Modalità di azione antivirale di nanoparticelle d'argento contro l'HIV-1 Humberto H Lara Nilda V Ayala-Nuñez, Liliana Ixtepan-Turrent e Cristina Rodriguez-Padilla Corresponding author: Humberto H Lara dr.lara.v @ gmail.com Autore Affiliazioni Laboratorio de Inmunología y Virologia, Departamento de Microbiologia e Inmunología, Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Autonoma de Nuevo Leon, San Nicolas de los Garza, Messico Per tutte le email autore, si prega di effettuare l'accesso . Journal of Nanobiotecnologie 2010, 8: 1 DOI: 10.1186/1477-3155-8-1 La versione elettronica di questo articolo è quello completo e si possono trovare online all'indirizzo: http://www.jnanobiotechnology.com/content/8/1/1 Ricevuto: Accettato: Pubblicato il: 21 luglio 2009 20 gennaio 2010 20 gennaio 2010 © 2010 Lara et al; licenziatario BioMed Central Ltd. Questo è un articolo Open Access distribuito secondo i termini della Licenza Creative Commons Attribution ( http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 ), che consente un utilizzo senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'operatore originale è correttamente citato. Astratto Sfondo Nanoparticelle di argento hanno dimostrato di esercitare attività antivirale contro HIV1 a concentrazioni non citotossiche, ma il meccanismo alla base della loro HIVinibitrice non è stato non completamente chiarito. In questo studio, nanoparticelle d'argento sono valutati per chiarire la loro modalità di azione antivirale contro HIV-1 utilizzando un pannello di diversi saggi in vitro. Risultati I nostri dati suggeriscono che le nanoparticelle d'argento esercitano attività anti-HIV in una fase iniziale della replicazione virale, probabilmente come agente virucida o come inibitore di ingresso del virus. Nanoparticelle d'argento si legano a gp120 in un modo che impedisce il legame CD4-dipendente virione, fusione, e l'infettività, in qualità di un efficace agente virucida contro virus cell-free (ceppi di laboratorio, isolati clinici, T e M ceppi tropicali, e ceppi resistenti) e cell-associated virus. Inoltre, le nanoparticelle di argento inibiscono post-entry fasi del ciclo di vita di HIV-1. Conclusioni Queste caratteristiche li rendono un agente ad ampio spettro non incline ad indurre resistenza che potrebbe essere utilizzato preventivamente contro un'ampia varietà di circolazione ceppi HIV-1. Sfondo Secondo il Programma congiunto delle Nazioni Unite sull'HIV / AIDS, si stima che 33 milioni di persone vivevano con l'HIV nel 2007, 2.7 milioni in meno rispetto al 2001 [ 1 ]. Sebbene il tasso di nuove infezioni da HIV è diminuita in molti paesi, l'HIV / AIDS rappresenta ancora un grave problema di salute pubblica in tutto il mondo. L'emergere di ceppi resistenti è una delle sfide principali per contenere la diffusione del virus e il suo impatto sulla salute umana. In diversi paesi, gli studi hanno dimostrato che il 5% -78% dei pazienti trattati in terapia antiretrovirale sono infettati con HIV-1 virus che sono resistenti ad almeno uno dei farmaci disponibili [ 2 ]. Per questi motivi, vi è una necessità di nuovi agenti anti-HIV che funzionano in fasi diverse retrotrascrizione virali o attività di proteasi e che può essere utilizzato per il trattamento e la prevenzione di HIV / AIDS diffusione [ 3 ]. Inibitori della fusione o di entrata sono considerati un'opzione attraente, dal momento che ad ostacolare l'entrata HIV nella sua cellula bersaglio porta alla soppressione di infettività virale, la replica e la citotossicità indotta dalla interazione virus-cellula [ 4 ]. Dal 2005, solo due inibitori della fusione sono stati approvati dalla FDA (Enfurtivide e Maravirovic). Oltre a inibitori della fusione, agenti virucidi sono urgentemente necessari per l'HIV / AIDS perché direttamente inattivare la particella virale (virione), che impedisce il completamento del ciclo di replicazione virale. Agenti virucida differiscono da farmaci virustatica in quanto agiscono direttamente e rapidamente da lisi delle membrane virali a contatto o legandosi a proteine di rivestimento del virus [ 5 ]. Questi composti si interagisce direttamente con virioni di HIV-1 per inattivare l'infettività o prevenire l'infezione e potrebbe essere usato come un approccio per fornire una difesa contro la trasmissione sessuale del virus [ 6 ]. In precedenza, abbiamo esplorato le proprietà antivirali di nanoparticelle d'argento contro l'HIV-1 e trovato attraverso saggi in vitro che sono attivi contro un laboratorioadattato ceppo HIV-1 a concentrazioni non citotossiche. Le immagini ottenute da un elevato angolo di campo anulare scuro (HAADF) scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM) mostra gp120 come possibile bersaglio molecolare. Usando questa tecnica, una disposizione regolare spaziale del nanoparticelle d'argento collegato virioni di HIV-1 è stata osservata. Il centro a centro distanza tra le nanoparticelle di argento (~ 28 nm) era simile alla distanza degli gp120 picchi oltre la membrana virale (~ 22 nm). E 'stato ipotizzato che gli esposti contenenti zolfo residui delle manopole glicoproteina sarebbe siti interessanti per l'interazione delle nanoparticelle [ 7 ]. Tuttavia, il meccanismo sottostante l'HIV-inibitrice di nanoparticelle di argento non era completamente chiariti. La nanotecnologia offre la possibilità di ri-esplorare le proprietà biologiche di composti antimicrobici conosciuti dalla manipolazione delle loro dimensioni. L'argento è da tempo noto per le sue proprietà antimicrobiche, ma le sue applicazioni mediche è diminuito con lo sviluppo di antibiotici. Tuttavia, Credés profilassi di oftalmia neonatale da gonococco è rimasto lo standard di cura in molti paesi fino alla fine del 20 ° secolo [ 8 ]. Attualmente, sulfadiazina d'argento è elencata dall'Organizzazione Mondiale della Sanità come un elemento essenziale anti-infettivi medicina d'attualità [ 9 ]. Modalità argento di azione si presume essere dipendente Ag +, che inibiscono fortemente la crescita batterica con soppressione di enzimi respiratori e componenti di trasporto di elettroni e per interferenza con le funzioni DNA [ 10 ]. Se l'argento come materiale sfuso funziona, sarebbe nano-size silver essere attraente? In medicina, il potenziale di nanoparticelle metalliche è stata esplorata per la diagnosi precoce, diagnosi e cura delle malattie, ma le loro proprietà biologiche sono in gran parte rimaste inesplorate [ 11 ]. Nanoparticelle d'argento sono stati studiati per la loro potenziale antimicrobica e hanno dimostrato di essere agenti antibatterici contro batteri sia Gram-negativi e Gram-positivi [ 12 - 16 ], e agenti antivirali contro l'HIV-1 [ 17 ] virus dell'epatite B [ 18 ] virus respiratorio sinciziale [ 19 ] l'herpes simplex virus di tipo 1 [ 20 ] e di vaiolo delle scimmie virus [ 21 ]. Lo sviluppo di prodotti nanoparticelle d'argento si sta espandendo. Essi sono ora utilizzati come parte di contenitori per alimenti, vestiario, medicazioni di ferite, unguenti, rivestimenti, impianti e altri oggetti [ 22 , 23 ]; alcune applicazioni nanoparticelle d'argento hanno ricevuto l'approvazione dalla US Food and Drug Administration [ 24 ]. Per meglio comprendere la modalità di azione con cui le nanoparticelle d'argento inattivare HIV-1 e il loro potenziale come agente virucida, abbiamo utilizzato un pannello di saggi che includevano: (i) una sfida contro un pannello di vari ceppi HIV-1, (ii) virus saggi adsorbimento, (iii) saggi cellulari fusione, (iv) un gp120/CD4 cattura ELISA, (v) del tempo di addizione esperimenti, (vi) saggi di attività virucida con virus cell-free, e (vii) una sfida contro la cellula-associato virus. I dati di questi esperimenti suggeriscono che le nanoparticelle d'argento esercitata attività anti-HIV in una fase iniziale della replicazione virale, probabilmente come agente virucida o inibitore ingresso del virus. Risultati Effetto citotossico HeLa-CD4-LTR-β-gal (cellule che esprimono sia CXCR4 e CCR5), MT-2 (cellule linfoidi linea cellulare umana esprimono CXCR4), e PBMC umane, sono stati utilizzati come modelli per valutare la citotossicità nanoparticelle d'argento '. Per mezzo di un saggio basato luciferasi, il 50% della concentrazione citotossica (CC 50) di nanoparticelle di argento è stata definita come 3,9 ± 1,6 mg / mL contro HeLa-CD4-LTR-β-gal cellule, come 1,11 ± 0,32 mg / mL contro PBMC umane, e di 1,3 ± 0,58 mg / ml contro MT-2 celle. Campo di attività antivirale Nanoparticelle di argento di 30-50 nm sono stati testati contro un pannello di HIV-1 isolati usando cellule indicatrici in cui è stato quantificato infezione da un saggio basato luciferasi. Nanoparticelle d'argento inibito tutti i ceppi, mostrando comparabile potenza antivirale contro T-tropico, M-tropico, dual-tropico, e isolati resistenti (Tabella 1 ). La concentrazione di nanoparticelle di argento in cui infettività è stato inibito del 50% (IC 50) variava 0,44-0,91 mg / mL. L'indice terapeutico riflette l'attività complessiva di un composto mediante citotossicità relativa (CC misurata come la capacità di inibire l'infezione (IC 50), 50) ed efficacia, nelle condizioni di saggio stesse. Per questi ceppi di HIV-1, una riduzione significativa dell'indice terapeutico è stato