Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2
annuncio pubblicitario
Blanca M. Fernandez Rodriguez Lavoro di diploma Formazione Tecnico in Analisi Biomediche SSS Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico Lavoro svolto presso Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona 2007 1 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico Indice 1. Riassunto, Abstract 3 2. Introduzione 4 3. I funghi 5 4. La classificazione 6 5. Gli aspetti clinici 7 6. Le regioni ITS1 e ITS2 8 7. Materiali e metodi 10 7.1. Campioni 7.2. Coltura 7.3. Estrazione 7.4. PCR 7.5. Seminested PCR 7.6. Controlli 7.7. Elettroforesi 7.8. Purificazione dei prodotti PCR 7.9. Reazione di sequenza 7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza 7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica 7.12. Analisi delle sequenze 7.13. Costruzione dell’albero filogenetico 8. Risultati 8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA 8.2. Coltivazione su piastra 8.3. Estrazione e amplificazione 8.4. Sequenze 8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante analisi delle sequenze 8.6. Albero filogenetico 10 10 10 11 12 12 13 13 13 13 14 14 14 15 15 17 17 18 18 19 9. Discussione 27 10. Bibliografia 28 2 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 11. Allegati 11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti, Zigomiceti, e basidiomiceti 11.2. Lista dei campioni 11.3. Lista delle sequenze di riferimento 11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro 11.5. Albero filogenetico 11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras, delle specie usate in questo lavoro 30 31 34 37 39 42 44 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 3 1. Riassunto Abstract Il numero delle micosi é in continuo aumento soprattutto nei pazienti ospedalizzati ed immunocompremessi. Una rapida ed accurata diagnosi permette d’iniziare una terapia antimicotica adeguata. Le tecniche diagnostiche comunemente usate in laboratorio per l’identificazione dei miceti sono tecniche biochimiche , sierologiche e fenotipiche. Purtroppo queste tecniche prevedono tempi d’esecuzione lunghi e non sempre forniscono risultati accurati nell’identificazione della specie. Per questo motivo l’Istituto Cantonale di Microbiologia ha deciso di testare come tecnica d’analisi per l’identificazione delle muffe patogene l’utilizzo della polymerase chain reaction (PCR). Una tecnica che si presenta con un’alta sensibilità e specificità. In questo lavoro abbiamo sfruttato la PCR per ottenere le sequenze di una regione altamente variabile presente nel DNA ribosomale, e regioni ITS1 e ITS2, mediante l’utilizzo di primers universali (ITS1, ITS4).Le sequenze ottenute, appartenenti a 56 ceppi di 36 specie diverse, sono state confrontate con le sequenze presenti nella GenBank (NCBI).L’identificazione genotipica che questa ha fornito é stata confrontata con l’identificazione morfologica. Le due tecniche d’analisi mostrano un’identificazione identica a livello di genere per il 98,2% e a livello di specie per il 44,6% . L’identificazione fenotipica é risultata più specifica a livello di specie per il 21,4%. Mentre l’identificazione genotipica é risultata più discriminante solamente per il 7,14%. Il 12,5% dei ceppi analizzati ha mostrato dei risultati discrepanti fra le due tecniche d’identificazione. In conclusione si può dire che l’analisi delle diverse specie di funghi mediante l’utilizzo delle sequenze ITS non può essere un valido sostitutivo dell’identificazione morfologica . Invasive fungal diseases are increasing in immunocompromised and hospitalized patients. Early detection and accurate identification of the fungi permits a rapid and optimal initiation of antifungal therapy. The diagnosis of mould is generally based on biochemical, serological and phenotype identification. However these methods take time and do not always lead to a precise identification of the microorganism. For this reason, the Cantonal Institute of Microbiology decided to test a molecular biological technique, the polymerase chain reaction (PCR), as identification procedure. In fact PCR technology promises more rapid and specific identification. In this work we have evaluated the feasibility of the sequence analysis of the internal transcribed spacer regions (ITS) of the ribosomal DNA for the identification of pathological moulds. The ITS sequences were obtained by amplification of the ITS region (ITS1-5,8SITS2) with universal fungal primers (ITS1, ITS4). The sequence analyses of 56 strains for a total of 36 different species were compared to reference data available at the GenBank database, and the genotypic identification was compared with phenotype identification. For 98,2% of the strains, both methods gave concordant results at the genus level. Of these, 44,6% were assigned to the identical species. Phenotypic criteria were more specific in 21,4% and genotypic criteria were more discriminative for 7,14%. 12,5% of the strains showed discrepant results. We can therefore conclude that identification of medically important moulds at the level of species by ITS sequencing is not a viable alternative to conventional identification methods. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 4 2. Introduzione Il numero delle infezioni fungine é in continuo aumento soprattutto nei pazienti immunocompromess [1]. L’identificazione precisa delle diverse specie nella diagnostica delle micosi gioca dunque un ruolo molto importante per l’orientamento del trattamento medico. Prendiamo per esempio il genere Scedosporium dove il Scedosporium apiospermun é sensibile ad una determinata gamma di antimicotici mentre ill Scedosporium prolificans si mostra resistente alla maggior parte di essi [2]. Oppure consideriamo il genere degli Aspergillus che comprendente più di 180 specie diverse, ma la principale causa di problemi broncopolmonari, delle cheratiti, delle sinusiti, sopratutto nei pazienti immunocompromessi, sono unicamente l’Aspergillus fumigatus, l’A. flavus e A. terreus [3, 4]. L’identificazione delle diverse specie fungine può essere effettuata con l’analisi diretta al microscopio ottico del campione, mediante la coltura su piastra e la differenziazione morfologica delle diverse strutture, con test sierologici per la ricerca di antigeni o anticorpi e test biochimici. Oggi queste tecniche non sono più soddisfacenti soprattutto a livello diagnostico poiché sono tecniche laboriose, poco standardizzabili e con tempi di esecuzione molto lunghi in particolar modo per quanto riguarda la coltura su piastra i qui tempi variano da specie a specie, ma richiedono un minimo di 48h d’incubazione [2]. In oltre nella maggior parte dei casi queste tecniche non forniscono risultati accurati poiché presentano una bassa specificità nell’identificazione della specie [2]. L’utilizzo di tecniche di biologiamolecolare Figura 1. Tempi di crescita su piastra per permette invece un’identificazione rapida e specifica lieviti, muffe e funghi dimorfi [20] con una sensibilità maggiore. Molte pubblicazioni propongono infatti varie tecniche fra le quali troviamo la PCR, la Real-time PCR, la PCR-Elisa, la RFLP (Restriction Fragment Polymorfism) ecc. [5, 6, 7, 8, 21]. In questo lavoro si é deciso di testate come tecnica d’analisi per l’identificazione delle diverse specie di muffe l’amplificazione mediante la PCR della regione altamente variabile ITS1 e ITS2 presente nel DNA ribosomiale. Studi precedenti propongono l’utilizzo dei geni ribosomali poiché si presentano in più copie all’interno del genoma e mostrano regioni conservate, come per esempio i geni 18S, 28S e 5.8S comuni a tutti i funghi, e delle regioni altamente variabili fra le differenti specie, come le regioni ITS. Queste regioni variabili sono quindi sfruttabili per la classificazione filogenetica e dunque anche per un’identificazione a livello di specie necessaria per la diagnostica.