30-Modalita_di_Azione_Antivirale_dell_Argento_Colloidale

Modalità di azione antivirale di nanoparticelle
d'argento contro l'HIV-1
Humberto H Lara Nilda V Ayala-Nuñez, Liliana Ixtepan-Turrent e Cristina
Rodriguez-Padilla
Corresponding author: Humberto H Lara dr.lara.v @ gmail.com
Autore Affiliazioni
Laboratorio de Inmunología y Virologia, Departamento de Microbiologia e
Inmunología, Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Autonoma de Nuevo Leon,
San Nicolas de los Garza, Messico
Per tutte le email autore, si prega di effettuare l'accesso .
Journal of Nanobiotecnologie 2010, 8: 1 DOI: 10.1186/1477-3155-8-1
La versione elettronica di questo articolo è quello completo e si possono trovare online
all'indirizzo: http://www.jnanobiotechnology.com/content/8/1/1
Ricevuto:
Accettato:
Pubblicato
il:
21 luglio 2009
20 gennaio
2010
20 gennaio
2010
© 2010 Lara et al; licenziatario BioMed Central Ltd.
Questo è un articolo Open Access distribuito secondo i termini della Licenza Creative
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Astratto
Sfondo
Nanoparticelle di argento hanno dimostrato di esercitare attività antivirale contro HIV1 a concentrazioni non citotossiche, ma il meccanismo alla base della loro HIVinibitrice non è stato non completamente chiarito. In questo studio, nanoparticelle
d'argento sono valutati per chiarire la loro modalità di azione antivirale contro HIV-1
utilizzando un pannello di diversi saggi in vitro.
Risultati
I nostri dati suggeriscono che le nanoparticelle d'argento esercitano attività anti-HIV
in una fase iniziale della replicazione virale, probabilmente come agente virucida o
come inibitore di ingresso del virus. Nanoparticelle d'argento si legano a gp120 in un
modo che impedisce il legame CD4-dipendente virione, fusione, e l'infettività, in
qualità di un efficace agente virucida contro virus cell-free (ceppi di laboratorio, isolati
clinici, T e M ceppi tropicali, e ceppi resistenti) e cell-associated virus. Inoltre, le
nanoparticelle di argento inibiscono post-entry fasi del ciclo di vita di HIV-1.
Conclusioni
Queste caratteristiche li rendono un agente ad ampio spettro non incline ad indurre
resistenza che potrebbe essere utilizzato preventivamente contro un'ampia varietà di
circolazione ceppi HIV-1.
Sfondo
Secondo il Programma congiunto delle Nazioni Unite sull'HIV / AIDS, si stima che 33
milioni di persone vivevano con l'HIV nel 2007, 2.7 milioni in meno rispetto al 2001 [
1 ]. Sebbene il tasso di nuove infezioni da HIV è diminuita in molti paesi, l'HIV / AIDS
rappresenta ancora un grave problema di salute pubblica in tutto il mondo. L'emergere
di ceppi resistenti è una delle sfide principali per contenere la diffusione del virus e il
suo impatto sulla salute umana. In diversi paesi, gli studi hanno dimostrato che il 5%
-78% dei pazienti trattati in terapia antiretrovirale sono infettati con HIV-1 virus che
sono resistenti ad almeno uno dei farmaci disponibili [ 2 ]. Per questi motivi, vi è una
necessità di nuovi agenti anti-HIV che funzionano in fasi diverse retrotrascrizione virali
o attività di proteasi e che può essere utilizzato per il trattamento e la prevenzione di
HIV / AIDS diffusione [ 3 ].
Inibitori della fusione o di entrata sono considerati un'opzione attraente, dal momento
che ad ostacolare l'entrata HIV nella sua cellula bersaglio porta alla soppressione di
infettività virale, la replica e la citotossicità indotta dalla interazione virus-cellula [ 4 ].
Dal 2005, solo due inibitori della fusione sono stati approvati dalla FDA (Enfurtivide e
Maravirovic).
Oltre a inibitori della fusione, agenti virucidi sono urgentemente necessari per l'HIV /
AIDS perché direttamente inattivare la particella virale (virione), che impedisce il
completamento del ciclo di replicazione virale. Agenti virucida differiscono da farmaci
virustatica in quanto agiscono direttamente e rapidamente da lisi delle membrane
virali a contatto o legandosi a proteine di rivestimento del virus [ 5 ]. Questi composti
si interagisce direttamente con virioni di HIV-1 per inattivare l'infettività o prevenire
l'infezione e potrebbe essere usato come un approccio per fornire una difesa contro la
trasmissione sessuale del virus [ 6 ].