osservato nei ceppi che erano resistenti verso NNRTI, NRTI, PI, e PII rispetto a ceppi di laboratorio catalogati come virus di tipo selvatico (Tabella 1 ). Tabella 1. effetto antivirale di nanoparticelle d'argento contro i ceppi di HIV-1 L'attività antivirale di nanoparticelle d'argento e ioni Per definire che l'effetto osservato antivirale di nanoparticelle di argento è dovuto a nanoparticelle, anziché solo ioni d'argento presenti nella soluzione, abbiamo anche valutato l'attività antivirale di argento sulfadiazina (AGSD) e argento nitrato (AgNO 3), noti sali di argento antimicrobici esercitano il loro effetto antimicrobico con ioni d'argento [ 25 ]. Sia i sali inibita da HIV-1 in vitro (Tabella 2 ), tuttavia, il loro indice terapeutico è 12 volte inferiore a quella di nanoparticelle di argento, che indica che gli ioni di argento per sé un rendimento inferiore nanoparticelle di argento. Tabella 2. effetto antivirale di sali d'argento e nanoparticelle contro HIV-1 Inibizione di adsorbimento virale Per confermare che l'attività anti-HIV di nanoparticelle di argento può essere attribuito alla inibizione del legame virus o fusione alle celle, un saggio di adsorbimento del virus è stata eseguita [ 26 ]. Un inibitore della fusione (Enfuvirtide) è stata inclusa come campione di controllo. Nanoparticelle di argento inibito il legame del virus alle cellule IIIB con una IC 50 di 0,44 mg / mL. Come previsto, l'inibitore della fusione inibito l'adsorbimento del virus. Questi risultati indicano che le nanoparticelle di argento inibiscono le fasi iniziali del ciclo di HIV-1. Inibizione di fusione della membrana Env/CD4-mediated Un saggio basato su cellule di fusione è stato utilizzato per simulare la gp120-CD4mediata processo di fusione di HIV-1 per la cellula ospite. Cellule HL2 / 3, che esprimono HIV-1 Busta sulla loro superficie e proteine Tat nei loro citoplasma (cellule effettrici) [ 27 ] e HeLa-CD4-LTR-β-gal (cellule indicatrici) può fondere come il risultato della gp120 CD4 interazione, e la quantità di cellule fuse può essere misurato con il β-gal gene reporter. In presenza di una miscela HL2/3-HeLa CD4, nanoparticelle d'argento efficacemente bloccati fusione tra due celle (Figura 1a ) in modo dosedipendente (1,0-2,5 mg / mL gamma). Questo intervallo di concentrazione è vicino a quello che abbiamo riportato in precedenza per le nanoparticelle d'argento IC 50. Noti farmaci antiretrovirali utilizzati come controlli, come UC781 (NNRTI), AZT (NRTI), e Indinavir (PI), non inibiscono la fusione cellulare in questo saggio basato su cellule fusione. Figura 1. Inibizione della gp120 CD4 interazione. (A) un saggio basato su cellule di fusione è stato utilizzato per simulare la gp120 CD4-mediata fusione delle membrane cellulari e virali host. HL2 / 3 e HeLa-CD4-LTR-β-gal cellule sono state incubate con un duplice diluizione seriale di nanoparticelle di argento e antiretrovirali noti. Il saggio è stato eseguito in triplicato, i punti di dati rappresentano la media ± SEM (B) Il grado di inibizione della gp120 CD4-legame proteina è stata valutata con una cattura gp120/CD4 ELISA in presenza o assenza di nanoparticelle di argento. Proteina gp120 è stata pretrattata per 10 min con una duplice diluizione seriale di nanoparticelle di argento, quindi aggiunta ad una piastra rivestita CD4. Il saggio è stato fatto due volte, le barre di errore indicano la sem Nanoparticelle di argento interferire con gp120 CD4 interazione L'attività inibitoria di nanoparticelle di argento contro la gp120-CD4 interazione è stata studiata anche in un competitivo gp120-cattura ELISA. Una quantità costante di gp120 è stato incubato per 10 min con quantità crescenti di nanoparticelle di argento, la miscela è stata quindi aggiunta ad una piastra rivestita CD4, e la quantità di gp120 vincolato alla piastra è stata quantificata. Rispetto al controllo (0,0 mg / ml), si registra una diminuzione di oltre il 60% di gp120 tenuto a CD4 rivestite con lastre alla massima dose di nanoparticelle d'argento. Come mostrato in figura 1B , diminuzioni significative dei valori di assorbanza sono stati osservati in presenza di nanoparticelle di argento (0,3-5,0 mg / mL). La gp120-ELISA acquisire dati, combinati con i risultati del saggio basato su cellule fusione, sostengono l'ipotesi che le nanoparticelle di argento inibiscono HIV-1 bloccando l'ingresso del virus, in particolare la gp120-CD4 interazione. Sebbene le nanoparticelle d'argento sono dotate di assorbimento caratteristico 400500 nm [ 28 ] non interferenza ai segnali di assorbimento del saggio ELISA è stato osservato. Questa può essere