ANALISI MOLECOLARE DEL GENOMA

ANALISI MOLECOLARE DEL GENOMA
Come sono disposti i geni nel genoma?
MAPPA GENETICA:
GENETICA
un set ordinato di geni sul cromosoma, la
distanza tra i quali è espressa in unità di
ricombinazione genetica (centimorgan)
MAPPA FISICA:
FISICA
un set ordinato di frammenti di DNA sul
cromosoma, la distanza tra i quali è
espressa in unità fisiche (paia di basi).
Costruzione di una mappa genetica
analisi delle frequenze di ricombinazione
Le tecniche che utilizziamo per costruire una mappa
genetica umana si basano tutte sull’associazione
genetica:
genetica
mappe genetiche = mappe di associazione
Uso di marcatori molecolari.
Locus genico
marcatore
MARCATORE GENETICO
Qualsiasi carattere polimorfico mendeliano (presenti in due
forme alleliche) che può essere impiegato per seguire
l’ereditarietà di un segmento cromosomico attraverso un albero
genealogico
NB:
I geni sono marcatori utili ma non sono i marcatori ideali:
- solo una frazione dei geni è presente con due forme alleliche distinguibili
in modo semplice (fenotipi)
- i geni sono spaziati da vaste interruzioni
Es. di marcatori molecolari sono RFLP,
RFLP STR,
STR VNTR,
VNTR SNP
POLIMORFISMO
I polimorfismi genetici sono variazioni nelle sequenze di DNA presenti in
una popolazione con una frequenza maggiore dell’1%. Quando la
frequenza e' inferiore a tale valore arbitrario, si preferisce parlare di
varianti genetiche rare, che in molti loci sono presenti in aggiunta ai
polimorfismi.
Quando l’allele più comune in tutta la popolazione rappresenta:
• meno del 99% POLIMORFISMO
• più del 99% MUTAZIONE
Polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione
(RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism)
Polimorfismi di lunghezza di sequenze semplici
(SSLP, Simple Sequence Length Polymorphism)
Polimorfismi di singoli nucleotidi
(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)
SNP
Polimorfismi di singoli nucleotidi
•
•
•
•
Singole mutazioni puntiformi presenti in gran numero nel genoma.
Solo alcune producono RFLP
Nel genoma umano sono stati identificati oltre 10 milioni di SNP
Ogni SNP ha solo 2 alleli proprio perché originato da mutazione puntiforme
Vantaggi degli SNP come marcatori: sono abbondanti e possono essere
individuati con tecniche che non utilizzano elettroforesi
Analisi di singoli SNP mediante ibridazione con oligonucleotidi
allele-specifici (ASO)
Ibridazione di un oligonucleotide:
oligonucleotide:
Tm = (4 x GC) + (2 x AT)
NB: affinchè una variazione nella sequenza nucleotidica
sia considerata uno SNP, deve essere presente in
almeno l’1% della popolazione!
SNP: modificazione di siti di restrizione RFLP
RFLP:
Polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione
Sono stati i primi marcatori molecolari ad essere studiati
1) Presenza o assenza di un sito di restrizione in due sequenze alleliche
(causata da SNP)
A1
- 105 RFLP nel genoma umano
- ovviamente solo 2 alleli per RFLP (c’è o non c’è il sito)
A2
2) Generazione di frammenti di diversa lunghezza (dovuta a presenza di
sequenze ripetute, inserzioni o delezioni)
A1
A2
Tecniche per identificare RFLP:
1) Southern Blotting
2) PCR + digestione con
enzima di restrizione
1) Southern Blotting
A1
sonda
A2
Primer 2
2) PCR
Primer 1
Primer 2
A1
Primer 1
A2
Primer 2
NB: la posizione di un RFLP sulla mappa genomica è dedotta
seguendo l’ereditarietà dei suoi alleli, come per i geni.
A1
A1
A2
A2
A1A1 A2A2 A1A2
A1A2
A1A2
A2A2
A1A2
A1A1
SSLP:
Polimorfismi di lunghezza di sequenze semplici
Sequenze ripetute che contengono quantità diverse di unità ripetitive
nei differenti alleli e quindi mostrano lunghezze diverse
Possono essere multiallelici (per ogni SSLP più di due varianti alleliche)
Ci sono due tipi di SSLP:
-i mini-satelliti=
satelliti ripetizioni a tandem a numero variabile (VNTR)
VNTR
Le unità ripetitive sono lunghe 15-100 nucleotidi e coprono sequenze
di 1-5 kb
-i micro-satelliti=
satelliti ripetizioni a tandem semplici (STR)
STR
Le unità ripetitive sono di di- o tetra-nucleotidi
STR (Short Tandem repeats)
regioni ipervariabili del DNA costituite da sequenze
di 2-6 nucleotidi ripetute in tandem
2 varianti alleliche
Nel genoma umano:
128000 STR dinucleotidici
8740 STR trinucleotidici
23680 STR tetranucleotidici
4300 STR pentanucleotidici
230 STR esanucleotidici
Sequenze relativamente corte rilevabili per PCR
VNTR (Variable Number Tandem Repeats)
Sequenze anche molto lunghe rilevabili per Southern Blot:
- sonde a locus singolo (un solo locus VNTR nel genoma)
- sonde multiloci (molte copie di un locus VNTR disperse nel genoma)
Un taglio nei siti di restrizione fiancheggianti la ripetizione produce
un unico frammento, di lunghezza specifica per ogni allele
Uso di un VNTR come marcatore del DNA
“eterozigote”
“omozigote”
Southern Blotting
Confronta!