In precedenza, abbiamo esplorato le proprietà antivirali di nanoparticelle d'argento
contro l'HIV-1 e trovato attraverso saggi in vitro che sono attivi contro un laboratorioadattato ceppo HIV-1 a concentrazioni non citotossiche. Le immagini ottenute da un
elevato angolo di campo anulare scuro (HAADF) scansione microscopia elettronica a
trasmissione (STEM) mostra gp120 come possibile bersaglio molecolare. Usando
questa tecnica, una disposizione regolare spaziale del nanoparticelle d'argento
collegato virioni di HIV-1 è stata osservata. Il centro a centro distanza tra le
nanoparticelle di argento (~ 28 nm) era simile alla distanza degli gp120 picchi oltre la
membrana virale (~ 22 nm). E 'stato ipotizzato che gli esposti contenenti zolfo residui
delle manopole glicoproteina sarebbe siti interessanti per l'interazione delle
nanoparticelle [ 7 ]. Tuttavia, il meccanismo sottostante l'HIV-inibitrice di
nanoparticelle di argento non era completamente chiariti.
La nanotecnologia offre la possibilità di ri-esplorare le proprietà biologiche di composti
antimicrobici conosciuti dalla manipolazione delle loro dimensioni. L'argento è da
tempo noto per le sue proprietà antimicrobiche, ma le sue applicazioni mediche è
diminuito con lo sviluppo di antibiotici. Tuttavia, Credés profilassi di oftalmia neonatale
da gonococco è rimasto lo standard di cura in molti paesi fino alla fine del 20 ° secolo [
8 ]. Attualmente, sulfadiazina d'argento è elencata dall'Organizzazione Mondiale della
Sanità come un elemento essenziale anti-infettivi medicina d'attualità [ 9 ]. Modalità
argento di azione si presume essere dipendente Ag
+,
che inibiscono fortemente la
crescita batterica con soppressione di enzimi respiratori e componenti di trasporto di
elettroni e per interferenza con le funzioni DNA [ 10 ]. Se l'argento come materiale
sfuso funziona, sarebbe nano-size silver essere attraente? In medicina, il potenziale di
nanoparticelle metalliche è stata esplorata per la diagnosi precoce, diagnosi e cura
delle malattie, ma le loro proprietà biologiche sono in gran parte rimaste inesplorate [
11 ].
Nanoparticelle d'argento sono stati studiati per la loro potenziale antimicrobica e
hanno dimostrato di essere agenti antibatterici contro batteri sia Gram-negativi e
Gram-positivi [ 12 - 16 ], e agenti antivirali contro l'HIV-1 [ 17 ] virus dell'epatite B [
18 ] virus respiratorio sinciziale [ 19 ] l'herpes simplex virus di tipo 1 [ 20 ] e di vaiolo
delle scimmie virus [ 21 ]. Lo sviluppo di prodotti nanoparticelle d'argento si sta
espandendo. Essi sono ora utilizzati come parte di contenitori per alimenti, vestiario,
medicazioni di ferite, unguenti, rivestimenti, impianti e altri oggetti [ 22 , 23 ]; alcune
applicazioni nanoparticelle d'argento hanno ricevuto l'approvazione dalla US Food and
Drug Administration [ 24 ].
Per meglio comprendere la modalità di azione con cui le nanoparticelle d'argento
inattivare HIV-1 e il loro potenziale come agente virucida, abbiamo utilizzato un
pannello di saggi che includevano: (i) una sfida contro un pannello di vari ceppi HIV-1,
(ii) virus saggi adsorbimento, (iii) saggi cellulari fusione, (iv) un gp120/CD4 cattura
ELISA, (v) del tempo di addizione esperimenti, (vi) saggi di attività virucida con virus
cell-free, e (vii) una sfida contro la cellula-associato virus. I dati di questi esperimenti
suggeriscono che le nanoparticelle d'argento esercitata attività anti-HIV in una fase
iniziale della replicazione virale, probabilmente come agente virucida o inibitore
ingresso del virus.
Risultati
Effetto citotossico
HeLa-CD4-LTR-β-gal (cellule che esprimono sia CXCR4 e CCR5), MT-2 (cellule linfoidi
linea cellulare umana esprimono CXCR4), e PBMC umane, sono stati utilizzati come
modelli per valutare la citotossicità nanoparticelle d'argento '. Per mezzo di un saggio
basato luciferasi, il 50% della concentrazione citotossica (CC
50)
di nanoparticelle di
argento è stata definita come 3,9 ± 1,6 mg / mL contro HeLa-CD4-LTR-β-gal cellule,
come 1,11 ± 0,32 mg / mL contro PBMC umane, e di 1,3 ± 0,58 mg / ml contro MT-2
celle.
Campo di attività antivirale
Nanoparticelle di argento di 30-50 nm sono stati testati contro un pannello di HIV-1
isolati usando cellule indicatrici in cui è stato quantificato infezione da un saggio
basato luciferasi. Nanoparticelle d'argento inibito tutti i ceppi, mostrando comparabile
potenza antivirale contro T-tropico, M-tropico, dual-tropico, e isolati resistenti (Tabella
1 ). La concentrazione di nanoparticelle di argento in cui infettività è stato inibito del
50% (IC
50)
variava 0,44-0,91 mg / mL. L'indice terapeutico riflette l'attività
complessiva di un composto mediante citotossicità relativa (CC
misurata come la capacità di inibire l'infezione (IC
50),
50)
ed efficacia,
nelle condizioni di saggio stesse.
