Principi Di Base

Ingegneria animale:
principi di base
Sara Della Torre
Adriana Maggi Lab
08.11.11
Manipolazione genetica tradizionale
Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE
Cosa mancava per passare dalla
manipolazione genetica tradizionale a
quella moderna?
1967:
Scoperta della DNA ligasi
1968:
Scoperta degli enzimi di
restrizione
1972:
Avanzamenti nelle
tecniche di trasferimento
del DNA e nell’uso di
plasmidi
DNA
hybridization,
1961
Double helix
Watson and Crick, 1953
PCR
Kary Mullis, 1983
http://www.karymullis.com
Animale Transgenico:
animale nel cui genoma è stato inserito
uno o più frammenti di DNA esogeno
Transgene:
frammento di DNA esogeno integrato
stabilmente nel patrimonio genetico di
cellule animali o vegetali
Organismi utilizzati come modelli transgenici:
•
•
•
•
•
•
Arabadopsis (plant)
C. elegans
Fruit flies
Xenopus (rana)
Zebrafish
Topo
•
•
•
•
•
Ratto
Maiale
Pecora
Capra
Mucca
Tipi di transgene
• Piccole molecole di DNA ricombinante – geni o cDNA
legati a sequenze di DNA che permettono la corretta
espressione da parte della cellula ospite
• Construtti Reporter – promoter del gene desiderato
legato ad una cassetta di espressione la cui presenza può
essere facilmente rilevata; es.: GFP, lacZ, luciferasi
• Grandi molecole di DNA – yeast artificial chromosomes
(YACs) o bacterial artificial chromosomes (BACs)
Metodi di
Ingegneria animale
Metodi principali di ingegneria animale
Transgenesi standard
Gene targeting
Transgenesi condizionale
Clonazione
Transgenesi standard
Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata
• SCOPO: Guadagno di funzione
• CARATTERISTICA: inserzione random, casuale
Introduzione di una sequenza
di DNA purificata in uno dei
due pronuclei della cellula uovo
fecondata
Transgenesi standard
Work flow
1
2
3
4
• Preparazione degli oociti fecondati
• Preparazione dei costrutti
• Preparazione delle femmine “pesudogravide”
• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
• Screening della progenie
Transgenesi standard
Work flow: STEP1
1
• Preparazione degli oociti fecondati
Cocktail ormonale per la
superovulazione:
• PMS (pregnant mares serum)
• HCG (human chorionic
gonadotropin)
♀
Accoppiamento
Raccolta degli oociti
fecondati
♀
♀
♂
Transgenesi standard
Work flow: STEP2
2
• Preparazione dei costrutti
Costruzione del transgene
Amplificazione del
transgene
Purificazione del
transgene
Transgenesi standard
Work flow: STEP3
3
• Preparazione delle femmine “pesudogravide”
• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
Accoppiamento delle femmine
con maschio vasectomizzato
♀
♂ vasectomizzato
Transgenesi standard
Work flow: STEP3
3
• Preparazione delle femmine “pesudogravide”
• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
Transgenesi standard
Work flow: STEP3
3
• Preparazione delle femmine “pesudogravide”
• Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
Trasferimento delle uova fecondate
microiniettate con il gene di interesse
nell’utero di femmina pseudogravida
100-200X
♀ pseudogravida
Transgenesi standard
Work flow: STEP4
• Screening della progenie
4
Estrazione DNA dalle code
della progenie
Analisi tramite PCR
M
C
1
2
3
Analisi tramite Southern-blot
4
5
C
1
2
3
4
5
Transgenesi standard
Efficienza
Transgenesi standard
Applicazioni: animali come bioreattori
Transgenesi standard
Vantaggi e svantaggi
• Metodo più utilizzato per produrre topi transgenici.
• L’inserzione del transgene è casuale; non si sa dove si è
localizzato il transgene;
• Non si può regolare il numero di copie introdotte nel
pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per
l’integrazione;
• Bassa efficienza
Gene Targeting
Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
• SCOPO: perdita o modifica di funzione
• CARATTERISTICA: inserzione mirata
Gene Targeting
Meccanismo: ricombinazione omologa
AGGTGCCTGACT
X
TTCAGCCGATCCA
X
AGGTGCCTGACT
Gene inattivo
TTCAGCCGATCCA
AGGTGCCTGACT
Gene inattivo
TTCAGCCGATCCA
Gene Targeting
Gene Targeting
Meccanismo di selezione positiva e negativa
Gene
Targeting
Gene Targeting
Work flow
1
2
3
4
• Preparazione delle cellule ES pluripotenti
• Trasfezione
• Selezione delle cellule ES
• Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti
• Screening della progenie
Gene Targeting
Work flow: STEP1
1
• Preparazione delle cellule ES pluripotenti
• Trasfezione
Preparazione delle ES
pluripotenti dalla blastocisti
Preparazione del transgene
Gene non attivo
Tk - thymidine
kinase
Sequenze di
ricombinazione
Omologa
Neor – resistenza
alla Neomicina
Elettroporazione
Gene Targeting
Work flow: STEP2
2
• Selezione delle cellule ES
Trattamento con neomicina e
ganciclovir
No integrazione
Gene non attivo
Tk - thymidine
kinase
Sequenze di
ricombinazione
Omologa
Neor – resistenza
alla Neomicina
X
Integrazione sito-specifica (1/1000)
Integrazione random
X
Gene Targeting
Work flow: STEP3
3
• Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti
ES inserite in una
blastocisti di topo agouti
Gene Targeting
Work flow: STEP4
4
• Screening della progenie
Topo “chimera”
Gene
Targeting
Gene Targeting
Applicazioni
Mutagenesi MIRATA può avere come risultato:
• KNOCK-OUT: INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene
• KNOCK-IN: INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (modelli di
patologie con mutazioni puntiformi; geni reporter)
Gene Targeting
Nobel Prize 2007
Mario R. Capecchi
Oliver Smithies
Martin J. Evans
PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007
Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene modifications
in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting.”