Multi-loci
Singolo locus
Da frammenti di restrizione o da amplificato per PCR
I polimorfismi sono allelici e vengono ereditati in modo mendeliano
6 alleli (A1A6) sono presenti in questo albero genealogico, ma ogni individuo può avere un solo
tipo di allele (se omozigote) o due (se eterozigote).
RFLP associati a malattie genetiche:
- all’interno del gene alterazione del sito per DdeI nel gene per
la β-globina (anemia falciforme)
falciforme
- in sequenze fiancheggianti alterazione del sito HpaI nel gene
per la fenilalanina idrossilasi (fenilchetonuria)*
fenilchetonuria
- DNA ripetuto (triplette) all’interno del gene (Corea di Huntington)
Huntington
o in sequenze regolative (sindrome dell’X-fragile)
fragile
* Il polimorfismo RFLP al 3’ del gene segrega con il gene stesso (tranne nel caso di
ricombinazione o mutazione de novo)
Confronta e rifletti…
A1
gene
A1
gene
A2
gene
A2
gene
Es. Anemia falciforme
A1
A2
gene
gene
A1
gene
gene
A2
Es. Corea di Huntigton
Costruzione di una mappa genetica
utilizzando i marcatori molecolari
Uso dei polimorfismi di restrizione (RFLP)
per determinare le associazioni
RFLP A, B, C (aplotipi)
Es. associazione RFLP e Corea di Huntington
Es. Corea di Huntington, autosomica dominante ipotetici pedigree
RFLP A, B, C (aplotipi)
H allele mutato dominante
h allele normale recessivo
(a) Il gene responsabile della malattia e gli alleli RFLP non sono strettamente associati
(b) Il gene responsabile della malattia e gli alleli RFLP sono strettamente associati (il figlio che
eredita l’allele RFLP C, è malato)
DNA tagliato con HindIII, sonda utilizzata specifica per il chr.8 il gene H mappa sul chr.8
Uso dei polimorfismi del DNA per l’analisi genetica:
Posizionamento geni-malattia
Test molecolari per mutazioni associate a malattie genetiche
(es. Corea di Huntington e anemia falciforme)
Tipizzazione del DNA DNA fingerprinting
Tipizzazione
Tipizzazione del
del DNA
DNA
(DNA
)
(DNAfingerprinting
fingerprinting)
In passato, i sistemi più utilizzati in ambito forense sono stati:
i polimorfismi degli antigeni eritrocitari dei sistemi AB0, MN, Rh, Duffy, etc
i polimorfismi degli antigeni leucocitari del sistema HLA
altri
Oggi:
SNP
STR
VNTR
RFLP
polimorfismi del cromosoma Y
polimorfismi del DNA mitocondriale
STR (microsatelliti): analisi di un singolo locus
E’ stato stimato che l’analisi di 13 loci STR sono sufficienti ad identificare
univocamente una persona su tutta la popolazione mondiale
VNTR (minisatelliti): analisi di un singolo locus o multi-loci
Polimorfismi sul cromosoma Y utili per le esclusioni di paternità
(trasmissione patrilineare e assenza di ricombinazione) e per
distinguere numero di soggetti maschili coinvolti in un crimine
Polimorfismi del DNA mitocondriale utili per individuazione di
parentele (trasmissione matrilineare ma alta eterogeneità)
Per attribuzione di paternità………….
Mediante Southern Blotting….
Interpretazione di
“inclusione”
inclusione”!
Sonda
SondaSTR
STRooVNTR
VNTR
Per la prova di paternità occorre:
- usare altre sonde polimorfiche (almeno 5 diverse e combinate)
- analizzare la frequenza di quel polimorfismi nello specifico gruppo etnico
M B
Un caso di attribuzione di
paternità
Sonda multi-loci
P1 P2
Se il profilo genetico del figlio e del padre presunto differiscono per
due o più caratteristiche genetiche l'esclusione è certa (0% di
probabilità di essere il padre biologico).
Nel caso di un’attibuzione di paternità viene effettuata un’analisi
statistica dei risultati (percentuale di attribuzione tanto più prossima
al 100% quanto maggiore sarà il numero di regioni del DNA
analizzate)
NB: L'esame di 15 regioni STR generalmente consente di raggiungere
una percentuale di attribuzione (probabilità di paternità) superiore
al 99,99%*. Questo valore probabilistico indica che il padre
presunto è praticamente il padre biologico.
*La probabilità finale di paternità non potrà mai raggiungere il valore del 100%
matematico, dato che i microsatelliti hanno una frequenza relativamente elevata di
mutazioni (in media ogni 1000-10.000 meiosi).
In medicina forense identificazione
del colpevole di un crimine
Il caso in cui il DNA scagiona un
innocente
Charles Chatman - accusato di reato
sessuale nel 1981; il test del DNA
ha rivelato la sua innocenza dopo 27
anni di carcere.
campione
vittima
Mediante Southern Blotting…
sospetti
1 2 3
…e mediante PCR.