Per questi ceppi di HIV-1, una riduzione significativa dell'indice terapeutico è stato
osservato nei ceppi che erano resistenti verso NNRTI, NRTI, PI, e PII rispetto a ceppi
di laboratorio catalogati come virus di tipo selvatico (Tabella 1 ).
Tabella 1. effetto antivirale di nanoparticelle d'argento contro i ceppi di HIV-1
L'attività antivirale di nanoparticelle d'argento e ioni
Per definire che l'effetto osservato antivirale di nanoparticelle di argento è dovuto a
nanoparticelle, anziché solo ioni d'argento presenti nella soluzione, abbiamo anche
valutato l'attività antivirale di argento sulfadiazina (AGSD) e argento nitrato (AgNO
3),
noti sali di argento antimicrobici esercitano il loro effetto antimicrobico con ioni
d'argento [ 25 ]. Sia i sali inibita da HIV-1 in vitro (Tabella 2 ), tuttavia, il loro indice
terapeutico è 12 volte inferiore a quella di nanoparticelle di argento, che indica che gli
ioni di argento per sé un rendimento inferiore nanoparticelle di argento.
Tabella 2. effetto antivirale di sali d'argento e nanoparticelle contro HIV-1
Inibizione di adsorbimento virale
Per confermare che l'attività anti-HIV di nanoparticelle di argento può essere attribuito
alla inibizione del legame virus o fusione alle celle, un saggio di adsorbimento del
virus è stata eseguita [ 26 ]. Un inibitore della fusione (Enfuvirtide) è stata inclusa
come campione di controllo. Nanoparticelle di argento inibito il legame del virus alle
cellule IIIB con una IC
50
di 0,44 mg / mL. Come previsto, l'inibitore della fusione
inibito l'adsorbimento del virus. Questi risultati indicano che le nanoparticelle di
argento inibiscono le fasi iniziali del ciclo di HIV-1.
Inibizione di fusione della membrana Env/CD4-mediated
Un saggio basato su cellule di fusione è stato utilizzato per simulare la gp120-CD4mediata processo di fusione di HIV-1 per la cellula ospite. Cellule HL2 / 3, che
esprimono HIV-1 Busta sulla loro superficie e proteine Tat nei loro citoplasma (cellule
effettrici) [ 27 ] e HeLa-CD4-LTR-β-gal (cellule indicatrici) può fondere come il
risultato della gp120 CD4 interazione, e la quantità di cellule fuse può essere misurato
con il β-gal gene reporter. In presenza di una miscela HL2/3-HeLa CD4, nanoparticelle
d'argento efficacemente bloccati fusione tra due celle (Figura 1a ) in modo dosedipendente (1,0-2,5 mg / mL gamma). Questo intervallo di concentrazione è vicino a
quello che abbiamo riportato in precedenza per le nanoparticelle d'argento IC 50. Noti
farmaci antiretrovirali utilizzati come controlli, come UC781 (NNRTI), AZT (NRTI), e
Indinavir (PI), non inibiscono la fusione cellulare in questo saggio basato su cellule
fusione.
Figura 1. Inibizione della gp120 CD4 interazione. (A) un saggio basato su cellule
di fusione è stato utilizzato per simulare la gp120 CD4-mediata fusione delle
membrane cellulari e virali host. HL2 / 3 e HeLa-CD4-LTR-β-gal cellule sono state
incubate con un duplice diluizione seriale di nanoparticelle di argento e antiretrovirali
noti. Il saggio è stato eseguito in triplicato, i punti di dati rappresentano la media ±
SEM (B) Il grado di inibizione della gp120 CD4-legame proteina è stata valutata con
una cattura gp120/CD4 ELISA in presenza o assenza di nanoparticelle di argento.
Proteina gp120 è stata pretrattata per 10 min con una duplice diluizione seriale di
nanoparticelle di argento, quindi aggiunta ad una piastra rivestita CD4. Il saggio è
stato fatto due volte, le barre di errore indicano la sem
Nanoparticelle di argento interferire con gp120 CD4
interazione
L'attività inibitoria di nanoparticelle di argento contro la gp120-CD4 interazione è stata
studiata anche in un competitivo gp120-cattura ELISA. Una quantità costante di
gp120 è stato incubato per 10 min con quantità crescenti di nanoparticelle di argento,
la miscela è stata quindi aggiunta ad una piastra rivestita CD4, e la quantità di gp120
vincolato alla piastra è stata quantificata. Rispetto al controllo (0,0 mg / ml), si
registra una diminuzione di oltre il 60% di gp120 tenuto a CD4 rivestite con lastre alla
massima dose di nanoparticelle d'argento. Come mostrato in figura 1B , diminuzioni
significative dei valori di assorbanza sono stati osservati in presenza di nanoparticelle
di argento (0,3-5,0 mg / mL). La gp120-ELISA acquisire dati, combinati con i risultati
del saggio basato su cellule fusione, sostengono l'ipotesi che le nanoparticelle di
argento inibiscono HIV-1 bloccando l'ingresso del virus, in particolare la gp120-CD4
interazione.
