TESI
SPERIMENTALE
Dati relativi
alla tonicità
e allo sviluppo di forza
-Scaturisce
dai risultati
sperimentali
da parte
del muscolo
inizialmente
atrofico
-Implica (con vario grado di forza) la verità/falsità dell’ipotesi
MODELLO SPERIMENTALE
ATROFIA DEL MUSCOLO TIBIALE ANTERIORE
IN SEGUITO A LESIONE DEL NERVO PERONEALE
COMUNE DEL NERVO ISCHIATICO
NEL RATTO
Il nervo ischiatico (o sciatico) è un nervo misto che
origina dal plesso sacrale (L4, L5, S1, S2, S3). È il
nervo più voluminoso del plesso ed è considerato il
suo ramo terminale.
La componente muscolare innerva i muscoli della
loggia posteriore della coscia, parte del grande
adduttore e tutti i muscoli della gamba e del piede.
[La componente sensitiva innerva la cute posteriore e anterolaterale della
gamba e quasi tutta la cute del piede (a eccezione della parte dorsomediale)].
Prof. Ruffoli
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. Creazione di un modello sperimentale che possa “mimare” l’atrofia
muscolare in seguito a prolungata inattività
2. Rilevazione di parametri funzionali relativi alla condizione atrofica –
dati basali (pre-trattamento)
3. Inizio dei trattamenti terapeutici
4. Rilevazione di parametri funzionali relativi al potenziale recovery
dalla condizione atrofica – follow up in corso di trattamento
5. Valutazione finale:
-confronto tra i dati basali e i dati a fine trattamento di uno stesso
soggetto;
-confronto tra i dati di recovery relativi ai vari trattamenti eseguiti
1. Creazione di un modello sperimentale che possa “mimare”
l’atrofia muscolare in seguito a prolungata inattività
Stabulazione degli animali*
Acquisto di animali della stessa specie, ceppo ed età
Sistemazione nelle gabbie
Alimentazione e idratazione adeguate (ad libitum)
Controllo delle condizioni ambientali (ciclo luce/buio, temperatura)
*in accordo all’European Council Directive (86/609/EEC) per l’uso e la gestione degli
animali da laboratorio.
Creazione dei gruppi sperimentali
I gruppi sperimentali dovranno essere:
-omogenei
-ugualmente numerosi
-sufficientemente numerosi
GRUPPI SPERIMENTALI
• CONTROLLO
• SHAM-OPERATED
• LESIONE
• LESIONE E TRATTAMENTO
Lesione+Trattamento A
Lesione+Trattamento B
Lesione+Trattamento C
• TRATTAMENTO
Trattamento A
Trattamento B
Trattamento C
A
A. Lesione chirurgica (legamento e
sutura) del nervo peroneale comune
del nervo ischiatico
B
B. Sviluppo dell’atrofia a livello
del muscolo denervato
SCHEMA DEL PROTOCOLLO SPERIMENTALE
SVILUPPO DELL’ATROFIA
MUSCOLARE
Tempo (giorni)
-42
LESIONE CHIRURGICA
DEL NERVO PERONEALE COM.
0
INIZIO TRATTAMENTI
28
42
56
I FOLLOW UP
II FOLLOW UP
III FOLLOW UP
2. Rilevazione di parametri funzionali relativi alla condizione
atrofica – dati basali (pre-trattamento)
Valutazioni comportamentali
a) Test motori
Rotarod
2. Rilevazione di parametri funzionali relativi alla condizione
atrofica – dati basali (pre-trattamento)
Valutazioni comportamentali
a) Test motori
Open field
2. Rilevazione di parametri funzionali relativi alla condizione
atrofica – dati basali (pre-trattamento)
Valutazioni comportamentali
a) Test motori
Stride lenght
b) Valutazioni della forza muscolare
PaGE test
Tilting test
3. Inizio dei trattamenti terapeutici
Trattamento A
Applicazione di farmaci topici (crema X)
0
28
56
42
Tempo (giorni)
• Una applicazione giornaliera per 28/42/56 giorni
• L’animale viene lasciato libero di muoversi all’interno della propria gabbia
Trattamento B
Trattamento riabilitativo (esercizio fisico mirato)
0
28
56
42
Tempo (giorni)
• Sedute giornaliere di rotarod (6 min x 3 a distanza di 15 min) e di
flesso-estensione passiva dell’arto atrofico per 28/42/56 giorni
• L’animale viene lasciato libero di muoversi all’interno della propria
gabbia
Trattamento C
