LE COLTURE “ IN VITRO” Per coltura in vitro s’intende l’applicazione biotecnologica in cui cellule, tessuti ed organi sono coltivati in un ambiente sterile ed artificiale ed in condizioni chimico­fisiche controllate. La tecnica delle colture in vitro nei vegetali ebbe inizio nei primi anni del 1900 ad opera di Haberlandt il quale, basandosi sul concetto di TOTIPOTENZA, riprese e ampliò la teoria cellulare formulata da Schwann e Schleiden 60 anni prima.
Le basi delle tecniche di coltura in vitro “ Totipotenza delle cellule vegetali” capacità di rigenerare un individuo completo partendo da cellule e/o tessuti differenziati. Le cellule mature, altamente specializzate, mostrano la capacità di regressione verso uno stato meristematico, indifferenziato. Processo di “ dedifferenziazione” . Processo di “ ri­differenziazione” . Pianta completa
Processo di “ ri­differenziazione” .
In adeguate condizioni colturali, la cellula vegetale embrionale può sviluppare la pianta intera • Specifici di coltura terreni • pH • Fonti di carbonio • Luce • Vitamine •Temperatura • Sorgenti di azoto In condizioni asettiche La coltura in vitro ha contribuito 1. A far luce sui processi biochimici, fisiologici e genetici che regolano lo sviluppo e la riproduzione delle piante 2. alla messa a punto di numerose tecniche, definite tecniche di colture “ in vitro” , che hanno permesso degli avanzamenti eccezionali nei processi della produzione vegetale
Tecniche di Coltura in vitro S’intendono tutte quelle tecniche utilizzate per mantenere e crescere tessuti e organi vegetali in coltura sterile. Tali tecniche sono integrative e non alternative alle tecniche tradizionali di propagazione clonale Micropropagazione Embriogenesi somatica Tecniche di rigenerazion e “ in vitro”
Coltura di protoplasti Coltura di cellule Coltura di callo coltivazione in vitro tessuti vegetali indifferenziati schema sintetico delle tappe che caratterizzano le colture in vitro sia su terreno solido che liquido
La tecnica delle colture “ in vitro” si caratterizza: •per le piccole dimensioni degli espianti; • la coltivazione in ambienti asettici; •le condizioni ambientali controllate; • il rispetto di alcuni fattori chimici come gli elementi minerali nutritivi e sostanze ormonali;
La tecnica delle colture “ in vitro” consente 1. riprodurre sistemi biologici complessi in ambienti ristretti e tempi limitati, in condizioni ambientali (luce, temperatura, umidità ecc.) e nutrizionali (composizione dei terreni di coltura) strettamente controllati. 2. avere sempre materiale vegetale disponibile, svincolando le osservazioni dalla stagionalità e dalla durata del ciclo vegetativo 3. Ottenere uno screening veloce di selezione del germoplasma 4. Manipolare il corredo genetico, favorendo l’introduzione di geni e ottenendo cloni transgenici resistenti 5. realizzare e gestire collezioni clonali garantendo la conservazione di prezioso patrimonio genetico
Micropropagazione Tecnica propagazione asessuata che permette, partendo da una pianta madre, di ottenere un numero elevato di cloni identici alla pianta di partenza Clone Insieme di individui geneticamente identici propagati esclusivamente attraverso via vegetativa da una singola pianta “… l’ arte e la
scienza di
moltiplicare le
piante in vitro...”
Si basa sulla capacità di un meristema (apice proliferativo di un germoglio o di una gemme dormiente) di accrescersi continuamente e di produrre un germoglio (1 apice 100­370 piante)
Vantaggi •Ottenere in tempi relativamente brevi un numero elevato di piante, capaci di essere stoccate in piccoli spazi •Ottenere materiale vegetativo esente da patogeni quali funghi e batteri •Ottenere materiale vegetativo uniforme e con una crescita più rapida e vigorosa • Svincolarsi dalle variazioni stagionali e dal tempo
•Applicare questa tecnica all’industria vivaistica per quelle specie che sono difficili da propagare • Risanare materiale da virus e allevare materiale virus­esente • Intenso e complesso lavoro manuale • Non esistono protocolli standard per tutte le specie Limiti
• Alcune specie sono recalcitranti • I cloni possono avere ancora costi eccesivi (5 volte rispetto a pianta convenzionale) La micropropagazione si sviluppa in quattro fasi successive: 1)raccolta del materiale vegetale della pianta madre; 2)Induzione stabilizzazione coltura e della 3) moltiplicazione del materiale vegetale; 4) radicazione; 5) acclimatazione.