Sebbene le nanoparticelle d'argento sono dotate di assorbimento caratteristico 400500 nm [ 28 ] non interferenza ai segnali di assorbimento del saggio ELISA è stato
osservato. Questa può essere assunta in quanto i pozzetti con la più alta
concentrazione di nanoparticelle d'argento ha visualizzato elevati livelli di
assorbimento (vedere Figura 1B ) rispetto ai controlli (0,0 mg / mL). Inoltre, i livelli di
assorbimento ottenuti in presenza di nanoparticelle di argento erano inferiori a quelle
della curva di calibrazione (come definito dal produttore).
Tempo (Site) di intervento
Per determinare ulteriormente il bersaglio antivirale di nanoparticelle di argento, un
tempo di addizione esperimento è stato eseguito utilizzando un singolo ciclo di
dosaggio infezione. Il tempo di addizione esperimento è stato usato per delimitare la
fase (s) del ciclo vitale del virus che viene bloccato da nanoparticelle di argento.
Cellule HeLa (che esprimono CD4, CXCR4 e CCR5) sono stati infettati con HIV-1
IIIB
privo di cellule e virus sia nanoparticelle d'argento (1,0 mg / ml), Tak-779 (2.0 mM),
AZT (20,0 pM), indinavir (0.25 mM ), o D-118-24 (100,0 mM) è stato aggiunto su
HIV-1 inoculazione (tempo zero) o in vari momenti post-inoculazione. Questi farmaci
antiretrovirali sono stati scelti come controlli come sottolineano diverse fasi del ciclo di
fusione virale (o di entrata, retrotrascrizione, attività di proteasi, e integrazione del
genoma). Come si vede in figura 2 (AD) , l'attività antivirale di Tak-779, AZT,
Indinavir, e 118-D-24 ha iniziato a diminuire dopo la fase di ciclo che è passato
bersaglio. L'attività del inibitore della fusione è diminuita dopo 2 ore (Figura 2A ),
inibitori di RT dopo 4 h (Figura 2B ), inibitori della proteasi dopo 7 h (Figura 2C ), e
inibitori dell'integrasi dopo 12 h (Figura 2D ). In contrasto, le nanoparticelle d'argento
mantenuto l'attività antivirale anche quando aggiunto 12 ore dopo l'inoculazione HIV.
Questi risultati mostrano che le nanoparticelle d'argento intervenire con il ciclo vitale
del virus nelle fasi oltre a fusione o di entrata. Queste fasi post-entry copre un periodo
di tempo compreso tra e l'ingresso del virus e l'integrazione nel genoma dell'ospite.
Figura 2. Time-of-aggiunta esperimento. HeLa-CD4-LTR-β-gal cellule sono state
infettate con HIV-1
IIIB,
e nanoparticelle di argento (1 mg / mL) e antiretrovirali diversi
stati aggiunti a diversi tempi dopo l'infezione. Attività di nanoparticelle di argento è
stato confrontato con (A) Fusion inibitori (Tak-779, 2 pM), (B) RT inibitori (AZT, 20
pM), (C) Inibitori della proteasi (indinavir, 0,25 mM), e (D) integrasi inibitori (118-D24, 100 mM). Le linee tratteggiate indicano il momento in cui l'attività delle
nanoparticelle di argento e la antiretrovirale differiscono. Il saggio è stato eseguito in
triplicato, i punti di dati rappresentano la media e le linee colorate sono curve di
regressione lineare effettuata con il software SigmaPlot 10,0.
Attività virucida di nanoparticelle d'argento: l'inattivazione
del virus cell-free e associato alle cellule
Per studiare l'effetto che le nanoparticelle di argento hanno il virus stesso, privo di
cellule e cellula-associato HIV-1 sono state trattate con differenti concentrazioni di
nanoparticelle. Privo di cellule e cellula-associated virus infettivi sono le forme di HIV-
1 presenti nel liquido seminale e secrezioni vaginali e può essere trasmesso attraverso
la barriera mucosale [ 29 ] Cell-associated virus include cellule infettate che
trasmettono l'infezione mediante fusione con cellule non infette recettore. Per mezzo
di un saggio basato luciferasi, l'infettività residua di cellule libere virus (una T-tropico
e una M-tropico) dopo il trattamento è stata quantificata nanoparticelle d'argento.
Come mostrato in figura 3 (AB) , nanoparticelle d'argento pre-trattamento di HIV-1
e HIV-1
Bal
IIIB
ridotto l'infettività delle particelle virali dopo appena 5 minuti di
esposizione. L'effetto aumentata dopo 60 minuti di esposizione (in particolare Bal),
indicando che le nanoparticelle di argento agire direttamente sul virione,
inattivandolo.