Applicazione di farmaci topici (crema X)
+
Trattamento riabilitativo (esercizio fisico mirato)
0
28
42
56
Tempo (giorni)
+
• Ogni giorno, applicazione della crema X seguita da sedute di rotarod (6 min
x 3 a distanza di 15 min) e di flesso-estensione passiva dell’arto atrofico, per
28/42/56 giorni
• L’animale viene lasciato libero di muoversi all’interno della propria gabbia
4. Rilevazione di parametri funzionali relativi al potenziale recovery
dalla condizione atrofica – follow up in corso di trattamento
Valutazioni comportamentali
a) Test motori
b) Valutazioni della forza muscolare
0
7
14
21
28
35
42
49
56
Tempo (giorni)
Le valutazioni comportamentali vengono eseguite
settimanalmente per evitare bias dovuti all’abitudine
5. Valutazione finale
Rotarod
Gr A ratto 1
Open field
Gr D ratto 2
Rotarod
Gr B ratto 1
PaGE test
Gr C ratto1
Open field
Gr A ratto 1
PaGE test
Gr A ratto 1
Stride lenght
Gr C ratto 2
Rotarod
Gr A ratto 2
Rotarod
Gr C ratto 1
Open field
Gr B ratto 1
Stride lenght
Gr C ratto 1
Rotarod
Gr D ratto 1
Rotarod
Gr C ratto 2
Open field
Gr A ratto 2
PaGE test
Gr A ratto 2
Stride lenght
Gr B ratto 2
PaGE test
Gr C ratto 2
Rotarod
Gr B ratto 2
Open field
Gr B ratto 2
Stride lenght
Gr B ratto 1
Rotarod
Gr D ratto 2
Open field
Gr D ratto 1
Tabella per inserimento dei dati sperimentali
ESPERIMENTO_____________________________________ INIZIO_______________
GIORNO____________
CONTROLLO
ROTAROD
OPEN
FIELD
STRIDE
LENGHT
PaGE
TEST
TILTING
TEST
SHAM
OPERATED
LESIONE
LESIONE
+
TRATT. A
LESIONE
+
TRATT. B
LESIONE
+
TRATT. C
TRATT. A
TRATT. B
TRATT. C
Analisi statistica
L’impiego di un adeguato test statistico adeguato è
fondamentale per confrontare i dati e valutare
l’efficacia di un determinato trattamento
La scelta del limite di confidenza (p<0,05, p<0,01,
p<0,001) ci dice qual è la probabilità che le differenze
tra i gruppi siano dovute al caso
Presentazione dei dati
GIORNO 28
Open field
(# quadrati attraversati/2 min)
75
50
#
#
25
*
*
0
CONTROLLO
SHAM
OPERATED
LESIONE
*p<0,05 vs controllo
#p<0,05 vs controllo e lesione
LESIONE
+
TRATT. A
LESIONE
+
TRATT. B
LESIONE
+
TRATT. C
TRATT. A
TRATT. B
TRATT. C
Presentazione dei dati
GIORNO 42
Open field
(# quadrati attraversati/2 min)
75
50
#
#
#
25
*
0
CONTROLLO
SHAM
OPERATED
LESIONE
*p<0,05 vs controllo
#p<0,05 vs controllo e lesione
LESIONE
+
TRATT. A
LESIONE
+
TRATT. B
LESIONE
+
TRATT. C
TRATT. A
TRATT. B
TRATT. C
Presentazione dei dati
GIORNO 56
Open field
(# quadrati attraversati/2 min)
75
§
50
#
#
25
*
0
CONTROLLO
SHAM
OPERATED
LESIONE
*p<0,05 vs controllo
#p<0,05 vs controllo e lesione
§p<0,05 vs lesione
LESIONE
+
TRATT. A
LESIONE
+
TRATT. B
LESIONE
+
TRATT. C
TRATT. A
TRATT. B
TRATT. C
CONCLUSIONI
1. L’atrofia muscolare secondaria a denervazione produce un deficit
funzionale rilevabile a 42 giorni dalla lesione
2. Il singolo trattamento, farmacologico o fisioterapico, produce
un miglioramento nelle prestazioni muscolari, rilevabile dopo
28 giorni (tratt. farmacologico) o 42 giorni (tratt.
fisioterapico)
3. Il trattamento combinato (farmacologico + fisioterapico) produce
un effetto sinergico che porta al ripristino della
funzione muscolare a livelli comparabili alla condizione
di controllo
Con quale meccanismo il trattamento X
consente il recovery?
IP: Ripristino delle caratteristiche morfo-funzionali
del muscolo atrofico
ANALISI MORFOLOGICA
E IMMUNOISTOCHIMICA
TS: L’organizzazione morfologica e l’espressione antigenica
suggeriscono un recupero delle fisiologiche proprietà da parte
del tessuto muscolare inizialmente atrofico
EFFETTO DEI TRATTAMENTI
ANALISI DELLE
CONDIZIONI BASALI
INIZIO TRATTAMENTI
SACRIFICIO
SVILUPPO DELL’ATROFIA
MUSCOLARE
Tempo (giorni)
-42
LESIONE CHIRURGICA
DEL NERVO PERONEALE COM.