Gene Targeting
Vantaggi e svantaggi
• RICOMBINAZIONE OMOLOGA
• L’inserzione del transgene è mirata
• Si conosce la localizzazione genica
dell’inserimento del transgene;
• Problemi: espressione tempo e spazio
specifica?
Limite KO costitutivi:
possibile mortalità degli omozigoti
durante lo sviluppo.
KO condizionali:
l’induzione della mutazione
tempo e tessuto specifica
Transgenesi condizionale
Il sistema Cre-loxP
Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase
particolare di sviluppo
• SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del
gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout
• CARATTERISTICA: inserzione mirata e specifica
KO condizionali
Il sistema Cre-loxP
Sistema di RICOMBINAZIONE del fago P1
CRE (cyclization recombination), ricombinasi specifica
LoxP (locus of X-over P1), locus di crossover
(2 seq palindrome di 13bp + regione centrale di 8nt)
Cre
KO condizionali
Il sistema Cre-loxP
Il sistema Cre-loxP
Ricombinazione omologa tra sequenze loxP
Il sistema Cre-loxP
Esempio di delezione tessuto specifica
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Il sistema Cre-loxP
Screening tramite PCR
Il sistema Cre-loxP
Il topo LERKO: esempio di delezione tessuto specifica
Della Torre et al, Cell Metabolism 2011
Il sistema Cre-loxP
Ricombinazione omologa tra sequenze loxP
Controllo dell’espressione genica:
• nello SPAZIO: utilizzo di un PROMOTORE TESSUTO SPECIFICO
• nel TEMPO: utilizzo di un PROMOTORE
 dipendente dallo STADIO di SVILUPPO
 INDUCIBILE
Il sistema Cre-loxP
Espressione genica programmabile
DELEZIONE
KO programmabile
INSERZIONE
K-IN programmabile
Il sistema CreER-loxP
Delezione spazio/tempo specifica
TEMPO
SPAZIO
CreER(T): proteine di fusione tra Cre e ER (recettore degli estrogeni)
“The perfect conditional transgenic mouse
should include the following criteria:
1. induced overexpression of the transgene should be
tightly controlled such that no leaky background
expression precludes the accurate analysis.
2. the inducing compound should be nontoxic and highly
specific for the target gene.
3. induction kinetics should be fast and expression levels
sufficiently high to produce a rapid and detectable effect.
4. the induced switch should be reversible so that defined
developmental periods or critical stages in disease can be
appropriately monitored.”
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Transgenesi condizionale
Controllo binario dell’espressione genica
3 principal events:
1) ligand-mediated activation of a transcriptional transactivator
2) DNA binding of the transactivator
3) transactivator-induced transcriptional activation
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Transgenesi condizionale
Controllo binario dell’espressione genica
CBS: cognate
binding site
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Transgenesi condizionale
Controllo binario dell’espressione genica
Effector mouse,
expressing a ligandinducible transcriptional
transactivator
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Responder mouse,
which has the capacity
to specifically express
a chosen transgene
upon stimulation by
the transactivator.
Il sistema TET-ON/TET-OFF
Sistema a 3 elementi:
• TeT-Repressor: repressore della trascrizione
• Tc/Dox: tetraciclina/doxyciclina
• TRE: tetracycline response element
Il sistema TET-OFF
TetR: tet repressor
VP16: transactivation domain
of herpes simplex virus
tTA
Tetraycline controlled
transactivator
.
Il sistema TET-OFF
tTA: tetraycline
controlled
transactivator
Tet-off system (tTA) will
activate expression in the
absence of its ligand
doxycycline.
Upon addition of DOX,
transcription of the gene
of interest is extinguished.
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
Il sistema TET-OFF
MHC-tTA/tetO-Ro1 mice
were obtained by crossing a
transgenic mouse line that
expresses Ro1 receptor under
the control of a tetO gene and
another mouse line
expressing tTA gene under the
regulation of a heart-specific
MHC promoter.