[1, 3, 9, 10, 11]. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 5 3. I Funghi Gli organismi che costituiscono il regno dei funghi sono organismi eucarioti, non fotosintetici, aerobi o anaerobi, pluricellulari o unicellulari. Possono presentarsi come lieviti, muffe o funghi dimorfi, essere saprofiti, parassiti oppure vivere in simbiosi con l’organismo ospite. Sono provvisti di una parete cellulare rigida, che può essere pluristratificata, composta da cellulosa, emicellulosa o chitina e presentano un citoplasma spesso multinucleato. I lieviti sono organismi unicellulari ovali di 3-5 µm di diametro; si riproducono principalmente per gemmazione e possono formare delle pseudoife. Le muffe sono funghi pluricellulari caratterizzati da un elemento di crescita tubulare ramificato detto ifa. L’ifa può essere suddivisa da setti parietali o no: ifa settata o cenocitica. Dal suo sviluppo per estensione apicale e laterale viene a formarsi il micelio (o tallo). Il micelio viene detto vegetativo se aderisce e penetra nel terreno di coltura o nel tessuto ospite, riproduttivo o aereo se le sue ife si proiettano sulla superficie del terreno e portano le cellule riproduttive o spore. I fungi dimorfi sono definiti come miceti in grado di presentarsi sotto forma di lieviti o muffe al variare delle condizioni ambientali [4, 12]. I funghi si riproducono in maniera asessuata o in maniera sessuata attraverso la produzione di spore. I due tipi di riproduzione possono alternasi durante il ciclo vitale. A dipendenza dello stadio in qui si trova l’organismo, se nella forma telomorfa (riproduzione sessuata) o nella forma anamorfa (riproduzione asessuata) possono prende una diversa nomenclatura. La specie Aspergillus nidulans, per esempio, nella sua forma telomorfa prende il nome di Emericella nidulans (vedi allegato 11.4). Se alla forma anamorfa é stata attribuita la stessa forma telomorfa allora si parla si sinamorfismo [13]. Per molte specie e sconosciuta la forma telomorfa, perché l’organismo non é in grado di riprodursi sessualmente oppure perché non é stata ancora identificata. Questi fungi vengono classificati in un gruppo tassonomico artificiale: i Deuteromiceti o funghi imperfetti. Oggigiorno però, mediante l’impiego di analisi molecolari la maggior parte dei Deuteromiceti é assegnata alla divisione degli Ascomiceti ed una piccola parte ai Basidiomiceti [5]. La produzione assesuata avviene per scissione, gemmazione o formazione di spore. Queste a loro volta possono essere prodotte per frammentazione e distacco di una parte della ifa oppure per sporulazione. Le spore possono essere di tipo diverso, fra le più frequenti troviamo le tallospore, formate per trasformazione di elementi preesistenti del tallo, oppure le conidiospore, prodotte da ife specializzate. La riproduzione sessuata prevede invece la plasmogamia e la cariogamia. Nei zigomiceti due ife riproduttive si uniscono formando una zigospora all’interno della quale si formerà lo zigote che in seguito a meiosi verrà liberato ed inizierà la fase asessuata. Nei ascomiceti gli organi riproduttivi si uniscono formando l’asco contenente le ascospore. Nei Basidiomiceti il corpo fruttifero produce numerosi basidi ciascuno dei quali svilluppa 4 spore [14]. (vedi tavole 11.1) Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 6 4. La classificazione La classificazione odierna prevede quattro divisioni del regno dei funghi: Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota [13]. Le diverse specie sono state raggruppate in base alle caratteristiche morfologiche del tallo e delle strutture riproduttive. Dal 1970, per ovviare alle differenti classificazioni presenti in letteratura dovute soprattutto alle nomenclature diverse attribuite alla stessa specie, si é cercato d’introdurre fra i criteri che definiscono una specie l’analisi del DNA. Il regno dei funghi é comunque in continua evoluzione con ca. 20 nuove specie all’anno [5, 9, 15]. Tabella 1. Divisione del regno dei funghi con alcune classi ed ordini di intersesse medico [13] Ascomicota Basidiomycota Zygomicota Archiascomycetes Pneumocystidiales Hymenomycetes Agaricales Stereales Tremellales Zygomycetes Entomophthorales Mortierellales Mucorales Hemiascomycetes Saccharomycetales Euascomycetes Chaetothyriales Clavicipitales Dothideales Eurotiales Hypocreales Leotiales Microascales Onygenales Ophiostomatales Pezizales Phyllachorales Pleosporales Sordariales Chytridiomycota Urediniomycetes Sporidiales Ustilaginomycetes Microstomatales Tilletiales Ustilaginales Gli Ascomiceti rappresentano il più grande gruppo tassonomico del regno dei funghi. Raggruppano il 50% di tutte le specie fungine e aprossimativamente l’80% dei funghi patogeni. Sono caratterizzati da una riproduzione asessuata mediante la formazione di conidiospore e da una riproduzione sessuata mediante la formazione di aschi contenenti le ascospore. I Basisiomiceti comprendono circa 23'000 specie sopratutto funghi a cappello mangerecci. Sono caratterizzati dalla formazione di copri fruttiferi contenenti numerosi basidi ciascuno dei quali sviluppa 4 spore durante la riproduzione sessuata. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 7 Fra i Zigomiceti, caratterizzati dalla formazione di zigospore, troviamo 1% di tutte le specie del regno dei funghi, molti dei quali responsabili di infezioni cutanee e gastrointestinali nell’uomo. In fine i Chitridiomiceti rappresentano i funghi meno sviluppati, caratterizzati sopratutto da una struttura unicellulare e da una riproduzione asessuata mediante la formazione di zoospore [ 4, 9]. (vedi tavole 11.1) 5. Gli aspetti clinici Su più di 10'000 specie descritte all’incirca 100 sono coinvolte in micosi umane o animali. Le micosi possono essere superficiali se colpiscono solo i peli e gli strati più esterni dell’epidermide senza provocare dunque una risposta immunitaria [13]. Vengono comunemente denominate con il nome di tigna o piedra [4]. Le micosi cutanee coinvolgono invece l’epidermide, i capelli, le unghie e le mucose esterne come per esempio quelle dei genitali [13]. Queste micosi sono causate sopratutto dai generi Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton [4]. Le micosi sottocutanee interessano cute, sottocute, muscoli e ossa. La malattia si sviluppa lentamente e può impiegare anche degli anni dopo la penetrazione per raggiungere il tessuto sotto cutaneo [4]. Ci sono in fine le micosi profonde o sistemiche che colpiscono gli organi interni ed i visceri. Sono causate sopratutto da funghi dimorfi penetrati all’interno dell’organismo per inalazione delle spore, in seguito ad operazioni chirurgiche, tramite l’utilizzo di cateteri, ecc.. L’infezione nasce con una lesione polmonare che può diventare cronica ed entrare nel sistema sanguineo fino a raggiungere altri organi [4, 13,]. Tabella 2. Alcuni miceti d’importanza medica [4] Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 8 Troviamo poi le infezioni causate da fungi opportunisti come per esempio l’aspergillosi causate soprattutto dall’ Aspergillus fumigatus, un fungo presente ovunque in natura che penetra all’interno dell’organismo mediante l’inalazione delle spore causando problemi allergici e broncopolmonari. Un’altro esempio di infezioni da funghi opportunisti sono le candidosi, causate dalla Candida albicans comunemente presente nella flora normale delle nostre mucose che prende il sopravvento quando questa viene alterata. Queste micosi colpiscono sopratutto i neonati, i pazienti immunocompromessi in seguito a neoplasie, leucemie, chemioterapie, AIDS oppure pazienti in cure intensive, gli ustionati ed inseguito all’utilizzo prolungato di antibiotici [3,10,13]. 