RACCOLTA Germogli apicali
L’espianto può essere una gemma, un piccolo apice di germoglio di pochi centimetri, oppure quando si vogliono produrre piantine virus­ esenti, un meristema apicale di pochi mm (0.2­ 0.5 mm), prelevato con l’aiuto di uno stereo­ microscopio. Induzione e stabilizzazione Ottenere e stabilizzare una coltura asettica a partire da un espianto primario ex vitro , raccolto da una pianta coltivata in pieno campo o in serra. 1. Il materiale raccolto è sterilizzato con soluzioni di ipoclorito di sodio o di calcio, lasciandolo in immersione per un tempo differente a seconda del tipo di tessuto e/o di pianta 2. il materiale vegetale sterile è posto in un terreno di coltura agarizzato addizionato di nutrienti e di regolatori di crescita quali auxina (IBA, 6­BA) e citochinina (NAA, 2,4­ D), che permettono all’apice del germoglio di allungarsi e di sviluppare delle gemme laterali da cui si originano germogli avventizi. 3. La coltura è effettuata in camera di crescita in condizioni di temperatura ed illuminazione controllate
Che cosa significa terreno di coltura agarizzato addizionato di nutrienti? I mezzi di coltura sono costituiti da macro­ e microelementi e vitamine. I mezzi di coltura più utilizzati sono: MS (Murashige and Skoog), GD (Greshoff y Doy), H53 o Hm (Heller o Heller modificato) Agar è un agente gelificante che conferisce al WPM (Woody Plant Medium). substrato la compattezza necessaria per sostenere verticalmente le colture. Gli ormoni hanno la funzione di regolare e indirizzare i processi organogenetici o di differenziamento e la crescita degli espianti.
Moltiplicazione Ottenere da un germoglio in vitro (coltura “ in vitro” iniziale) numerosi germogli (sub­colture). Produzione esponenziale del materiale vegetale Il mezzo colturale è generalmente lo stesso di quello utilizzato per stabilizzare la coltura nella fase iniziale
Radicazione La radicazione è quella fase della micropropagazione in cui si induce il processo di rizogenesi in un germoglio “ in vitro” la radicazione è spontanea in alcune specie La radicazione deve essere indotta in altre specie. L’induzione avviene tramite l’esposizione della parte basale del germoglio a concentrazioni variabili di auxina ed in assenza di citochinina che ne inibisce la formazione
Acclimatazione È il processo attraverso il quale le “ plantule” ottenute in vitro sono trasferite in condizioni di coltura ex vitro . Stato di semi­eterotrofia ® stato di assoluta autotrofia. minore umidità maggiore intensità luminosa oscillazione termica mancanza di condizioni asettiche. Bassa percentuale di sopravvivenza
Per evitare l’alta mortalità delle piantine Le piantine, trasferite in apposti vasi contenenti torba e perlite, sono mantenute con la parte aerea coperta da un tunnel plastico (tunnel di acclimatazione), capace di garantire un’elevata umidità. 1. Le prime foglie si adattano a questo ambiente; 2. le foglie vecchie provvedono a costruirsi una cuticola cerosa superficiale che le protegge dalle perdite di acqua e dalla disidratazione Terminata questa fase, le piante possono essere trasferite in pieno campo
Micropropagazione di castagno
Germogli apicali
Fase di sterilizzazione
Ottimizzazione
della
concentrazione di
citochinina, del
periodo e della
porzione di
espianto (apicale,
mediano e basale)
Fase di
induzione
Sopravvivenza
plantule
Fase di
stabilizzazione
Fase di moltiplicazione
Fase di radicazione
Inizio della
radicazione
Radicazione con
carbone attivo
Fase di Acclimatazione
L’embriogenesi somatica
E’ un processo per il quale cellule somatiche possono produrre strutture simili ad embrioni, sviluppando tutti gli stadi embriologici, senza che si abbia fusione di gameti Differenze tra embrioni zigotici ed embrioni somatici
Un embrione vegetale zigotico, ottenuto attraverso la gamia è caratterizzato da due poli meristematici, rispettivamente radice e fusto, uniti mediante un sistema vascolare continuo Gli embrioni somatici sono morfologicamente e fisiologicamente identici agli embrioni zigotici (polo radicale e caulinare uniti da un sistema vascolare chiuso). Differiscono dagli embrioni zigotici dal punto di vista genetico. Presentano le stesse caratteristiche o corredo genetico della pianta donatrice, in quanto non è avvenuta la ricombinazione dei caratteri maschili e femminili che si realizza attraverso il processo di meiosi o gamia. In natura, l’esempio migliore di embriogenesi somatica è rappresentato dall’apomissia sporofitica a localizzazione nocellare come la poliembrionia del genere Citrus. 60 famiglie di vegetali tra cui vanno menzionate sicuramente le Leguminose, le Crucifere, le Cucurbitacee, le Graminacee, le Rosacee, ecc. L’embriogenesi somatica può essere indotta in modo artificiale attraverso l’espianto e la coltura in vitro di tessuti, organi o singole cellule.