Figura 3. virucida di nanoparticelle di argento contro M e T tropico HIV-1.
Seriali diluizioni doppie di nanoparticelle di argento sono stati aggiunti a 10 5 TCID
HIV-1
Bal
(A) e HIV-1
IIIB
50
di
(B) virus cell-free con 0,2-0,5 moi Dopo incubazione per 5 min
e 60 min, le miscele sono state centrifugate per tre volte a 10.000 rpm, i fluidi
supernatante rimosso e il pellet lavato tre volte. I pellet finali sono stati posti in
piastre da 96 pozzetti con HeLa-CD4-LTR-β-gal cellule. Valutazione di HIV-1 è stata
fatta con un saggio basato luciferasi. La percentuale di infettività residua dopo
trattamento nanoparticelle d'argento è stata calcolata rispetto al controllo positivo del
virus non trattato. Il saggio è stato eseguito in triplicato, i punti di dati rappresentano
la media, e le linee continue sono curve di regressione lineare effettuata con il
software SigmaPlot 10,0.
Nanoparticelle d'argento sono efficaci anche contro la trasmissione di HIV-1 mediata
da infezione cronica da PBMC e H9 (linea cellulare linfoide). Trasmissione era ridotto
del 50%, anche quando entrambi i tipi cellulari sono stati trattati con le nanoparticelle
per 1 min (Figura 4A-B ).
Figura 4. trattamento di HIV-1 associata alla cellula virus. Cronicamente HIV-1infetti H9 (A) e PBMC (B) le cellule sono state incubate con seriali diluizioni doppie di
nanoparticelle di argento per 1 min e 60 min. Cellule trattate sono state centrifugate,
lavate tre volte con mezzo di coltura, e quindi aggiunto alla TZM-bl cellule. Valutazione
di HIV-1 è stata fatta con un saggio basato luciferasi dopo 48 h. Il saggio è stato
eseguito in triplicato, le barre di errore indicano la sem
Discussione
Nanoparticelle d'argento si è rivelato un agente antivirale contro l'HIV-1, ma il suo
meccanismo d'azione non è stato completamente chiarito. E 'l'obiettivo principale
gp120? Non nanoparticelle d'argento agiscono come inibitori d'ingresso? In questo
studio, abbiamo studiato il meccanismo di azione antivirale di nanoparticelle di
argento contro HIV-1. I nostri risultati rivelano, per la prima volta, che le
nanoparticelle di argento esercitano attività anti-HIV in una fase iniziale della
replicazione virale, probabilmente come agente virucida o inibitore ingresso del virus.
Nessuna differenza significativa è stata trovata nelle attività antivirali di nanoparticelle
d'argento contro i differenti ceppi resistenti ai farmaci (Tabella 1 ), per cui le mutazioni
antiretrovirali ceppi di HIV che conferiscono resistenza non influenzano l'efficacia di
nanoparticelle di argento. Questi risultati concordano inoltre con i risultati precedenti,
in cui si è accertato che le nanoparticelle d'argento sono ad ampio spettro biocidi [
30 , 31 ] ceppi di HIV-1 presenti nella popolazione umana può variare notevolmente la
sua patogenicità, virulenza, e la sensibilità a particolari farmaci antiretrovirali [ 32 ] Il
fatto che le nanoparticelle di argento inibiscono tale pannello varia di ceppi li rende un
efficace agente ad ampio spettro contro HIV-1. Questa particolare proprietà può
ridurre la probabilità di comparsa di resistenza e la successiva diffusione dell'infezione.
Nanoparticelle di argento inibita una varietà di ceppi HIV-1 indipendentemente dalla
loro tropismo (Tabella 1 ). Variazione gp120 tra ceppi di HIV è il fattore determinante
delle diverse tropismo tra ceppi, con l'ansa V3 di gp120 riconoscere i recettori per le
chemochine CXCR4 (T-tropico virus), CCR5 (M-tropico virus), o entrambi (dual-tropico
virus) [ 33 ] Il fatto che le nanoparticelle di argento inibito tutti i ceppi testati indica
che la modalità di azione non dipende questo determinante di tropismo cellulare.
Elechiguerra et al. postulato che le nanoparticelle di argento subiscono interazione
specifica con HIV-1 tramite legame preferenziale con gp120 [ 7 ] Se è così, allora i
nostri risultati dimostrano che l'inibizione da nanoparticelle d'argento non dipende
l'ansa V3, che ha una carica positiva netta che contribuisce al suo ruolo nella
determinazione virale co-recettore tropismo [ 34 ] Poiché particelle di argento hanno
una carica positiva superficie, l'ansa V3 non sarebbe loro sito preferito di interazione.