assunta in quanto i pozzetti con la più alta concentrazione di nanoparticelle d'argento ha visualizzato elevati livelli di assorbimento (vedere Figura 1B ) rispetto ai controlli (0,0 mg / mL). Inoltre, i livelli di assorbimento ottenuti in presenza di nanoparticelle di argento erano inferiori a quelle della curva di calibrazione (come definito dal produttore). Tempo (Site) di intervento Per determinare ulteriormente il bersaglio antivirale di nanoparticelle di argento, un tempo di addizione esperimento è stato eseguito utilizzando un singolo ciclo di dosaggio infezione. Il tempo di addizione esperimento è stato usato per delimitare la fase (s) del ciclo vitale del virus che viene bloccato da nanoparticelle di argento. Cellule HeLa (che esprimono CD4, CXCR4 e CCR5) sono stati infettati con HIV-1 IIIB privo di cellule e virus sia nanoparticelle d'argento (1,0 mg / ml), Tak-779 (2.0 mM), AZT (20,0 pM), indinavir (0.25 mM ), o D-118-24 (100,0 mM) è stato aggiunto su HIV-1 inoculazione (tempo zero) o in vari momenti post-inoculazione. Questi farmaci antiretrovirali sono stati scelti come controlli come sottolineano diverse fasi del ciclo di fusione virale (o di entrata, retrotrascrizione, attività di proteasi, e integrazione del genoma). Come si vede in figura 2 (AD) , l'attività antivirale di Tak-779, AZT, Indinavir, e 118-D-24 ha iniziato a diminuire dopo la fase di ciclo che è passato bersaglio. L'attività del inibitore della fusione è diminuita dopo 2 ore (Figura 2A ), inibitori di RT dopo 4 h (Figura 2B ), inibitori della proteasi dopo 7 h (Figura 2C ), e inibitori dell'integrasi dopo 12 h (Figura 2D ). In contrasto, le nanoparticelle d'argento mantenuto l'attività antivirale anche quando aggiunto 12 ore dopo l'inoculazione HIV. Questi risultati mostrano che le nanoparticelle d'argento intervenire con il ciclo vitale del virus nelle fasi oltre a fusione o di entrata. Queste fasi post-entry copre un periodo di tempo compreso tra e l'ingresso del virus e l'integrazione nel genoma dell'ospite. Figura 2. Time-of-aggiunta esperimento. HeLa-CD4-LTR-β-gal cellule sono state infettate con HIV-1 IIIB, e nanoparticelle di argento (1 mg / mL) e antiretrovirali diversi stati aggiunti a diversi tempi dopo l'infezione. Attività di nanoparticelle di argento è stato confrontato con (A) Fusion inibitori (Tak-779, 2 pM), (B) RT inibitori (AZT, 20 pM), (C) Inibitori della proteasi (indinavir, 0,25 mM), e (D) integrasi inibitori (118-D24, 100 mM). Le linee tratteggiate indicano il momento in cui l'attività delle nanoparticelle di argento e la antiretrovirale differiscono. Il saggio è stato eseguito in triplicato, i punti di dati rappresentano la media e le linee colorate sono curve di regressione lineare effettuata con il software SigmaPlot 10,0. Attività virucida di nanoparticelle d'argento: l'inattivazione del virus cell-free e associato alle cellule Per studiare l'effetto che le nanoparticelle di argento hanno il virus stesso, privo di cellule e cellula-associato HIV-1 sono state trattate con differenti concentrazioni di nanoparticelle. Privo di cellule e cellula-associated virus infettivi sono le forme di HIV- 1 presenti nel liquido seminale e secrezioni vaginali e può essere trasmesso attraverso la barriera mucosale [ 29 ] Cell-associated virus include cellule infettate che trasmettono l'infezione mediante fusione con cellule non infette recettore. Per mezzo di un saggio basato luciferasi, l'infettività residua di cellule libere virus (una T-tropico e una M-tropico) dopo il trattamento è stata quantificata nanoparticelle d'argento. Come mostrato in figura 3 (AB) , nanoparticelle d'argento pre-trattamento di HIV-1 e HIV-1 Bal IIIB ridotto l'infettività delle particelle virali dopo appena 5 minuti di esposizione. L'effetto aumentata dopo 60 minuti di esposizione (in particolare Bal), indicando che le nanoparticelle di argento agire direttamente sul virione, inattivandolo. Figura 3. virucida di nanoparticelle di argento contro M e T tropico HIV-1. Seriali diluizioni doppie di nanoparticelle di argento sono stati aggiunti a 10 5 TCID HIV-1 Bal (A) e HIV-1 IIIB 50 di (B) virus cell-free con 0,2-0,5 moi Dopo incubazione per 5 min e 60 min, le miscele sono state centrifugate per tre volte a 10.000 rpm, i fluidi supernatante rimosso e il pellet lavato tre volte. I pellet finali sono stati posti in piastre da 96 pozzetti con HeLa-CD4-LTR-β-gal cellule. Valutazione di HIV-1 è stata fatta con un saggio basato luciferasi. La percentuale di infettività residua dopo trattamento nanoparticelle d'argento è stata calcolata rispetto al controllo positivo del virus