Organismo
transgenico: organismo che porta
materiale genetico trasferito che è stato
inserito in un sito casuale del suo genoma.
Gene
targeting: la sostituzione o la
mutazione di un gene fornisce il mezzo per
creare ceppi di organismi “knockout” con
mutazioni praticamente in qualunque gene.
La
clonazione: la produzione di animali
geneticamente identici mediante
trasferimento del nucleo di una cellula
somatica adulta in un uovo non fecondato.
Metodo di
introduzione del
DNA
Cellula
Risultato
ricevente
Uso comune
nell’analisi di
espressione
genica
Tecnologia
Transgenica
Microiniezione nel
pronucleo
Uovo
fecondato
Integrazione
casuale del
transgene
Analisi di
guadagno di
funzione
Gene targeting
Ricombinazione
Embrione
omologa in cellule
allo stato
staminali embrionali di
blastocisti
Interruzione
o mutazione
del gene
bersaglio
Analisi di perdita
di funzione
Clonazione
mediante
trasferimento
nucleare
Trasferimento
dell’intero nucleo
Individuo
geneticament
e identico al
nucleo
donatore
Analisi della
riprogrammazione
del genoma
Uovo non
fecondato
enucleato
Tre
passaggi principali per creare topi
transgenici:
1. Microiniezione di DNA nel pronucleo di un
uovo fecondato di topo.
2. Impianto dell’embrione microiniettato in
una madre surrogata.
Analisi dei cuccioli della prima e successive
generazioni per stabilire l’integrazione
stabile e l’espressione del transgene.
Espressione
inducibile di
un transgene
targeting: 1990 Mario Capecchi topi
omozigoti per la perdita del protoncogene
int-1 con gravi anomalie dello sviluppo del
cervello e del cervelletto.
I cambiamenti mirati sono introdotti nella
sequenza della regione codificante o degli
elementi regolatori a monte del gene.
Sistemi di espressione inducibile e
condizionale per il gene bersaglio.
Gene
Dobbiamo conoscere la sequenza completa del
DNA del gene di interesse.
Si suddivide in cinque fasi principali:
1. costruzione del vettore di targeting;
2. gene targeting in cellule staminali embrionali
(ES);
3. selezione delle cellule in cui il gene targeting
ha avuto successo;
4. introduzione delle cellule ES modificate in
embrioni di topo ed impianto di in una madre
surrogata;
5.analisi ed incrocio dei topi chimerici.
Topo
knockout
(neo: neomicina fosfotransferasi; tk: timidina kinasi di herpesvirus)
Topi
knockin: espressione di transgeni o
modificazione del gene di interesse. Questo
approccio è usato spesso per la mutagenesi
sito-specifica in vivo. L’allele knockin
sostituisce la regione codificante dell’allele
endogeno mentre sono mantenuti gli
elementi di regolazione endogeni.
Topi knockdown: inattivazione o
modificazione dei livelli di espressione di un
gene, modificando gli elementi regolatori cisagenti. Si possono creare sostituzioni o
delezioni di singole basi. La regione
codificante del gene è intatta, quella
endogena.
I
geni knockout possono determinare letalità
embrionale necessità di mutazione
condizionale del gene bersaglio.
DNA ricombinasi sito-specifiche famiglia
Int delle ricombinasi uno dei membri più
noti è la ricombinasi Cre del batteriofago P1.
Cre riconosce specificamente un sito di 34 bp
nel genoma del P1, lox, e catalizza la
ricombinazione reciproca tra coppie di siti
lox.
Knockout
genetico
condizionale
La
clonazione si divide in quattro passaggi:
1. preparazione delle cellule donatrici;
2. enucleazione delle uova non fecondate;
3. trasferimento nucleare mediante fusione
cellulare;
4. impianto dell’embrione in una madre
surrogata ed analisi dei cloni.
Il trasferimento nucleare
somatico è inefficiente
Clonazione per ottenere
cellule staminali