L’embriogenesi somatica può manifestarsi attraverso uno schema di sviluppo diretto o indiretto Diretto: le nuove strutture morfogenetiche si differenziano dalle cellule somatiche dell’espianto Esistono nell’espianto di partenza cellule pre­embriogeniche (“ PEDC, Pre­embryogenic determined cells” ), cioè cellule che hanno acquisito la competenza embriogenica. l’embriogenesi diretta si attiva con il solo stimolo della divisione cellulare ed in assenza di apporto ormonale attraverso il semplice trasferimento dell’espianto in vitro Espianti Cellule poco differenziate Embrioni zigotici immaturo
Placenta con 8­10 ovuli vitali
ovulo preferenziale di un frutto dopo 40 giorni dall’antesi Indiretto: gli embrioni si originano soltanto dopo una fase intermedia di proliferazione cellulare di tipo non organizzato, il callo. Durante la callogenesi, alcune cellule acquisiscono la competenza embriogenia (“ IEDC, Induced embryogenic determined cells” ) mediante un processo di riprogrammazione epigenetica del destino cellulare Comparsa in coltura di masse proembriogeniche (“ PEM Embryogenic Masses” ) Pro­ Callo: cellule non differenziate ottenute da organi con tessuti ben differenziati (porzioni d foglia, di cotiledoni, ecc.) Appropriati stimoli fisico­chimici: composizione ormonale
La micropropagazione mediante embriogenesi somatica avviene in diverse tappe 1) Raccolta dell’espianto 2) Induzione all’embriogenesi 3) mantenimento o proliferazione delle colture embriogeniche, 4) maturazione, 5) germinazione e conversione a plantula 6) Acclimatazione
Raccolta dell’espianto
Il tipo di espianto maggiormente utilizzato per l’induzione all’embriogenesi somatica sono gli embrioni zigotici maturi o immaturi, o parti di giovani piante che presentano una minor differenziazione dei suoi tessuti Fase di induzione Si tratta di indurre un cambio di direzione nel programma di sviluppo morfologico delle cellule dell’espianto che produrranno gli embrioni somatici 1. Induzione minore o permissivo: le cellule sono poco differenziate e si induce una risposta dello sviluppo già predeterminata terreno di coltura semplice, senza regolatori di crescita
2. Induzione maggiore o direttivo: cellule presentano un elevato grado di differenziazione e quindi si richiede un cambio della competenza Periodo di esposizione a una auxina esogena, che promuova la crescita del callo L’auxina più utilizzata è il 2,4­diclorofenoxiacetico (2,4 D), seguito da NAA, e in alcuni casi anche AIB e IAA
Sia per l’induzione diretta sia per quella indiretta (callo), la fonte di azoto svolge un ruolo importante nell’induzione di embrioni somatici poiché questi non presentano un sistema enzimatico attivo per ridurre il nitrato ad ammonio. Idrolizzato di Caseina
Fase di mantenimento o proliferazione Le cellule indotte all’embriogenesi mediante via diretta (ovuli o cellule non differenziate) o indiretta (masse pro­embriogeniche da callo), sono allevati (mantenuti) in un sistema colturale “ in vitro” per la produzione e la proliferazione degli embrioni Via diretta •Numero embrioni dipende dalle dimensioni dell’espianto •Embrioni non maturi producono nuovi embrioni (embriogenesi ripetitiva) •Tale processo si favorisce aggiungendo auxina al mezzo colturale Via indiretta •Insieme di embrioni somatici derivano dalla massa pro­ embriogenica •Tali masse proembriogeniche, coltivate in un terreno addizionato con auxina, non sviluppano embrioni somatici maturi.