non trattato. Il saggio è stato eseguito in triplicato, i punti di dati rappresentano la media, e le linee continue sono curve di regressione lineare effettuata con il software SigmaPlot 10,0. Nanoparticelle d'argento sono efficaci anche contro la trasmissione di HIV-1 mediata da infezione cronica da PBMC e H9 (linea cellulare linfoide). Trasmissione era ridotto del 50%, anche quando entrambi i tipi cellulari sono stati trattati con le nanoparticelle per 1 min (Figura 4A-B ). Figura 4. trattamento di HIV-1 associata alla cellula virus. Cronicamente HIV-1infetti H9 (A) e PBMC (B) le cellule sono state incubate con seriali diluizioni doppie di nanoparticelle di argento per 1 min e 60 min. Cellule trattate sono state centrifugate, lavate tre volte con mezzo di coltura, e quindi aggiunto alla TZM-bl cellule. Valutazione di HIV-1 è stata fatta con un saggio basato luciferasi dopo 48 h. Il saggio è stato eseguito in triplicato, le barre di errore indicano la sem Discussione Nanoparticelle d'argento si è rivelato un agente antivirale contro l'HIV-1, ma il suo meccanismo d'azione non è stato completamente chiarito. E 'l'obiettivo principale gp120? Non nanoparticelle d'argento agiscono come inibitori d'ingresso? In questo studio, abbiamo studiato il meccanismo di azione antivirale di nanoparticelle di argento contro HIV-1. I nostri risultati rivelano, per la prima volta, che le nanoparticelle di argento esercitano attività anti-HIV in una fase iniziale della replicazione virale, probabilmente come agente virucida o inibitore ingresso del virus. Nessuna differenza significativa è stata trovata nelle attività antivirali di nanoparticelle d'argento contro i differenti ceppi resistenti ai farmaci (Tabella 1 ), per cui le mutazioni antiretrovirali ceppi di HIV che conferiscono resistenza non influenzano l'efficacia di nanoparticelle di argento. Questi risultati concordano inoltre con i risultati precedenti, in cui si è accertato che le nanoparticelle d'argento sono ad ampio spettro biocidi [ 30 , 31 ] ceppi di HIV-1 presenti nella popolazione umana può variare notevolmente la sua patogenicità, virulenza, e la sensibilità a particolari farmaci antiretrovirali [ 32 ] Il fatto che le nanoparticelle di argento inibiscono tale pannello varia di ceppi li rende un efficace agente ad ampio spettro contro HIV-1. Questa particolare proprietà può ridurre la probabilità di comparsa di resistenza e la successiva diffusione dell'infezione. Nanoparticelle di argento inibita una varietà di ceppi HIV-1 indipendentemente dalla loro tropismo (Tabella 1 ). Variazione gp120 tra ceppi di HIV è il fattore determinante delle diverse tropismo tra ceppi, con l'ansa V3 di gp120 riconoscere i recettori per le chemochine CXCR4 (T-tropico virus), CCR5 (M-tropico virus), o entrambi (dual-tropico virus) [ 33 ] Il fatto che le nanoparticelle di argento inibito tutti i ceppi testati indica che la modalità di azione non dipende questo determinante di tropismo cellulare. Elechiguerra et al. postulato che le nanoparticelle di argento subiscono interazione specifica con HIV-1 tramite legame preferenziale con gp120 [ 7 ] Se è così, allora i nostri risultati dimostrano che l'inibizione da nanoparticelle d'argento non dipende l'ansa V3, che ha una carica positiva netta che contribuisce al suo ruolo nella determinazione virale co-recettore tropismo [ 34 ] Poiché particelle di argento hanno una carica positiva superficie, l'ansa V3 non sarebbe loro sito preferito di interazione. Quindi, le nanoparticelle possono eventualmente agire come inibitori di attacco impedendo la gp120 CD4 interazione, piuttosto che come co-antagonisti che interferiscono con il contatto gp120-CXCR4/CCR5 [ 4 ] Per mezzo di un saggio di adsorbimento virale, è stato dimostrato che le nanoparticelle d'argento "meccanismo di azione anti-HIV è basata sulla inibizione delle fasi iniziali del ciclo di HIV-1. Inoltre, la gp120-acquisire dati ELISA (Figura 1B ), combinati con i risultati del saggio basato su cellule fusione (Figura 1A ), sostenuto l'ipotesi che le nanoparticelle di argento inibiscono HIV-1 bloccando l'ingresso del virus, in particolare la gp120-CD4 interazione. Le osservazioni effettuate in precedenza dall'analisi STEM sostenere questa idea, dal momento che le nanoparticelle d'argento sono stati visti per legare strutture proteiche distribuiti sulla membrana virale [ 7 ] Se nanoparticelle d'argento non si legano al loop V3, allora potrebbe preferenzialmente interagire con la cavità negativo di gp120 che si lega al CD4 [ 35 ] L'attrazione tra CD4 e gp120 è per lo più elettrostatico, con il fine primario