Quindi, le nanoparticelle possono eventualmente agire come inibitori di attacco
impedendo la gp120 CD4 interazione, piuttosto che come co-antagonisti che
interferiscono con il contatto gp120-CXCR4/CCR5 [ 4 ]
Per mezzo di un saggio di adsorbimento virale, è stato dimostrato che le
nanoparticelle d'argento "meccanismo di azione anti-HIV è basata sulla inibizione delle
fasi iniziali del ciclo di HIV-1. Inoltre, la gp120-acquisire dati ELISA (Figura 1B ),
combinati con i risultati del saggio basato su cellule fusione (Figura 1A ), sostenuto
l'ipotesi che le nanoparticelle di argento inibiscono HIV-1 bloccando l'ingresso del
virus, in particolare la gp120-CD4 interazione. Le osservazioni effettuate in
precedenza dall'analisi STEM sostenere questa idea, dal momento che le
nanoparticelle d'argento sono stati visti per legare strutture proteiche distribuiti sulla
membrana virale [ 7 ] Se nanoparticelle d'argento non si legano al loop V3, allora
potrebbe preferenzialmente interagire con la cavità negativo di gp120 che si lega al
CD4 [ 35 ] L'attrazione tra CD4 e gp120 è per lo più elettrostatico, con il fine primario
di CD4 vincolanti in una tasca da incasso per gp120, facendo ampi contatti oltre ~ 800
Å
2
di superficie gp120 [ 36 ]
Inoltre, nanoparticelle d'argento potrebbe interagire con i due legami disolfuro situati
nella metà del carbossile HIV-1 gp120 glicoproteina, una zona che è stata implicata
nel legame al recettore CD4 [ 37 ] Gli ioni argento legano ai gruppi sulfidrilici, che
portano alla denaturazione proteica dalla riduzione dei legami disolfuro [ 38 ]
Pertanto, ipotizziamo che le nanoparticelle d'argento non solo legarsi a gp120, ma
anche modificare questa proteina virale di denaturazione suo disolfuro-legato dominio
che si trova nella regione CD4 vincolante. Questo può essere visto in nostri risultati di
capacità di nanoparticelle di argento 'a diminuire maggiormente infettività residua di
particelle virali dopo 60 minuti di incubazione che dopo 5 minuti di incubazione (Figura
3 ). Poiché l'effetto antivirale di nanoparticelle d'argento aumenta con il tempo di
incubazione, si può ipotizzare che nanoparticelle d'argento inizialmente legano gp120
manopole e quindi inibire l'infezione modificando irreversibilmente queste strutture
virali. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per definire se le nanoparticelle
d'argento interagire con la cavità con carica negativa e le due ponti disolfuro si trova
nella regione di legame CD4 di gp120.
Sviluppo di resistenza può essere un problema per i composti che colpiscono la busta
a causa dell'alto tasso di sostituzioni nelle regioni variabili della proteina Env. Tuttavia,
poiché le posizioni dei residui di cisteina, il pattern di legame disolfuro in gp120, e la
capacità di gpl20 di legarsi al recettore CD4 virali sono altamente conservate tra
isolati [ 39 ] lo sviluppo di resistenza a nanoparticelle d'argento sarebbe complicato.
Confrontando l'effetto antivirale (misurata con l'indice terapeutico) di nanoparticelle di
argento con due sali d'argento comunemente utilizzati (AGSD e AgNO
3),
è stato
osservato che gli ioni argento da soli sono meno efficienti di nanoparticelle di argento.
Quindi, se osservato anti-HIV-1 di nanoparticelle di argento sarebbe solo essere
dovuto a ioni d'argento presenti in soluzione delle nanoparticelle, l'indice terapeutico
sarebbe stato inferiore. Attività elevata di nanoparticelle d'argento è suggerito per
essere a causa della differenza specie si dissolvono a rilasciare Ag 0 (atomica) e Ag
(ionica) i cluster, mentre sali d'argento Ag
+
+
comunicato solo [ 40 ]
Il tempo di addizione esperimenti ulteriormente confermato le nanoparticelle
d'argento come inibitori d'ingresso (Figura 2 ). Inoltre, è stato rivelato che le
nanoparticelle di argento hanno altri siti di intervento sul ciclo vitale del virus, oltre a
fusione o voce. Dato che gli ioni argento possono complesso con gruppi donatori di
elettroni contenenti zolfo, ossigeno, azoto o che sono normalmente presenti come tioli
o fosfati di aminoacidi e acidi nucleici [ 41 ] che potrebbero inibire post-entry stadi di
infezione da HIV-1 bloccando altre proteine di gp120, o riducendo la trascrizione
inversa o tassi di trascrizione provirali direttamente vincolante per l'RNA o molecole di
DNA. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato che le nanoparticelle di argento
sopprimere l'espressione di TNF-α [ 42 ], che è una citochina che gioca un ruolo
fondamentale in HIV-1 patogenesi incrementando HIV-1 di trascrizione [ 43 ]
L'inibizione del TNF-α trascrizione attivati potrebbe anche essere un bersaglio per
l'attività anti-HIV di nanoparticelle di argento. Avere un pannello varia di bersagli nel
ciclo di replicazione dell'HIV-1 rende nanoparticelle d'argento un agente che non è
incline a contribuire alla comparsa di ceppi resistenti.