Fase di maturazione Fase durante la quale avviene l’espansione cellulare e l’accumulo delle sostanze di riserva negli embrioni non maturi. Processo chiave per il normale sviluppo degli embrioni, poiché i composti di riserva saranno utilizzati dall’embrione durante la germinazione per passare ad uno stato di autotrofia Trattamenti con acido abscissico (ABA) per ridurre la germinazione precoce degli embrioni
Fase di germinazione e di conversione a plantula Fase durante la quale gli embrioni maturi allungano la radice e l’ipocotile Gli embrioni, apparentemente maturi e ben formati, possono avere difficoltà a germinare (periodo prolungato di esposizione all’ABA) Screening de visu degli embrioni maturi per individuare quelli capaci di sviluppare una pianta. I criteri di scelta si basano su: 1. Grandezza 2. definita e chiara bipolarità 3. colore opaco che indica la presenza di riserva di amido 4. cotiledoni ben definiti di colore verde 5. radichetta pronunciata
Per superare la dormienza ad opera dell’ABA, gli embrioni maturi sono sottoposti ad un trattamento prima della germinazione: disseccamento, esposizione a 2­4°C La fase di germinazione prevede l’aggiunta al mezzo colturale di gibberellina
Induzione
Conversione
Maturazione
Proliferazione
Vantaggi dell’embriogenesi somatica 1. L’embrione somatico essendo un propagulo completo caratterizzato da un meristema radicale e caulinare, elimina la necessità di una tappa del processo di micropropagazione che è la fase di induzione al radicamento e il successivo allungamento del fusto 2. La frequenza di rigenerazione è molto elevata (alto numero di piantine) 3. L’embriogenesi somatica rappresenta uno dei metodi di ringiovanimento completo di alberi maturi 4. Gli embrioni somatici sono un materiale ideale per gli studi dei processi biochimici e molecolari implicati nella embriogenesi 5. L’embriogenesi somatica permette l’applicazione di tecniche di crioconservazione, creazione di semi artificiali e trasformazione genetica
Svantaggi della rigenerazione per via “ embriogenesi somatica” 1. Gli embrioni somatici presentano frequenti anomalie morfologiche (numero, dimensioni e forma dei cotiledoni), e fisiologiche che limita il loro normale sviluppo in piante complete . 2. La difficoltà di iniziare la coltura embriogenetica a partire da materiale maturo. 3. La difficoltà di controllare la sincronizzazione della coltura embriogenetica che non permette una manipolazione ottimale degli embrioni
Applicazioni future dell’embriogenesi somatica 1. Propagazione in massa di specie legnose­forestali Grazie all’enorme potenziale di rigenerazione (Olivo, noce, conifere) 2. Conservazione del germoplasma tramite tecnica di frigo­consevazione in vitro e la crioconservazione •Mantenimento in azoto liquido (­196oC) di cellule o di embrioni somatici permetterà la loro conservazione per un lungo periodo senza che si abbia la perdita della capacità embriogenica; •Creare banche di germoplasmi ad alto rischio di estinzione 3. Produzione di semi sintetici (embrioni somatici incapsulati in alginato di sodio o di calcio) 4. Gli embrioni somatici rappresentano un ottimo materiale per la trasformazione genetica
Fattori che influenzano le tecniche di micropropagazione e di embriogenesi somatica 1. Età della pianta La capacità di propagazione (capacità di moltiplicazione e radicazione per la micropropagazione; induzione all’embriogenesi per e.s.) decresce all’aumentare dell’età della pianta. quanto più è giovane la pianta madre, tanto più facile sarà la sua micropropagazione e l’induzione all’embriogenesi somatica 2. Condizioni generali della pianta donatrice Lo stato di nutrizione, stato fitosanitario, esposizione al sole o all’ombra) della pianta donatrice possono influire sulla risposta morfogenica Espianti prelevati da piante cresciute in pieno campo hanno una minore capacità di propagazione rispetto a quelli prelevati da piante allevate in camere di crescita
3. Stadio fenologico della pianta Piena attività vegetativa della pianta, in cui è massima l’attività di divisione e distensione cellulare degli apici vegetativi (micropropagazione) Raccolta dei “ frutti” subito dopo l’antesi (embriogenesi somatica) 4. Composizione chimica ed ormonale dei mezzi di coltura Auxine e citochinine sono i più importanti regolatori della crescita e dello sviluppo nella coltura di tessuti e organi vegetali