di CD4 vincolanti in una tasca da incasso per gp120, facendo ampi contatti oltre ~ 800 Å 2 di superficie gp120 [ 36 ] Inoltre, nanoparticelle d'argento potrebbe interagire con i due legami disolfuro situati nella metà del carbossile HIV-1 gp120 glicoproteina, una zona che è stata implicata nel legame al recettore CD4 [ 37 ] Gli ioni argento legano ai gruppi sulfidrilici, che portano alla denaturazione proteica dalla riduzione dei legami disolfuro [ 38 ] Pertanto, ipotizziamo che le nanoparticelle d'argento non solo legarsi a gp120, ma anche modificare questa proteina virale di denaturazione suo disolfuro-legato dominio che si trova nella regione CD4 vincolante. Questo può essere visto in nostri risultati di capacità di nanoparticelle di argento 'a diminuire maggiormente infettività residua di particelle virali dopo 60 minuti di incubazione che dopo 5 minuti di incubazione (Figura 3 ). Poiché l'effetto antivirale di nanoparticelle d'argento aumenta con il tempo di incubazione, si può ipotizzare che nanoparticelle d'argento inizialmente legano gp120 manopole e quindi inibire l'infezione modificando irreversibilmente queste strutture virali. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per definire se le nanoparticelle d'argento interagire con la cavità con carica negativa e le due ponti disolfuro si trova nella regione di legame CD4 di gp120. Sviluppo di resistenza può essere un problema per i composti che colpiscono la busta a causa dell'alto tasso di sostituzioni nelle regioni variabili della proteina Env. Tuttavia, poiché le posizioni dei residui di cisteina, il pattern di legame disolfuro in gp120, e la capacità di gpl20 di legarsi al recettore CD4 virali sono altamente conservate tra isolati [ 39 ] lo sviluppo di resistenza a nanoparticelle d'argento sarebbe complicato. Confrontando l'effetto antivirale (misurata con l'indice terapeutico) di nanoparticelle di argento con due sali d'argento comunemente utilizzati (AGSD e AgNO 3), è stato osservato che gli ioni argento da soli sono meno efficienti di nanoparticelle di argento. Quindi, se osservato anti-HIV-1 di nanoparticelle di argento sarebbe solo essere dovuto a ioni d'argento presenti in soluzione delle nanoparticelle, l'indice terapeutico sarebbe stato inferiore. Attività elevata di nanoparticelle d'argento è suggerito per essere a causa della differenza specie si dissolvono a rilasciare Ag 0 (atomica) e Ag (ionica) i cluster, mentre sali d'argento Ag + + comunicato solo [ 40 ] Il tempo di addizione esperimenti ulteriormente confermato le nanoparticelle d'argento come inibitori d'ingresso (Figura 2 ). Inoltre, è stato rivelato che le nanoparticelle di argento hanno altri siti di intervento sul ciclo vitale del virus, oltre a fusione o voce. Dato che gli ioni argento possono complesso con gruppi donatori di elettroni contenenti zolfo, ossigeno, azoto o che sono normalmente presenti come tioli o fosfati di aminoacidi e acidi nucleici [ 41 ] che potrebbero inibire post-entry stadi di infezione da HIV-1 bloccando altre proteine di gp120, o riducendo la trascrizione inversa o tassi di trascrizione provirali direttamente vincolante per l'RNA o molecole di DNA. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato che le nanoparticelle di argento sopprimere l'espressione di TNF-α [ 42 ], che è una citochina che gioca un ruolo fondamentale in HIV-1 patogenesi incrementando HIV-1 di trascrizione [ 43 ] L'inibizione del TNF-α trascrizione attivati potrebbe anche essere un bersaglio per l'attività anti-HIV di nanoparticelle di argento. Avere un pannello varia di bersagli nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 rende nanoparticelle d'argento un agente che non è incline a contribuire alla comparsa di ceppi resistenti. Nanoparticelle d'argento si è rivelato virucida alla cella-free e associato alle cellule HIV-1, come giudicato da saggi di infettività virale (figure 3 e 4 ). Infettività dell'HIV è effettivamente rimossi a seguito di una breve esposizione del virus isolato a nanoparticelle d'argento. Trattamento delle nanoparticelle d'argento con infezione cronica cellule H9 + nonché umano PBMC + portato a infettività diminuito. Un virucida deve operare in modo rapido ed efficace nel prevenire l'infezione delle cellule bersaglio vulnerabili. Secondo Borkow et al. (1997), un agente ideale retrovirucidal dovrebbe agire direttamente sul virus, agire replica passaggi prima integrazione del DNA provirale nel genoma della cellula ospite infettata, essere assorbibili da cellule non infettate, al fine di fornire una barriera all'infezione da virus attivo residuo, ed