Scenario 3. Emofilia A (HEMA) #OMIM 306700 Sei anni

Scenario 3. Emofilia A (HEMA)
#OMIM 306700
Sei anni fa ha richiesto consulenza genetica una giovane coppia proveniente da un piccolo centro dell’appennino
marchigiano. All’anamnesi sono stati raccolti i seguenti dati: la donna aveva un fratello emofilico, morto a 8 anni in
seguito ad una emorragia intestinale. I suoi genitori non hanno l’emofilia. Il marito è sano. Il loro primo figlio è un
maschio affetto da emofilia A, mentre le successive figlie femmine sono sane. La domanda della coppia riguardava il
rischio di avere altri figli emofilici. La risposta era stata che ogni figlio maschio aveva 50% di probabilità di essere
emofilico e che era quindi consigliabile, in caso di una successiva gravidanza in cui fosse accertato il sesso maschile del
feto, eseguire l’analisi del DNA fetale per fare diagnosi prenatale di malattia.
La coppia è ora in attesa di un figlio che ecograficamente è risultato maschio. La donna vuole sottoporsi ad
amniocentesi. Si rimette in contatto con il centro di Milano che é tecnologicamente in grado di eseguire una analisi del
DNA per identificare RFLP associati alla malattia.
Sono disponibili i DNA della donna che richiede l’analisi e che è in attesa del quarto figlio, di sua madre (la nonna), di
due suoi fratelli e di una sua sorella (gli zii); sono disponibili anche i DNA dei tre bambini della signora: il maschio
emofilico e due figlie femmine.
L’emofilia A è una patologia causata da una mutazione del gene del fattore di VIII di coagulazione. E’ una mutazione
recessiva X-linked. Essendo l’emofilia A una patologia estremamente eterogenea (il catalogo OMIM riporta 270
varianti alleliche principali), per identificare quale è la mutazione responsabile della malattia in ogni singolo caso è
necessario effettuare delle analisi del DNA estremamente complesse e laboriose che richiedono laboratori attrezzati.
Una via più semplice e tecnicamente meno impegnativa è quella di fare una diagnosi indiretta di malattia utilizzando
un marcatore RFLP associato all’allele malattia. Sono stati identificati alcuni RFLP associati al gene che codifica il
fattore VIII. Per avere dei risultati significativi è necessario analizzare il DNA di molti individui all’interno della
famiglia per identificare quale RFLP utilizzare e quale allele del RFLP scelto è associato all’allele malattia all’interno
di quella famiglia.
Costruite il pedigree di questa famiglia.
Nella famiglia è risultato significativo il RFLP legato a un sito di restrizione Hind III all’interno dell’introne 19 del
gene. Questa mutazione è una piccola delezione (del AGAG) che crea un sito Hind III nell’introne
Pr fw
5'A/A G C T T 3'
3'T T C G A/A 5'
HindIII
Introne 19
Pr rev
717 bp (-)
Nella famiglia l’allele malattia è associato all’allele (-)
del RFLP (= assenza della delezione e quindi del sito).
Quindi l’allele (-) sarà identificato dalla presenza di 1
banda e l’allele (+) sarà identificato dalla presenza di 2
bande.
167 + 550 bp (+)
(+)(+)(+
Amplificando con la PCR un segmento di DNA di 717 bp che comprende il sito HindIII (posizionato 167 bp
dall’estremità 5’), e digerendo il prodotto della PCR con l’ER HindIII, quale è il numero e la lunghezza (in bp) delle
bande che vi aspettate di trovare nel DNA dei soggetti malati della famiglia, dei soggetti portatori, dei soggetti sani?