6. Le regioni ITS1 e ITS2 I ribosomi degli organismi eucariotici sono formati da due subunità strutturali, 60S e 40S, costituite da frammenti di rRNA e proteine che prendono il nome dalla misura della loro velocità di sedimentazione, in seguito a centrifugazione, definita in unità di Svedberg (S). La subunità 60S presenta i frammenti di rRNA 28S, chiamato anche LSU (large subunit), 5,8S e 5S e circa 50 proteine. La subunità 40S presenta un unico frammento di RNA 18S, chiamato anche SSU (small subunit) e circa 33 proteine. Al momento della traduzione del mRNA queste subunità si uniranno per formare i ribosomi 80S [16]. Tabella 3. Struttura dei ribosomi procarioti ed eucarioti [16] PROCARIOTI EUCARIOTI 70 S 80 S Subunità rRNA Proteine 50S 23S + 5S ~ 31 30S 16S ~ 21 60S 28S + 5,8S + 5S ~ 50 40S 18S ~ 33 I geni che codificano per i diversi frammenti di rRNA sono geni ripetuti, costituenti dell’organizzatore nucleolare, NOR (Nucleolus organizer region). All’interno del cromosoma sono raggruppati in unità strutturali separate da sequenze spaziatrici non codificanti, NTS (nontranscribed spacer) o IGS (intergenic spacer). Ogni unità strutturale é costituita da un spaziatore trascritto esterno, ETS (external transcribed spacer), situato all’estremità 3’ del gene 18S, due spaziatori trascritti interni, ITS (internal transcribed spacer), situati rispettivamente: l’ITS1 fra il gene 18S ed il gene 5,8S, l’ITS2 tra il gene 5,8S e l’estremità 3’ del gene 28S ed in fine il gene 5S separato dal gene 28S da una sequenza spaziatrice non codificante. I geni 18S, 5,8S e 28S verranno trascritti dalla DNA polimerasi I in un pre-rRNA 45S che in seguito a maturazione tramite eliminazione delle sequenze spaziatrici ETS ed ITS formerà i rispettivi frammenti di rRNA. Il gene 5S verrà transcritto dalla DNA polimerasi III nel suo corrispettivo rRNA.[6, 9, 17] Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico Figura 2. Struttura dei geni ribosomali degli organismi eucarioti 9 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 10 7. Materiali e metodi 7.1. Campioni I diversi ceppi di fungi usati per questo lavoro provengono da una raccolta interna all’ICM effettuata dal 1995 al 2005. La raccolta comprende ceppi ottenuti da campioni clinici, ceppi provenienti da corsi di aggiornamento effettuati presso la BioMérieux e ceppi provenienti da controlli di qualità della NEQAS (National External Quality assesment Service, Regno Unito), tutti identificati morfologicamente all’interno dell’istituto. I campioni sono conservati a temperatura ambiente in acqua sterile. 7.2. Coltura I ceppi sono stati coltivati su piastre di Petri, contenenti 25 ml di agar Sabouraud Cloramfenicolo (SAB CHL-D, bioMérieux, Svizzera), ed incubati a 37°C. 7.3. Estrazione Per l’estrazione del DNA sono state testate due metodiche differenti previste per il mini kit DNeasy Plant (Metodica 1) e per il kit QIAamp DNA extraction della QIAGEN (QIAGEN, Svizzera) (Metodica 2). Le due metodiche presentano una versione modificata dei processi di lisi previsti per i protocolli originali. Metodica 1 Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura e depositarla in una provetta Eppendorf. Aggiungere ca. 1,5 ml di azoto liquido ed attendere per ca. 30 s fino a completa evaporazione dell’azoto. Mediante l’utilizzo di un pestello, schiacciare il micelio congelato fino a ridurlo in una polvere fine. Aggiungere 400 µl di tampone AP1 e 4µl di RNase A (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera (vedi anche reagenti seguenti)) e vortexare vigorosamente. Incubare il tutto per 10 min a 65°C miscelando 2 o tre volte durante l’incubazione. Aggiungere 130 µl di tampone AP2 ed incubare per altri 5 min al freddo, immergendo le provette Eppendorf in un contenitore con ghiaccio. Centrifugare il lisato per 5 min a 20'000 x g e trasferire il sovranatante in una QIAshedder Mini spin column (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera). Centrifugare per 2 min a 20'000 x g e aggiungere 795 µl di tampone AP3/E. Pipettare 650 µl della soluzione in una DNeasy Mini spin column (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Ripetere il passaggio precedente con la rimanente quantità di soluzione. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 11 Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta, aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio AW e centrifugare per 1 min a 6'000 x g . Ripetere l’operazione e centrifugare 2 min a 20'000 x g. Eluire il DNA con 200 µl di tampone AE. Metodica 2 Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura ed incubarla per 10 min a 98°C in 200 µl di soluzione di lisi contenente 5 µl di NaOH 1M, 20 µl SDS al 5%, e 175µl H2O. Neutralizzare la soluzione con 200 µl di HCl 25 mM. Aggiungere 400 µl di tampone di lisi AL (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera (vedi anche reagenti seguenti)) ed incubare per altri 10 min a 98°C [7]. Aggiungere 400 µl di etanolo al 100% e centrifugare per 5 sec a 20'000 x g. Caricare 600 µl del supernatante su una colonnina DNA Mini spin (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta ed aggiungere 500µl di soluzione di lavaggio AW1. Centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Riposizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta ed aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio AW2 . Centrifugare per 3 min a 20'000 x g. Effettuare un’ulteriore centrifugazione per 1 min a 20'000 x g per asciugare completamente la membrana della colonnina. Eluire il DNA con 200 µl di tampone di eluizione AE. 7.4. PCR La PCR prevede l’amplificazione della regione ITS che comprende i geni spaziatori non codificanti ITS1 e ITS2 ed il gene 5,8S, mediante l’utilizzo del forward primer ITS1 ed il revers primer ITS4 (Microsynth, CH) [3]. ITS1: ITS4: 5’- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G -3’ 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’ 19 bp 20 bp Il mix di reazione per un campione contiene 28,65 µl H2O molecular grade (FLUKA, Svizzera), 5 µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP, dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera), 1µl ITS1, 1µl ITS4 10 µM (Microsynth, Svizzera), 0,1 µl UNG (1U/µl)(Uracil DNA Glicosilasi, Roche, Svizzera) e 10 µl di DNA estratto. La reazione d’amplificazione é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700, USA) e prevede un ciclo di prePCR di 5 min a 37°C, per l’attivazione dell’UNG e 15 min a 95°C seguito da 40 cicli suddivisi in: 30 sec a 95 °C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C per l’estensione del frammento. Si conclude con un’estensione finale 72°C per 1 min. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 12 7.5. Seminested PCR Per i campioni per i quali la PCR ha fornito scarse quantità di amplificato é stata eseguita una reazione di seminested PCR mediante l’utilizzo del forward primer ITS86 ed il reverse primer ITS4 [18]. ITS86: ITS4: 5’- GTG AAT CAT CGA ATC TTT GAA C -3’ 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’ 22 bp 20 bp Il mix di reazione per un campione contiene 37, 75 µl H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 5 µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP, dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera), 1µl ITS86, 1µl ITS4 10µM (Microsynth, Svizzera) e 1 µl di DNA amplificato. I diversi passaggi della reazione d’amplificazione corrispondono a quelli visti per la PCR (vedi paragrafo precedente). 