ANALISI DELL’ATROFIA
0
28
42
56
SACRIFICIO
SACRIFICIO
SACRIFICIO
SACRIFICIO
ANALISI DELL’ATROFIA
ANALISI DELL’ATROFIA
ANALISI DELL’ATROFIA
MICROSCOPIA OTTICA
• Anestesia e perfusione degli animali con soluzione salina e fissativo
(paraformaldeide 4% in PBS)
• Prelievo del muscolo tibiale anteriore
• Immersione in fissativo (paraformaldeide 4%) overnight
• Disidratazione
• Inclusione in paraffina
• Taglio al microtomo
• Colorazione istochimica: H&E, metodo tricromico di Mallory
• Osservazione al microscopio ottico
• Colorazione immunoistochimica per marker muscolari (desmina, creatina)
• Osservazione al microscopio ottico
MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONE
• Anestesia e perfusione degli animali con soluzione salina e fissativo
(paraformaldeide 2%+glutaraldeide 2% in TP 0,1M)
• Prelievo del muscolo tibiale anteriore
• Immersione in fissativo (glutaraldeide 3%) per 2 ore
• Post-fissazione in OsO4
• Disidratazione
• Inclusione in resina epossidica
• Taglio all’ultramicrotomo
• Contrastazione con citrato di piombo e acetato di uranile
• Osservazione al microscopio elettronico a trasmissione
• Colorazione immunocitochimica per marker muscolari (desmina, creatina)
• Osservazione al microscopio elettronico a trasmissione
La creatina è indispensabile per il ciclo
energetico ATP-ADP: viene convertita
nell'organismo in creatina fosfato.
La creatina fosfato "carica" l'ADP
cedendogli il gruppo di fosfato e
trasformandolo in ATP, una molecola
con elevatissimo contenuto energetico.
H&E
A) Nel tessuto muscolare normale le
fibre muscolari presentano diametri
piuttosto omogenei.
A
2 μm
*
B) Al contrario, nel tessuto muscolare
atrofico si assiste a una maggiore
eterogeneità nel diametro delle fibre, con
molte fibre atrofiche (*) alternate a fibre di
aumentato calibro ( ).
*
*
B
2 μm
DESMINA
(A) L’immunistochimica per la
desmina
dimostra
una
immunopositività
omogeneamente
diffusa
all’interno
delle
fibre
muscolari di un muscolo di
controllo.
A
4 μm
(B) In un muscolo atrofico, le
fibre presentano invece un
core
di
elevata
immunopositività per la
desmina.
B
4 μm
MICROSCOPIA ELETTRONICA
A) Le fibre muscolari di un muscolo in
condizioni di controllo si presentano
regolarmente allineate, con una normale
organizzazione delle fibrille contrattili,
visualizzate
attraverso
la
classica
disposizione delle bande A e I e delle linee
Z e H. Le riserve lipidiche (L) sono scarse.
Banda
A
Linea
Z
Linea
H
Banda
I
1 μm
B) Nel muscolo atrofico, una ridotta
produzione di proteine provoca una
crescita irregolare delle singole fibre
muscolari, visualizzata come disposizione
asimmetrica delle fibre stesse. Si ha inoltre
un aumento delle riserve lipidiche (L) che
suggerisce un alterato consumo delle
riserve energetiche da parte delle fibre
atrofiche.
1 μm
A) In sezione trasversale, le fibre muscolari
presentano un sarcoplasma uniformemente
elettrondenso, con sparsi mitocondri.
1 μm
B) Nel muscolo atrofico le fibre contengono
numerosi corpi citoplasmatici caratterizzati da
filamenti intermedi con disposizione radiale.
1 μm
….. E DOPO TRATTAMENTO ?
CONCLUSIONI
1. Il tessuto muscolare atrofico presenta
morfologiche e immunoistochimiche
evidenti
alterazioni
2. Le fibre muscolari atrofiche mostrano diametri disomogenei, con una
prevalenza di fibre di diametro inferiore rispetto al valore di controllo
3. L’immunoistochimica per la desmina, componente principale dei
filamenti intermedi, mostra la tendenza a formare aggregati di
immunopositività all’interno delle fibre muscolari atrofiche
4. All’analisi ultrastrutturale nelle fibre di un muscolo atrofico si
descrivono:
- un marcato disarrangiamento delle fibrille contrattili
- un maggior accumulo di riserve lipidiche
- formazioni elettrondense di aspetto fibrillare
5. Il trattamento ……….
…ARRIVEDERCI E GRAZIE!
RINGRAZIAMENTI
Dott.ssa Fulceri
Dott. Toti