Nanoparticelle d'argento si è rivelato virucida alla cella-free e associato alle cellule
HIV-1, come giudicato da saggi di infettività virale (figure 3 e 4 ). Infettività dell'HIV è
effettivamente rimossi a seguito di una breve esposizione del virus isolato a
nanoparticelle d'argento. Trattamento delle nanoparticelle d'argento con infezione
cronica cellule H9
+
nonché umano PBMC
+
portato a infettività diminuito.
Un virucida deve operare in modo rapido ed efficace nel prevenire l'infezione delle
cellule bersaglio vulnerabili. Secondo Borkow et al. (1997), un agente ideale
retrovirucidal dovrebbe agire direttamente sul virus, agire replica passaggi prima
integrazione del DNA provirale nel genoma della cellula ospite infettata, essere
assorbibili da cellule non infettate, al fine di fornire una barriera all'infezione da virus
attivo residuo, ed essere efficace a concentrazioni facilmente ottenibili non citotossiche
in vivo [ 44 ] le nanoparticelle d'argento agiscono direttamente sul virus nelle fasi che
impediscono l'integrazione all'interno della cellula ospite, ma ulteriori studi di
farmacocinetica, farmacodinamica, e tossicologici in modelli animali sono necessari
per definire i parametri di sicurezza per l'uso di nanoparticelle d'argento come
strumenti di prevenzione per l'HIV- 1 trasmissione.
Conclusioni
Infine, proponiamo che l'attività antivirale di nanoparticelle d'argento risultati dal loro
inibizione dell'interazione tra gp120 e recettori di membrana cellulare bersaglio.
According to our results, this mode of antiviral action allows silver nanoparticles to
inhibit HIV-1 infection regardless of viral tropism or resistance profile, to bind to
gp120 in a manner that prevents CD4-dependent virion binding, fusion, and
infectivity, and to block HIV-1 cell-free and cell-associated infection, acting as a
virucidal agent. In conclusion, silver nanoparticles are effective virucides as they
inactivate HIV particles in a short period of time, exerting their activity at an early
stage of viral replication (entry or fusion) and at post-entry stages. The data
presented here contribute to a new and still largely unexplored area; the use of
nanomaterials against specific targets of viral particles.
Metodi
Composti dell'argento
Fabbricata commercialmente 30-50 nm nanoparticelle d'argento, la superficie rivestita
di 0,2% in peso di PVP, sono stati utilizzati (Nanoamor, Houston, TX). Stock solutions
of silver nanoparticles, silver sulfadiazine (Sigma-Aldrich) and silver nitrate (SigmaAldrich) were prepared in RPMI 1640 cell culture media. Following serial dilutions of
the stock were made in culture media.
Cells, HIV-1 isolates, and antiretrovirals
HeLa-CD4-LTR-β-gal cells, MT-2 cells, HL2/3 cells, H9 cells, TZM-bl cells, HIV-1
HIV-1
Bal
, HIV-1
BCF01
, HIV-1
96USSN20
IIIB
,
, AZT, Indinavir, 118-D-24, Tak-779, and Enfuvirtide
were obtained through the AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH. HIV1
Eli
and HIV-1
Beni
are clinical isolates from patients from the Ruth Ben-Ari Institute of
Clinical Immunology and AIDS Center, Israel. They were kindly donated by Gadi
Borkow. Aliquots of cell-free culture viral supernatants were used as viral inocula.
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy donors using
Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. UC781
was kindly donated by Dr. Gadi Borkow.
Cytotoxicity assays
A stock solution of silver nanoparticles was two-fold diluted to desired concentrations
in growth medium and subsequently added into 96-wells plates containing HeLa-CD4LTR-β-gal cells, PBMC and MT-2 cells (5 × 10
4
cells/well). Microtiter plates were
incubated at 37°C in a 5% CO 2 air humidified atmosphere for a further 2 days.
Assessments of cell viability were carried out using a CellTiter-Glo
®
Viability Assay (Promega). The 50% cytotoxic concentration (CC
) was defined
50
Luminescent Cell
based on the percentage cell survival relative to the positive control.
HIV-1 infectivity inhibition assays
Serial two-fold dilutions of silver nanoparticles were mixed with 10 5 TCID
50
of HIV-1
cell-free virus and added to HeLa-CD4-LTR-β-gal cells with a 0.2-0.5 multiplicity of
infection [ 7 ] HIV-1 infection was assessed after two days of incubation by
quantifying the activity of the β-galactosidase produced after infection with the BetaGlo Assay System (Promega). La concentrazione inibitoria del 50% (IC
50)
è definita in
funzione della percentuale di inibizione infettività rispetto al controllo positivo.