7.6. Controlli Per il controllo delle reazioni d’amplificazione sono stati usati 3 controlli positivi. Il BRF 15 Trichophyton rubrum, isolato da un campione clinico di pelle. Il BRF 24 Candida glabrata, isolato da un espettorato e il BRF 32 Cladosporium sp. isolato da un campione clinico proveniente da un’infezione batterica. La grandezza del loro prodotto di amplificazione con i primer ITS1 e ITS4 corrisponde rispettivamente a : Candida glabrata 820 bp, Cladosporium sp. 549 bp, Trichophyton rubrum 692 bp [6, 7]. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Figura 3. Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei controlli positivi. 1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 135, 4) 46, 5) 27, 6) 79a, 7) 79b, 8) BFR 32 Cladosporium sp. 549 bp, 9) BFR 15 Trichophyton rubrum 692 bp, 10) BFR 24 Candida glabrata 820 bp Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 13 7.7. Elettroforesi I prodotti ottenuti dopo amplificazione sono stati fatti migrare mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1,5% in tampone TBE 1x a 10Volt/cm2 per circa 30 min. Per ogni campione sono stati depositati 10µl dell’amplificato. Dopo elettroforesi il gel é stato immerso per circa 10 min in una soluzione di bromuro di etidio (0,5-1.0 µg/ml), lavato in acqua e depositato in un transilluminatore UV per la messa in evidenza dei frammenti di DNA. 7.8. Purificazione dei prodotti PCR I campioni amplificati sono stati purificati mediante l’utilizzo di colonnine Montage PCR (Milliore, Svizzera) sulle quali sono stati depositati 40 µl di amplificato. Dopo centrifugazione per 5 min a 1'020 x g, il DNA é stato eluato con 20 µl di tampone di eluizione AE (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) e con sucessiva centrifugazione di 2 min a 1'020 x g. 7.9. Reazione di sequenza Per ogni amplificato purificato sono state effettuate due reazione di sequenza usando separatamente il primer ITS1 o il primer ITS86, per i campioni amplificati con la seminested PCR, e il primer ITS4. Il mix di reazione di sequenza contiene 2 µl di BigDye Reaction Mix, 3µl di tampone 5x Buffer BigDye (ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Applied Biosystems, USA), 4µl di H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 3µl di un primer 1µM(ITS1, ITS86 o ITS4) (Microsynth, Svizzera) per mix di reazione e 3 µl di DNA purificato. La reazione di sequenza é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700, USA) e prevede 25 cicli suddivisi in: 10 sec a 96 °C per la denaturazione del DNA, 5 sec a 50°C per l’ibridazione del primer e 4 min a 60°C per l’estensione del frammento. 7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza I prodotti ottenuti dalla reazione di sequenza sono stati purificati mediante l’utilizzo di mini colonne di Sephadex G50 (Sephadex G50 fine, Amersham Bioscences) ottenute mediante centrifugazione di 900µl della soluzione di Sephadex per 3 min a 770 x g. Sulle colonnine sono stati caricati e centrifugati, per 3 min a 770 x g, i 15µl del prodotto della reazione di sequenza. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 14 7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica I prodotti purificati della reazione di sequenza sono stati sequenziati mediante l’utilizzo del sequenziatore automatico ABI Prism 310 (Applied Biosystems, USA). Sul sequenziatore sono stati caricati 5 µl di prodotto della reazione di sequenza e 15 µl di H2O molecular grade (FLUKA, Svizzera). 7.12. Analisi delle sequenze Le sequenze ottenute sono state corrette manualmente mediante la lettura dell’ettroferogramma e mediante l’allineamento dei frammenti ottenuti con il forwar primer ed il revese primer. L’allineamento delle sequenze é stato effettuato con il programma MEGA 3.0 (Molecular Evolution Genetics Analysis). Le sequenze consenso sono state confrontate con le sequenze presenti nella GenBank usando il BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) della NCBI (National Center for Biotecnology Information, USA) per l’identificazione del frammento. L’identificazione é stata fatta in base alla maggior percentuale di omologia della sequenza analizzata rispetto alle sequenze presenti nella banca dati. Le sequenze presenti nella GenBank con maggior omologia sono state prese come sequenze di riferimento e sono state introdotte nel programma d’analisi MEGA 3.0. Queste sequenze sono state in seguito utilizzate come riferimento per il taglio del frammento nella regione esatta ITS1 ed ITS2. 7.13. Costruzione dell’albero filogenetico Le sequenze ottenute e le sequenze di riferimento prese dalla GenBank (NBCI) sono state allineate mediante l’uso del programma MEGA 3.0. La costruzione dell’albero, che rappresenta le relazioni esistenti tra le sequenze, é stata fatta in base al numero di differenze di nucleotidi utilizzando il metodo matematico UPGMA (Unweighted pair group method using aricmetic averages). Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 15 8. Risultati 8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA L’ottenimento del DNA da amplificare inizia con la lisi cellulare, ma la struttura della parete cellulare dei funghi composta da chitina, glucani, lipidi e peptidi presenti in forma variabile da specie a specie, influisce con le diverse metodiche di estrazione che siano enzimatiche, chimiche o fisiche. Trovare un metodo che sia adatto per tutte le diverse especie risulta dunque molto difficile [5]. Per questo lavoro sono state testate due metodiche che si basano su due processi di lisi diversi. La Metodica 1 prevede una lisi cellulare mediante reazione meccanica, chimica e termica, mentre la Metodica 2 si basa su reazioni chimiche e termiche. L’efficienza dell’estrazione del DNA delle due metodiche è stata verificata mediante l’utilizzo della PCR con i primers ITS1 e ITS4 effettuata su 8 campioni appartenenti a 8 specie diverse aventi lo stesso volume di eluizione pari a 200 µl di tampone AE (QIAamp DNA Mini Kit, DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Svizzera). Si è ottenuta un’amplificazione di 7/8 campioni con la Metodica 1 e di 8/8 campioni con la Metodica 2. Tabella 4. Campioni usati per il confronto delle 2 metodiche di estrazione Estrazione DNA Specie Identificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca Aspergillus candidus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus nidulans Aspergillus japonicus Aspergillus ochraceus Aspergillus versicolor Malbranche sp. M6558/03 Neqas 6657/M19635 R10937/03 M9618/CQ015888 M45878/02 Neqas 6406/M35301 M42299 90 94 56 91 62 82 83 N.P. Metodica 1 Metodica 2 + + + + + + + + + + + + + + + - L’analisi dei diversi amplificati migrati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1,5% ed evidenziati con bromuro di etidio non mostra differenze significative delle diverse bande di migrazione. I tempi di esecuzione per ambedue le metodiche si aggirano attorno ai 30 min ca.. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 1 2 3 4 5 6 7 8 9 16 10 Figura 4.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 1 (versione modificata DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio. 1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4) 91, 5) 82, 6) 94, 7) 83, 8) 62, 9) M42299, 10) 90 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Figura 5 Figura 6.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 2 (versione modificata QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio. 1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4) 90, 5) M42299, 6) 94, 7) 62, 8) 83, 9) 82, 10) 91 Per lo svolgimento del lavoro si è così scelto l’utilizzo della Metodica 2, non solo per il maggior numero di risultati positivi ma anche perché si presenta manualmente più facile da eseguire. Infatti, questa metodica presenta un minor numero di passaggi riducendo dunque i rischi di contaminazione e soprattutto non prevede l’utilizzo dell’azoto liquido; sostanza non facilmente maneggiabile. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 17 8.2. Coltivazione su piastra Sono stati coltivati su piastra agar Sabouraud Cloramfenicolo a 37°C, 86 ceppi appartenenti a 49 specie diverse (vedi allegato 11.2) selezionati dalla micoteca in modo casuale. Si è riscontrata una crescita per 77/86 campioni . Tabella 5. Campioni non cresciuti Specie Identificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca Absidia corymbifera Acremonium sp. Alternaria alterneta Alterneria alternata Aspergillus terreus Aureobasidium sp. Cunninghamella berthalletiae Geotrichum candidum Mucor sp. Neqas 5891/M9621 Neqas 6210/M7440 Neqas 6325/M19931 CQ12.96 CQ99/M14318 CQ99/M28018 ID ZH/95 64 75 78 35 54 57 53 1 48 8.3. Estrazione e amplificazione Sono state eseguite 143 estrazioni, utilizzando la Metodica 2, per i 77 ceppi con un’amplificazione positiva della regione ITS1-5,8S-ITS2 per 66/77 campioni. Per i campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophyton tonsurans 3, è stata eseguita una seconda amplificazione di PCR seminested poiché la prima amplificazione a fornito scarse quantità di amplificato. Tabella 5 Estrazioni DNA non riuscite Specie Identificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca Caldosporium cladosporioides Cladosporium sp. Cladosporium sphaerospermum Cunninghamella bertholletiae Fusarium oxysporum Fusarium solani Hormographiella aspergillata M29240 M753/97 Neqas 7355/M5569 Neqas 6659/M19638 R36234 M35303/02 R8459 71 41 140 96 119 79 139 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 18 Tabella 5. (Continuazione) Specie Identificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca Malbranchea sp. Microsporum persicolor Monascus ruber Trichoderma sp. Tbc22067 corso 2004 BioMérieux CQ99 M948 113 135 2 27 8.4. Sequenze Sono state ottenute 56/66 sequenze della regione ITS1-5.8S-ITS2 di 56 ceppi differenti appartenenti a 36 specie diverse (vedi allegato 11.2.) mediante l’amplificazione con i primer ITS1 e ITS4. Le sequenze corrette (vedi.) presentano una lunghezza variabile fra 286-810 bp e un omologia compresa fra il 90-100 % con le sequenze di riferimento prelevate dalla GenBank (NCBI). Come sequenze di riferimento sono state prese dalla GenBank (NCBI) 80 sequenze che presentavano la maggior percentuale di omologia per le rispettive sequenze analizzate. Queste sequenze provengono dall’analisi di ceppi certificati e ceppi ottenuti da altri istituti di ricerca. (vedi allegato 11.3) Le sequenze dei campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophyton tonsurans 3, ottenute con la seminested PCR sono state escluse dal lavoro poiché non coprivano l’intero gene. 8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante l’analisi delle sequenze Fra i campioni per i quali si é ottenuta la sequenza del frammento ITS1-5.8S-ITS2, l’identificazione morfologica forniva un’identificazione a livello di specie per 44/56 ceppi. I restanti 12 ceppi erano identificati a livello di specie. L’identificazione mediante l’analisi delle sequenze ha fornito invece un’identificazione a livello di specie per 36/56 ceppi, di genere 19/56 e di ordine 1/56. Tabella 6. Confronto fra identificazione morfologica e genotipica Specie Genere Ordine Identificazione morfologica Analisi della sequenza 78,6% (44/56) 21,4% (12/56) - 64,3% (36/56) 33,9% (19/56) 1,8% (1/56) Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 19 Messe a confronto, le due tecniche presentano un’identificazione identica per 32/56 campioni di qui 25 campioni identificati a livello di specie e 7 a livello di genere con un’omologia con le sequenze di riferimento che varia dal 90-100%. Si può notare come per tre ceppi differenti di Aspergillus flavus la sequenza risulta identica alla sequenza della specie Aspergillus oryzae. Il campione No. 98 Absidia corymbifera presenta un’omologia al 100% con l’Absidia corymbifera ATCC 46774. La sequenza di riferimento però, copre solamente la regione 5.8S-ITS2. L’identificazione fenotipica a livello di specie risulta più discriminante per 12/56 campioni, mentre a livello di genere per 1/56 campioni. Al contrario l’identificazione a livello di specie effettuata mediante l’analisi delle sequenze risulta più discriminante per 4/56 campioni le qui percentuali di omologia variano fra il 92-100%. Infine per 7/56 campioni otteniamo delle identificazioni contrastanti. Di questi, 6 campioni sono comunque classificati correttamente a livello di genere. Dunque possiamo dire che l’identificazione mediante l’analisi delle sequenze fornisce un’identificazione identica a l’identificazione fenotipica a livello di genere per 55/56 campioni. Tabella 7. Confronto fra identificazione fenotipica ed identificazione mediante l’analisi delle sequenze a livello di genere e specie No. campioni Percentuale Identificazione fenotipica a livello di genere identica 55/56 all’identificazione mediante sequenza 98,2% Identificazione fenotipica a livello di specie identica 25/56 all’identificazione mediante sequenza 44,6% Identificazione fenotipica a livello di specie più 12/56 discriminante 21,4% Identificazione mediante sequenza a livello di specie più discriminante 4/56 7,14% Risultati discrepanti fra fenotipo e sequenza a livello di specie 7/56 12,5% 8.6. Albero filogenetico L’albero filogenetico é stato creato mediante il programma MEGA 3.0 introducendo 80 sequenze di riferimento provenienti dalla GenBank (NCBI) e le 56 sequenze ottenute appartenenti a 36 specie diverse. L’albero mostra un buon raggruppamento degli ordini e delle famiglie salvo per il campione 55 Paecilomices lilacinus, appartenente all’ordine delle Eurotiales, e il campione 99 Geotricum candidum, appartenente appartenente all’ordine dei Saccharomycetales, i quali si trovano raggruppati all’interno dell’ordine delle Hypocreales. (vedi allegato 11.5) Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 20 Tabella 8. Tabelle risultati A. Identificazione fenotipica a livello di specie identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 No. Micoteca ICM Ceppo Specie Identificazione fenotipica Specie Identificazione ITS Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI) No. GenBank (NCBI) 98 90 18 102 5 10 15 23 56 62 Neqas 6758/M34707 M6558/03 DSM 816/95 CQ99 M9618/CQ015888 Absidia corymbifera Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus japonicus Absidia corymbifera Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus japonicus 32 37 83 R5340 esp 96 CQ97/M89 Neqas 6406/M35301 Aspergillus niger Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus niger Aspergillus terreus Aspergillus versicolor 138 99 76 Corso BioMérieux Neqas 6759/M34711 M19220/02 Epidermophyton floccosum Geotrichum candidum Microsporum canis Epidermophyton floccosum Galactomyces geotrichum Microsporum canis 111 M21559 Microsporum canis Microsporum canis 11 117 VA2397/97 M35037 Microsporum gypseum Microsporum gypseum Arthroderma gypseum Arthroderma gypseum 100% di omologia con Absidia corymbifera ATCC 46774 100% di omologia con Aspergillus candidus ATCC 1002 100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869 100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 100% di omologia con Aspergillus japonicus CBS 61178 100% di omologia con Aspergillus aculeatus CBS 17266 100% di omologia con Aspergillus niger ATCC 16888 100% di omologia con Aspergillus terreus ATCC 1012 100% di omologia con Aspergillus versicolor 2014 99% di omologia con Aspergillus versicolor ATCC 9577 100% di omologia con Epidermophyton floccosum ATCC 26072 99% di omologia con Galactomyces geotrichum YF01C 100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61 99% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 161.69 AF117937 AY373842 AY373847 AY373847 AY939790 AY939790 AY939790 AY939790 AY939790 AY585562 AY585558 AY373852 AY373871 AM158229 AY373880 