essere efficace a concentrazioni facilmente ottenibili non citotossiche in vivo [ 44 ] le nanoparticelle d'argento agiscono direttamente sul virus nelle fasi che impediscono l'integrazione all'interno della cellula ospite, ma ulteriori studi di farmacocinetica, farmacodinamica, e tossicologici in modelli animali sono necessari per definire i parametri di sicurezza per l'uso di nanoparticelle d'argento come strumenti di prevenzione per l'HIV- 1 trasmissione. Conclusioni Infine, proponiamo che l'attività antivirale di nanoparticelle d'argento risultati dal loro inibizione dell'interazione tra gp120 e recettori di membrana cellulare bersaglio. According to our results, this mode of antiviral action allows silver nanoparticles to inhibit HIV-1 infection regardless of viral tropism or resistance profile, to bind to gp120 in a manner that prevents CD4-dependent virion binding, fusion, and infectivity, and to block HIV-1 cell-free and cell-associated infection, acting as a virucidal agent. In conclusion, silver nanoparticles are effective virucides as they inactivate HIV particles in a short period of time, exerting their activity at an early stage of viral replication (entry or fusion) and at post-entry stages. The data presented here contribute to a new and still largely unexplored area; the use of nanomaterials against specific targets of viral particles. Metodi Composti dell'argento Fabbricata commercialmente 30-50 nm nanoparticelle d'argento, la superficie rivestita di 0,2% in peso di PVP, sono stati utilizzati (Nanoamor, Houston, TX). Stock solutions of silver nanoparticles, silver sulfadiazine (Sigma-Aldrich) and silver nitrate (SigmaAldrich) were prepared in RPMI 1640 cell culture media. Following serial dilutions of the stock were made in culture media. Cells, HIV-1 isolates, and antiretrovirals HeLa-CD4-LTR-β-gal cells, MT-2 cells, HL2/3 cells, H9 cells, TZM-bl cells, HIV-1 HIV-1 Bal , HIV-1 BCF01 , HIV-1 96USSN20 IIIB , , AZT, Indinavir, 118-D-24, Tak-779, and Enfuvirtide were obtained through the AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH. HIV1 Eli and HIV-1 Beni are clinical isolates from patients from the Ruth Ben-Ari Institute of Clinical Immunology and AIDS Center, Israel. They were kindly donated by Gadi Borkow. Aliquots of cell-free culture viral supernatants were used as viral inocula. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy donors using Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. UC781 was kindly donated by Dr. Gadi Borkow. Cytotoxicity assays A stock solution of silver nanoparticles was two-fold diluted to desired concentrations in growth medium and subsequently added into 96-wells plates containing HeLa-CD4LTR-β-gal cells, PBMC and MT-2 cells (5 × 10 4 cells/well). Microtiter plates were incubated at 37°C in a 5% CO 2 air humidified atmosphere for a further 2 days. Assessments of cell viability were carried out using a CellTiter-Glo ® Viability Assay (Promega). The 50% cytotoxic concentration (CC ) was defined 50 Luminescent Cell based on the percentage cell survival relative to the positive control. HIV-1 infectivity inhibition assays Serial two-fold dilutions of silver nanoparticles were mixed with 10 5 TCID 50 of HIV-1 cell-free virus and added to HeLa-CD4-LTR-β-gal cells with a 0.2-0.5 multiplicity of infection [ 7 ] HIV-1 infection was assessed after two days of incubation by quantifying the activity of the β-galactosidase produced after infection with the BetaGlo Assay System (Promega). La concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) è definita in funzione della percentuale di inibizione infettività rispetto al controllo positivo. Virus adsorption assays In this assay the inhibitory effects of silver nanoparticles on virus adsorption to HeLaCD4-LTR-β-gal cells were measured as previously described [ 26 ] HeLa-CD4-LTR-βgal cells (5 × 10 4 cells/well) were incubated with HIV IIIB in the absence or presence of serial dilutions of silver nanoparticles and Enfuvirtide. After 2 h of incubation at 37°C, the cells were extensively washed with 1× PBS to remove the unadsorbed virus particles. Then the cells were incubated for 48 h, and the amount of viral infection was quantified with the Beta-Glo Assay System (Promega). Cell-based fusion assay HeLa-derived HL2/3 cells, which express the HIV-1 HXB2 Env, Tat, Gag, Rev, and Nef proteins, were co-cultured with HeLa-CD4-LTR-β-gal cells at a 1:1 cell density ratio (2.5 × 10 4 cells/well each) for 48 h in the absence or presence of two-fold dilutions of silver nanoparticles, UC781, AZT, and Indinavir in order to examine whether