Virus adsorption assays
In this assay the inhibitory effects of silver nanoparticles on virus adsorption to HeLaCD4-LTR-β-gal cells were measured as previously described [ 26 ] HeLa-CD4-LTR-βgal cells (5 × 10
4
cells/well) were incubated with HIV
IIIB
in the absence or presence of
serial dilutions of silver nanoparticles and Enfuvirtide. After 2 h of incubation at 37°C,
the cells were extensively washed with 1× PBS to remove the unadsorbed virus
particles. Then the cells were incubated for 48 h, and the amount of viral infection was
quantified with the Beta-Glo Assay System (Promega).
Cell-based fusion assay
HeLa-derived HL2/3 cells, which express the HIV-1
HXB2
Env, Tat, Gag, Rev, and Nef
proteins, were co-cultured with HeLa-CD4-LTR-β-gal cells at a 1:1 cell density ratio
(2.5 × 10
4
cells/well each) for 48 h in the absence or presence of two-fold dilutions of
silver nanoparticles, UC781, AZT, and Indinavir in order to examine whether the
compounds interfered with the binding process of HIV-1 Env and the CD4 receptor.
Upon fusion of both cell lines, the Tat protein from HL2/3 cells activates βgalactosidase indicator gene expression in HeLa-CD4-LTR-β-gal cells [ 45 , 27 ] β-gal
activity was quantified with the Beta-Glo Assay System (Promega). The percentage of
inhibition of HL2/3-HeLa CD4 cell fusion was calculated with respect to the positive
control of untreated cells.
HIV-1 gp120/CD4 ELISA
A gp120 capture ELISA (ImmunoDiagnostics, Inc., Woburn, MA) was used to test the
inhibitory activity of silver nanoparticles against gp120-CD4 binding. Briefly,
recombinant HIV-1
IIIB
gp120 protein (100 ng/mL) was pre-incubated for 10 min in the
absence or presence of serial two-fold dilutions of silver nanoparticles, and then added
to a CD4-coated plate. The amount of captured gp120 was detected by peroxidaseconjugated murine anti-gp120 MAb. In separate experiments, gp120 (100 ng/mL) was
added to CD4-coated plates pretreated with silver nanoparticles for a 10 min period.
Before the addition of the gp120 protein, plates were washed three times to remove
unbound silver nanoparticles [ 27 ]
Time-of-addition experiments
HeLa-CD4-LTR-β-gal cells were infected with 10 5 TCID
50
of HIV-1 cell-free virus with a
0.2-0.5 multiplicity of infection (moi). Silver nanoparticles (1 mg/mL), Tak-779 (fusion
inhibitor, 2 μM), AZT (NRTI, 20 μM), Indinavir (protease inhibitor, 0.25 μM), and 118D-24 (integrase inhibitor, 100 μM) were then added at different times (0, 1, 2, 3 ... 12
h) after infection [ 3 , 31 ] Infection inhibition was quantified after 48 h by measuring
β-gal activity with the Beta-Glo Assay System.
Virucidal activity assay
Serial two-fold dilutions of silver nanoparticles were added to 10 5 TCID
and HIV-1
Bal
50
of HIV-1
IIIB
cell-free virus with a 0.2-0.5 moi After incubation for 5 min and 60 min
at room temperature, the mixtures were centrifuged three times at 10,000 rpm, the
supernatant fluids removed, and the pellets washed three times. The final pellets were
resuspended in DMEM and placed into 96-well plates with HeLa-CD4-LTR-β-gal cells.
The cells were incubated in a 5% CO 2 humidified incubator at 37°C for 2 days.
Assessment of HIV-1 infection was made with the Beta-Glo Assay System. The
percentage of residual infectivity after silver nanoparticle treatment was calculated
with respect to the positive control of untreated virus [ 31 ]
Treatment of HIV-1 cell-associated virus
Chronically HIV-1-infected PBMC and H9 cells were incubated with serial two-fold
dilutions of silver nanoparticles for 1 min and 60 min. Treated cells were centrifuged,
washed three times with cell culture media, and then added to TZM-bl cells. HIV-1
infection triggers, through the Tat protein, β-galactosidase expression in TZM-bl cells.
β-gal activity was quantified with the Beta-Glo Assay System.
Analisi statistica
Graphs show values of the means ±standard deviations from three separate
experiments, each of which was carried out in duplicate. Time-of-addition experiment
graphs are nonlinear regression curves done with SigmaPlot 10.0 software.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Contributi degli autori
Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale. HHL participated in the
conception and experimental design of the in vitro HIV-1 manipulation and infectivity
assays, in analysis and interpretation of the data, and in writing and revision of this
report. NVAN. participated in the conception and design of the in vitro HIV-1
manipulation and infectivity assays, in analysis and interpretation of the data, and in
writing and revision of this report. LIT participated in collection of in vitro HIV-1
manipulation and infectivity assays. CR-P. participated in the experimental design of
this research.
Ringraziamenti
The following funding sources supported the data collection process: the Programa de
Apoyo a la Investigacion en Ciencia y Tecnologia (PAICyT) of the Universidad
Autonoma de Nuevo Leon, Mexico, and the Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia
(CONACyT) of Mexico.
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