AY213646 DQ668351 AY213657 AJ252329 AY213657 AJ252329 AJ970141 AJ000621 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 21 (continuazione) A. No. Micoteca ICM Ceppo Specie Identificazione fenotipica Specie Identificazione ITS Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI) No. GenBank (NCBI) 136 137 55 61 Corso BioMérieux Corso BioMérieux CQ00/17436 Neqas 5775/M38017 Microsporum gypseum Microsporum praecox Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii 149 Neqas 7640/M36113 Paecilomyces variotii Arthroderma gypseum Microsporum praecox Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii N.P.1 VA460449 Schizophyllum comune Schizophyllum commune 100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61 100% di omologia con Microsporum praecox CBS 468.74 100% di omologia con Paecilomyces lilacinus ATCC 10114 99% di omologia con Paecilomyces variotii NRRL 1115 97% di omologia con Paecilomyces variotii ATCC 22319 99% di omologia con Paecylomices variotii NRRL 1115 97% di omologia con Paecylomices variotii ATCC 22319 100% di omologia con Schizophyllum commune HNO34 AJ970141 AJ970148 AY213665 AF033395 AY373941 AF033395 AY373941 AF280758 1 N.P., campione non presente nella micoteca 22 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico B. Identificazione fenotipica a livello di genere identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 No. Micoteca ICM Ceppo Specie Identificazione fenotipica Specie Identificazione ITS Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI) No. GenBank (NCBI) 51 - Acremonium sp. Acremonium sp. 116 68 M25474 Neqas 6019/M22420 Acremonium sp. Exophiala sp. Hypocreales sp. Exophiala sp. 24 - Fusarium sp. Fusarium sp. 72 M4938 Penicillium sp. Penicillium sp. 93 R13266/03 Penicillium sp. Penicillium sp. 105 R5798 Trichoderma sp. Trichoderma sp. 147 M39284/05 Trichoderma sp. Trichoderma sp. 100% di omologia con Acremonium sp. KMU 4529 100% di omologia con Acremonium strictum UW 836 97% di omologia con Hypocreales sp. LM92 90% di omologia con Exophiala sp. CBS 115831 90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674 100% di omologia con Fusarium oxysporum Ppf15 100% di omologia con Fusarium sp. 448 100% di omologia con Fusarium subglutinans CNFM 960512 100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467 100% di omologia con Penicillium commune wb153 100% di omologia con Penicillium sp. PC6 100% di omologia con Penicillium citrinum WM 05.3 100% di omologia con Penicillium westlingii NRRL 800 100% di omologia con Hypocrea jecorina ATCC 24449 100% di omologia con Hypocrea schweinitzii ICMP 5426 100% di omologia con Trichoderma longibrachiatum ATCC52326 100% di omologia con Hypocrea koningii GJS 95-175 100% di omologia con Hypocrea rufa GJS 96-47 100% di omologia con Trichoderma koningiopsis Dis326h 100% di omologia con Trichoderma ovalisporum Dis 203c 100% di omologia con Trichoderma sp. YM2 AB158290 AY138844 EF060464 AY857539 DQ182589 EF495237 AY729069 AY898246 AY373903 AF455544 EF105368 DQ249207 AF033423 DQ000625 X93966 Z48935 AF456923 AJ230685 DQ379015 DQ315458 AB297794 23 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico C. Identificazione fenotipica a livello di specie più discriminante dell’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 No. Micoteca ICM Ceppo Specie Specie Identificazione fenotipica Identificazione ITS 50 CQ98/9792 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 94 Neqas 6657/M19635 Aspergillus flavus Aspergillus sp. N.P. CQR5708 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 91 R10937/03 Aspergillus nidulans Aspergillus sp. 82 M45878/02 Aspergillus ochraceus Aspergillus sp. 25 M1023/95 Aspergillus versicolor Aspergillus sp. 86 M4859/03 Fusarium oxysporum Fusarium sp. 34 CQ12.96 Fusarium solanii Fusarium sp. Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI) No. GenBank (NCBI) 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 100% di omologia con Emericella nidulans NRRL 2395 100% di omologia con Emericella dentata IFM 42021 100% di omologia con Emericella quadrilineata UWFP 613 100% di omologia con Emericella cleistominuta IFM 48170 100% di omologia con Emericella rugulosa IFM 54242 99% di omologia con Aspergillus ochraceus ATCC 18412 99% di omologia con Aspergillus westerdijkiae NRRL 35197 100% di omologia con Aspergillus versicolor NHRC-FE078 100% di omologia con Emericella nidulans 2172 90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674 99% di omologia con Fusarium oxysporum 10L-201-Mexico 99% di omologia con Fusarium bulbicola NRRL 13618 99% di omologia con Gibberella sacchari wb 395 99% di omologia con Fusarium lactis NRRL 25200 99% di omologia con Gibberella moniliformis FV 4773 100% di omologia con Fusarium oxysporum FO-05 100% di omologia con Fusarium solani WB 853 AY939782 AY373857 AY939782 AY373857 AY939782 AY373857 AY373888 AB249000 AY213644 AB248989 AB249002 AY373854 DQ250530 AJ937755 AM158232 DQ182589 AY904065 U61676 AF455450 U61681 AY428795 AY928412 AY569560 24 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico C. ( Continuazione) No. Micoteca ICM Ceppo Specie Specie Identificazione fenotipica Identificazione ITS 133 Corso BioMérieux Microsporum audouinii Microsporum sp. 134 Corso BioMérieux Microsporum canis Microsporum sp. 143 Neqas 7432/M14243 Penicillium Chrysogenum Penicillium sp. 81 CQ5/02/M19992 Rhizopus oryzae Rhizopus sp. Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI) No. GenBank (NCBI) 99% di omologia con Microsporum audouinii CBS 344.50 100% di omologia con Microsporum rivalieri CBS 409.51 100% di omologia con Microsporum langeronii CBS 408.51 99% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 99% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 99% di omologia con Microsporum ferrugineum CBS 426.63 100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467 100% di omologia con Penicillium commune wb153 100% di omologia con Penicillium sp. PC6 100% di omologia con Rhizopus oryzae CBS 395.95 100% di omologia con Rhizopus japonicus AHU6525 100% di omologia con Rhizopus microsporus AHU6527 100% di omologia con Amylomyces rouxii SDM34 AJ252333 AJ000625 AJ252334 AY213657 AJ252329 AJ252338 AY373903 AF455544 EF105368 AY213684 AB097347 AB097348 AB181338 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico D. 25 Identificazione a livello di specie mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 più discriminante dell’identificazione fenotipica No. Micoteca ICM 110 20 46 N. P. Ceppo Specie Identificazione fenotipica Specie Identificazione ITS Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI) No. GenBank (NCBI) M21439 M1292/97 M19793/98 M42299 Chaetomium sp. Chrysosporium sp. Penicillium sp. Malbranchea sp. Chaetomium funicola Chrysosporium keratinophilum Penicillium nalgiovense Auxarthron conjugatum 92% di omologia con Chaetomium funicola CBS 141.50 100% di omologia con Chrysosporium keratinophilum IFO 7584 100% di omologia con Penicillium nalgiovense IBT 12108 97% di omologia con Auxarthron conjugatum GFI 149 AJ279450 AJ131681 AJ004895 AJ608967 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico E. 26 Risultati discrepanti fra identificazione fenotipica e identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 a livello di specie No. Micoteca ICM Ceppo 13 69 21 M430/95 Neqas 6020/M22415 M41912/01 95 40 38 Neqas 6658/M19637 M742/97 M1609/96 100 Neqas6760/M34712 Specie Identificazione fenotipica Specie Identificazione ITS Aspergillus candidus Aspergillus fumigatus Aspergillus nidulans Emericella corrugata Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus reticulisporus Chrysosporium articulatum Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus fulvescens Curvularia lunata Curvularia trifolii Exophiala spinifera Exophiala