the compounds interfered with the binding process of HIV-1 Env and the CD4 receptor. Upon fusion of both cell lines, the Tat protein from HL2/3 cells activates βgalactosidase indicator gene expression in HeLa-CD4-LTR-β-gal cells [ 45 , 27 ] β-gal activity was quantified with the Beta-Glo Assay System (Promega). The percentage of inhibition of HL2/3-HeLa CD4 cell fusion was calculated with respect to the positive control of untreated cells. HIV-1 gp120/CD4 ELISA A gp120 capture ELISA (ImmunoDiagnostics, Inc., Woburn, MA) was used to test the inhibitory activity of silver nanoparticles against gp120-CD4 binding. Briefly, recombinant HIV-1 IIIB gp120 protein (100 ng/mL) was pre-incubated for 10 min in the absence or presence of serial two-fold dilutions of silver nanoparticles, and then added to a CD4-coated plate. The amount of captured gp120 was detected by peroxidaseconjugated murine anti-gp120 MAb. In separate experiments, gp120 (100 ng/mL) was added to CD4-coated plates pretreated with silver nanoparticles for a 10 min period. Before the addition of the gp120 protein, plates were washed three times to remove unbound silver nanoparticles [ 27 ] Time-of-addition experiments HeLa-CD4-LTR-β-gal cells were infected with 10 5 TCID 50 of HIV-1 cell-free virus with a 0.2-0.5 multiplicity of infection (moi). Silver nanoparticles (1 mg/mL), Tak-779 (fusion inhibitor, 2 μM), AZT (NRTI, 20 μM), Indinavir (protease inhibitor, 0.25 μM), and 118D-24 (integrase inhibitor, 100 μM) were then added at different times (0, 1, 2, 3 ... 12 h) after infection [ 3 , 31 ] Infection inhibition was quantified after 48 h by measuring β-gal activity with the Beta-Glo Assay System. Virucidal activity assay Serial two-fold dilutions of silver nanoparticles were added to 10 5 TCID and HIV-1 Bal 50 of HIV-1 IIIB cell-free virus with a 0.2-0.5 moi After incubation for 5 min and 60 min at room temperature, the mixtures were centrifuged three times at 10,000 rpm, the supernatant fluids removed, and the pellets washed three times. The final pellets were resuspended in DMEM and placed into 96-well plates with HeLa-CD4-LTR-β-gal cells. The cells were incubated in a 5% CO 2 humidified incubator at 37°C for 2 days. Assessment of HIV-1 infection was made with the Beta-Glo Assay System. The percentage of residual infectivity after silver nanoparticle treatment was calculated with respect to the positive control of untreated virus [ 31 ] Treatment of HIV-1 cell-associated virus Chronically HIV-1-infected PBMC and H9 cells were incubated with serial two-fold dilutions of silver nanoparticles for 1 min and 60 min. Treated cells were centrifuged, washed three times with cell culture media, and then added to TZM-bl cells. HIV-1 infection triggers, through the Tat protein, β-galactosidase expression in TZM-bl cells. β-gal activity was quantified with the Beta-Glo Assay System. Analisi statistica Graphs show values of the means ±standard deviations from three separate experiments, each of which was carried out in duplicate. Time-of-addition experiment graphs are nonlinear regression curves done with SigmaPlot 10.0 software. Conflitto di interessi Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco. Contributi degli autori Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale. HHL participated in the conception and experimental design of the in vitro HIV-1 manipulation and infectivity assays, in analysis and interpretation of the data, and in writing and revision of this report. NVAN. participated in the conception and design of the in vitro HIV-1 manipulation and infectivity assays, in analysis and interpretation of the data, and in writing and revision of this report. LIT participated in collection of in vitro HIV-1 manipulation and infectivity assays. CR-P. participated in the experimental design of this research. Ringraziamenti The following funding sources supported the data collection process: the Programa de Apoyo a la Investigacion en Ciencia y Tecnologia (PAICyT) of the Universidad Autonoma de Nuevo Leon, Mexico, and the Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACyT) of Mexico. Riferimenti 1. Joint United Nations Programme on HIV AIDS (UNAIDS): Report on the global 2. AIDS epidemic. Geneva, Switzerland 2008. Vercauteren J, Deforche K, Theys K, Debruyne M, Duque LM, Peres S, Carvalho AP, Mansinho K, Vandamme AM, Camacho R: The incidence of multidrug and full class resistance in HIV-1 infected patients is decreasing over time (2001-2006) in Portugal. Retrovirology 2008, 5 : 12. PubMed Abstract | 3. 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