Il sistema TET-OFF
VANTAGGI
• Ben note proprietà della Tc/DOX: farmacocinetica, buona
distribuzione tissutale, bassa tossicità, capacità di attraversare
membrane cellulari
• Grande induzione in alcuni tessuti (anche 5 ordini di
grandezza)
SVANTAGGI
• Attività residua del promoter minimale tetO-CMV
• Tossicità cellulare del transattivatore
• Bassa sensitività alla DOX in alcuni tessuti
• Basse cinetiche di induzione in vivo
Il sistema TET-ON
rTetR: reverse tet repressor
VP16: transactivation domain
of herpes simplex virus
rtTA
Reverse tet-on
Tetraycline controlled
transactivator
.
Il sistema TET-ON
rtTA: reverse tet-on
tetraycline
controlled
transactivator
Addition of DOX to the
Tet-on system (rtTA) results
in transcriptional induction
of the gene of interest.
Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
.
Il sistema TET-ON vs TET-OFF
VANTAGGI
• Aumentata velocità di espressione del transgene: completa
attivazione in 1 ora, rispetto alle basse cinetiche di
attivazione del sistema tet-OFF (fino ad una settimana)
Il sistema TET-ON/TET-OFF
Il sistema TET-ON/TET-OFF
La Tc SPEGNE il GENE
La Tc ACCENDE il GENE
Il sistema TET-ON/TET-OFF
http://www.zmg.uni-mainz.de/tetmouse/
Clonazione
Trasferimento del nucleo di una cellula somatica
in un oocita anucleato
• SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di
interesse
• CARATTERISTICA: il materiale genetico viene
copiato in toto
Clonazione
I Cloni vengono ottenuti attraverso
Somatic Cell Nuclear Transfer
Clonazione
Clonazione
Clonazione
Possibili applicazioni: Trapianto con
cellule autologhe
Clonazione
Possibili applicazioni: trapianto con
cellule autologhe
Cellule staminali ADULTE
SCNT
Clonazione
Efficienza molto bassa & etica
Altre tecniche
Vettori retrovirali
Yac-transgenic mice
Vettori retrovirali
Integrazione di materiale genetico nella cellula ospite
• SCOPO: Guadagno di funzione
• CARATTERISTICA:
- inserzione random, casuale
- vettore max 8Kb
- l’animale puo’ risultare
contaminato da retrovirus delle
cellule helper
Vettore virale
Vantaggi
Svantaggi
Retrovirus
Capacità d'inserimento del gene,
integrazione stabile nel DNA dell'ospite,
elevati titoli di virus ricombinante, ampio
tropismo d'infettività, relativa facilità di
manipolazione del genoma virale
Difficoltà nel controllare l'infezione
virale, mancata infezione delle cellule
non in divisione, integrazione a caso nel
genoma dell'ospite
Lentivirus
Infezione delle cellule in divisione o meno,
espressione stabile del gene, elevata capacità
d'inserimento
Mutagenesi potenziale presenza di
sequenze proteiche regolatrici e
accessorie
Adenovirus
Elevati titoli di virus, alta espressione genica,
Risposte immuni alle proteine virali,
grande capacità d'inserimento, infezione di
nessuna integrazione nel genoma
cellule in divisione e non in divisione
dell'ospite, espressione genica transitoria
Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio Limitate capacità per i transgeni, difficile
tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, generazione di alti titoli virali, presenza di
bassa immunogenicità e non patogenicità
adenoviruds o herpevirus per la
moltiplicazione dei virus adeno-associati
Herpesvirus
Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta
capacità d'inserzione, tropismo naturale per
le cellule neuronali, seguita dalla produzione
di alti titoli virali
Poxvirus
Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione
Possibile effetto citopatico
di grandi framenti di DNA, alti livelli di di
espressione transgenica,, seguita da virus vivo
ricombinante
Infetta cellule in divisione o meno con
Difficoltà di controllare le linee cellulari
prevalenza per i linfociti B, alta capacità
d'inserimento
Virus di Epstein-Barr
Possibile tossicità, rischio di
ricombinazione, nessuna integrazione
virale nel DNA dell'ospite
Vettori retrovirali
Vettori retrovirali
Vantaggi e Svantaggi
• Alta efficienza di trasduzione
• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per
ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite
• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in
maniera casuale nel genoma)
• Molecole di DNA di dimensioni limitate (max 8 kb)
• Reazioni immunitarie
• Costi elevati
Yac-transgenic mice
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
• SCOPO: trasferire GENI di grandi dimensioni 3001000Kb.
• CARATTERISTICA: cromosoma artificiale che
contiene sequenze (telomeri, centromeri, origini di
replicazione) necessarie per la replicazione e la
preservazione nelle cellule del lievito.
Yac-transgenic mice
COME SI TRASFERISCE uno YAC nel TOPO?
• Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito senza parete) + cellule
ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito)
• Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione
nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si
frammenta)
• Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI
(vescicole lipidiche artificiali per fusione con membrana)
Yac-transgenic mice
Yac-transgenic mice
Esempi di applicazione
• YAC di 670Kb contenente il gene umano HPRT in cellule ES
di topo (funzione renale)
• YAC di 400Kb contenente il gene umano APP in cellule ES di
topo (codifica il precursore della proteina amiloide
Alzheimer)
• YAC contenente il gene umano catena leggera/pesante IgG
in topo (produzione di anticorpi)