jeanselmei Exophiala oligosperma Paecilomyces lilacinus Curvularia trifolii Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI) No. GenBank (NCBI) 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 100% di omologia con Emericella corrugata IFM 54743 100% di omologia con Aphanoascus reticulisporus 100% di omologia con Chrysosporium articulatum UAMH 4320 100% di omologia con Aphanoascus fulvescens UAMH 5117 100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403 100% di omologia con Exophiala jeanselmei CBS 463.80 100% di omologia con Exophiala oligosperma IP 2118.92 100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403 AY939790 AB264794 AJ390381 AJ007841 AF038357 AF455446 AY163552 DQ836797 AF455446 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 27 9. Discussione L’identificazione della specie nella diagnostica delle micosi gioca un ruolo fondamentale per lo svolgimento del trattamento medico. Un’identificazione basata sulla morfologia delle ife o delle spore non é purtroppo sempre facile da eseguire poiché specie molto vicine filogeneticamente possono presentare tratti fenotipici uguali o difficilmente differenziabili. Oltre alle difficoltà di identificazione morfologica dobbiamo prendere in considerazione i tempi che la crescita su piastra prevede: tempi troppo lunghi per un tipo di diagnostica che vuole risultati precisi in tempi sempre più brevi. In questo lavoro si é voluto così testare una tecnica alternativa, che fosse più specifica rispetto alla morfologia nella determinazione della specie, e che in un futuro potesse essere applicata ad una determinazione direttamente dal campione. Si é deciso quindi, di effettuare l’identificazione dei diversi funghi mediante analisi delle sequenze dei geni ITS1-5.8S-ITS2. Le sequenze di 56 ceppi appartenenti a 36 specie diverse ottenute tramite amplificazione del DNA ribosomale, mediante l’impiego di primers specifici per i funghi, sono state confrontate con le sequenze presenti nella GenBank (NCBI) ed i risultati ottenuti sono stati messi a confronto con l’identificazione fornita dalla morfologia. I risultati ottenuti mostrano un’alta specificità di questa tecnica nell’identificazione esatta a livello di genere con un’identificazione corrispondente all’identificazione morfologica di 55/56 (98,2%) ceppi. A livello di specie purtroppo si é riscontrato che l’identificazione morfologia riesce ad essere più discriminante con un’identificazione di specie di 44/56 ceppi (78,6%) rispetto all’identificazione mediante l’analisi delle sequenze che posiziona a livello di specie 36/56 (64,3%) ceppi fra i quali solamente 25 con un’identificazione identica all’identificazione fenotipica. Da notare che per 4 campioni dove la morfologia forniva solo la classificazione a livello di genere l’identificazione mediante la sequenza é risultata più discriminante. Si può dunque concludere che l’identificazione dei diversi funghi mediante l’analisi dei geni ITS15,8S-ITS2 non può sostituire un’identificazione morfologica bensì essere un appoggio in caso di difficoltà nell’identificazione fenotipica. Altre prospettive di analisi potrebbero contemplare invece l’utilizzo dell’amplificazione della regione ITS accompagnata dall’amplificazione di un’altro gene ribosomiale come potrebbe essere il 28S o il 18S. Oppure ancora si potrebbe cercare di classificare le diverse specie mediante l’utilizzo di geni codificanti per alcune proteine come l’actina, la chitina sintetasi, l’acetil coenzima sintetasi e sopratutto l’Į-tubulina e la ȕ-tubulina, due geni che si presentano altamente variabili fra le diverse specie [9,19]. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 28 10. Bibliografia 1. J. L. Rakeman, U. Bui, K. LaFe, Y.-C. Chen, R. J. Honeycutt, B. T. Cookson; Multilocus DNA Sequence Comparisons Rapidly Identity Pathogenic Molds; Journal of Clinical Microbioly, 43, 3324-3333, 2005 2. J. Pontón; Diagnostico micróbiologico de las micosis; Revista Iberoamericana de Micología, 19, 25-29, 2002 3. T. Henry, P. C. Iwen, S. H. Hinrichs; Identification of Aspergillus Species Using Internal Transcribed Spacer Regions 1 and 2; Journal of Clinical Microbiology, 38, 1510-1515, 2000 4. L. M. Prescott, J. P. Harley, D. A. Klein; Microbiologie; 2° ed., De Boeck Université, Bruxelles, 2003 5. D. E. Ciardo; Molecular Identification of Fungal Pathogens using the ITS Region; Diss. ETH 16410, 2006 6. L. B. Lourenço, P. C. A. Garcia, S. M. Recco-Pimentel; Restriction fragment analysis of the ribosomal DNA of Paratelmatobius and Scythrophrys species (anura, Leptodactyliadae); Genetics and Molecular Biologi, 26, 139-143, 2003 7. P. H. Hendolin, L. Paulin, P. Koukila-Kähkölä, V. J. Antilla, H. Malmberg, M. Richardson, J. Ylikoski; Panfungal PCR and Multiplex Liquid Hybridization for Detection of Fungi in Tissue Specimens; Journal of Clinical Microbiology, 38., 4186-4192, 2000 8. SH. Mirhendi, P. kordbacheh, B. Kazemi, S. Samiei, M. Pezeshki, MR. Khorramizadeh; A PCR-RFLP Method to identification of the Important Opportunistic Fungi: Candida Species, Cryptococcus neoformans, Aspegillus fumigatus and Fusarium solani; Iranian Journal Publique Health, 30, 103-106, 2001 9. J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology Reviews, 12, 454-500, 1999. 10. S. N. Leaw, H. C. Chang, H. F. Sun, R. Barton, J. Bouchara, T. C. Chang; Identification of Medically Yeast Species by Sequence Analysis of the Internal Transcribed Spacer Regions; Journal of Clinical Microbiology, 44, 693-699, 2006 11. S. F. Yeo, B. Wong; Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive Fungal Infections; Clinical Microbiology Reviews, 15, 465-484, 2002 12. G. Delfino, E. Lanciotti, G. Liguri, M. Stefani; Medicina e Biologia, Dizionario enciclopedico, 2° ed., Zanichelli, 2003 13. G.S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras; Atlas of Clinical fungi; 2° ed., Universitat Rovira i Virgili, Netherlands, 2000 14. G. Deysson, A. Delcourt; Cryptogamie, Mycologie générale et appliquée; 2° ed., SEDES et C.D.U., Paris, 1980 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 29 15. M. R. Costa, C. Da Silva Lacaz, M. Kawasaki, Z. P. De Camargo; Conventional versus molecular diagnostic test; Medical Mycology, 38, 139-145, 2000 16. Lodish et al.; Biologie moléculaire de la cellule; 3° ed. De Boeck Université, Bruxelle, 1997 17. D. LJ Lafontaine, D. Tollervey; Ribosomal RNA, Encyclopedia of life Sciences, www.els.net, 2001 18. C. Ferrer, F. Colom, S. Frases, E. Mulet, J. L. Abad, J. L. Alió; Detection and Identification of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5,8S Ribosomal DNA Typing in Ocular Infections; Journal of Clinical Microbiology, 39., 2873-2879, 2001 19. P. J. Keeling; Congruent evidence from Į-tubulin and ȕ-tubulin gene phylogenies for a zygomycete origin of microsporidia; Fungal Genetics and Biology, 38, 298-309, 2003 20. A. J. Morris, T. C. Byrne, J. F. Madden, L. B. Reller; Duration of Incubation of Fungal Cultures; Journal of Clinical Microbiology, 34, 1583-1585, 1996 21. J. Loeffler, N. Henke, H. Hebart, D. Schmidt, L. Hagmeyer, U. Schumacher, H. Einsele; Quantification of Fungal DNA by Using Fluorescence Resonance Energy Transfer and the Light Cycler system; Journal of Clinical Microbiology, 38, 586-590, 2000 22. H. Einsele, H. Hebart, G. Roller, J. Löffler, I. Rothenhöfer, C. A. Müller, R. A. Bowden, J. Van Burik, D. Engelhard, L. Kanz, U. Schumacher; Detection and Identification of Fungal Pathogens in Blood by Using Molecular Probes; Journal of Clinical Microbiology, 35, 13531360, 1997 23. K. Voigt, E. Cigelnik, K. O’Donnell; Phylogeny and PCR Identification of Clinically Important Zygomycetes Based on Nuclear Ribosomal-DNA Sequence Data; Journal of Clinical Microbiology, 37., 3957-3964, 1999 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 11. Allegati 30 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 31 11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti, Zigomiceti e Basidiomiceti Tavola 1. Ascomiceti J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology Reviews, July, 454-500, 1999. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 32 Tavola 2. Zigomiceti J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology Reviews, July, 454-500, 1999. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 33 Tavola 3. Basidiomiceti J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology Reviews, July, 454-500, 1999. Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 34 11.2. Lista dei campioni Specie Ceppo No. Micoteca No. Sequenza Sequenza ITS1-5.8S-ITS2 Lunghezza frammento bp Absidia corymbifera Absidia corymbifera Absidia corymbifera Acremonium sp. Acremonium sp. Acremonium sp. Acremonium sp. Acremonium sp. Alternaria alterneta Alterneria alternata Aphanoascus fulvescens Arthrinium phaeospermium Aspergillus candidus Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus Aspergillus flavus Aspergillus flavus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicus Aspergillus nidulans Aspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus terreus Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus versicolor Aureobasidium sp. Bipolaris sp. Caldosporium cladosporioides Chaetamium sp. Neqas1 5891/M9621 R12109/01 Neqas 6758/M34707 CQ97/M89 M18768/98 Neqas 6210/M7440 M25474 Neqas 6325/M19931 CQ12.96 M732/ZH96 M29513/05 M430/95 M6558/03 DSM 816/95 Neqas 7021/M19740 CQR5708 CQ98/9792 Neqas 6657/M19635 CQ99 CQ00/M19448 M9618/CQ015888 Neqas 6020/M22415 R10937/03 R5340 esp 96 M45878/02 CQ97/M89 CQ99/M14318 M1023/95 Neqas 6406/M35301 M26530 M29240 M21439 64 66 98 39 45 51 75 116 78 35 31 146 13 90 18 102 109 N.P.2 / CQR5708 50 94 5 10 15 23 56 58 62 69 91 32 82 37 54 25 83 57 115 71 110 810 492 488 512 508 515 515 510 510 510 512 512 512 512 512 490 481 481 514 504 523 482 471 488 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 35 Specie Ceppo No. Micoteca No. Sequenza Sequenza ITS1-5.8S-ITS2 Lunghezza frammento bp Chrysosporium keratinophilum Chrysosporium keratinophilum Chrysosporium sp. Cladosporium sp. Cladosporium sphaerospermum Cunninghamella berthalletiae Cunninghamella bertholletiae Curvularia lunata Epidermophyton floccosum Exophiala sp. Exophiala spinifera Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum Fusarium solani Fusarium solanii Fusarium sp. Geotrichum candidum Geotrichum candidum Hormographiella aspergillata Malbranche sp. Malbranchea sp. Microsporum audouinii Microsporum canis Microsporum canis Microsporum canis Microsporum gypseum Microsporum gypseum Microsporum gypseum Microsporum persicolor Microsporum praecox Monascus ruber Mucor sp. Ochroconis sp. Paecilomyces lilacinus Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Paecylomices veriotii Penicillium Chrysogenum Penicillium sp. Penicillium sp. Penicillium sp. Rhizopus oryzae Schizophyllum comune M41912/01 Neqas 6658/M19637 M1292/97 M753/97 Neqas 7355/M5569 CQ99/M28018 Neqas 6659/M19638 M742/97 corso 2004 BioMérieux Neqas 6019/M22420 M1609/96 M4859/03 R36234 M35303/02 CQ12.96 ID ZH/95 Neqas 6759/M34711 R8459 M42299 Tbc22067 corso 2004 BioMérieux M19220/02 M21559 corso 2004 BioMérieux VA2397/97 M35037 corso 2004 BioMérieux corso 2004 BioMérieux corso 2004 BioMérieux CQ99 M31577/01 CQ00/17436 Neqas6760/M34712 Neqas 5775/M38017 Neqas 7640/M36113 Neqas 7432/M14243 M19793/98 M4938 R13266/03 CQ5/02/M19992 VA460449 21 95 20 41 140 53 96 40 138 68 38 86 119 79 34 24 1 99 139 N.P. / M42299 113 133 76 111 134 11 117 136 135 137 2 48 70 55 100 61 149 143 46 72 93 81 N.P. / VA460449 515 516 520 515 695 540 541 461 489 459 286 492 649 652 652 652 581 534 581 555 511 515 528 528 500 500 500 468 562 549 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 36 Specie Ceppo No. Micoteca No. Sequenza Sequenza ITS1-5.8S-ITS2 Lunghezza frammento bp Trichoderma sp. Trichoderma sp. Trichoderma sp. Trichophyton tonsurans M948 R5798 M39284/05 CQ95/M106 27 105 147 3 552 519 - 1. 2. National External Quality assesment service, UK Non presente nella micoteca Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 37 11.3. Lista delle sequenze di riferimento Specie Ceppo GenBank (NCBI) No. Referenza Lunghezza sequenza bp ITS1-5.8S-ITS2 Absidia corymbifera Acremonium sp. Acremonium strictum Amylomyces rouxii Aphanoascus fulvescens Aphanoascus reticulisporus Arthroderma gypseum Arthroderma gypseum Aspergillus aculeatus Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus japonicus Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzae aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus versicolor Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Auxarthron conjugatum Chaetomium funicola Chrysosporium articulatum Chrysosporium keratinophilum Curvularia trifolii Emericella cleistominuta Emericella corrugata Emericella dentata Emericella nidulans Emericella nidulans Emericella quadrilineata Emericella rugulosa Epidermophyton floccosum Exophiala jeanselmei Exophiala oligosperma Exophiala sp. Exophiala xenobiotica Fusarium bulbicola Fusarium lactis Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum Fusarium solani Fusarium sp. Fusarium subglutinans ATCC1 46774 KMU 4529 UW 836 SDM34 UAMH 5117 CBS2 258.61 CBS 161.69 CBS 17266 ATCC 1002 ATCC 58869 ATCC 20043 ATCC 9197 CBS 61178 ATCC 16888 ATCC 18412 SRRC 2103 ATCC 1012 NHRC-FE078 ATCC 9577 2014 NRRL3 35197 GFI 149 CBS 141.50 UAMH 4320 IFO 7584 wb 403 IFM 48170 IFM 54743 IFM 42021 NRRL 2395 2172 UWFP4 613 IFM 54242 ATCC 26072 CBS 463.80 IP5 2118.92 CBS 115831 CBS 117674 NRRL 13618 NRRL 25200 Ppf15 10L-201-Mexico FO-05 WB 853 448 CNFM 960512 AF117937 AB158290 AY138844 AB181338 AF038357 AJ390381 AJ970141 AJ000621 AY585558 AY373842 AY373847 AY939782 AY939790 AY585562 AY373852 AY373854 AY373857 AY373871 AJ937755 AY373880 AM158229 DQ250530 AJ608967 AJ279450 AJ007841 AJ131681 AF455446 AB248989 AB264794 AB249000 AY373888 AM158232 AY213644 AB249002 AY213646 AY163552 DQ836797 AY857539 DQ182589 U61676 U61681 EF495237 AY904065 AY928412 AY569560 AY729069 AY898246 420 sequenza parziale 5.8S-ITS2 492 492 562 516 515 581 534 490 508 515 510 512 490 514 502 510 523 482 482 471 501 494 494 515 520 515 481 481 481 481 402 481 481 695 541 541 520 519 461 461 459 461 494 494 459 459 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico Specie Ceppo GenBank (NCBI) No. Referenza Lunghezza sequenza bp ITS1-5.8S-ITS2 Galactomyces geotrichum Gibberella moniliformis Gibberella sacchari Hypocrea jecorina Hypocrea koningii Hypocrea rufa Hypocrea schweinitzii Hypocreales sp. Microsporum audouinii Microsporum canis Microsporum distortum Microsporum ferrugineum Microsporum langeronii Microsporum praecox Microsporum rivalieri Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii Penicillium chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium commune Penicillium nalgiovense Penicillium sp. Penicillium sp. Penicillium westlingii Rhizopus japonicus Rhizopus microsporus Rhizopus oryzae Schizophyllum commune Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Trichoderma ovalisporum Trichoderma sp. YF01C FV 4773 wb 395 ATCC 24449 GJS 95-175 GJS 96-47 ICMP 5426 LM92 CBS 344.50 ATCC 23828 CBS 190.57 CBS 426.63 CBS 408.51 CBS 468.74 CBS 409.51 ATCC 10114 NRRL 1115 ATCC 22319 EPA 467 WM 05.3 wb153 IBT 12108 PC6 ZN 105 NRRL 800 AHU6525 AHU6527 CBS 395.95 HNO34 Dis326h ATCC 52326 Dis 203c YM2 DQ668351 AY428795 AF455450 DQ000625 AF456923 AJ230685 X93966 EF060464 AJ252333 AY213657 AJ252329 AJ252338 AJ252334 AJ970148 AJ000625 AY213665 AF033395 AY373941 AY373903 DQ249207 AF455544 AJ004895 EF105368 DQ810189 AF033423 AB097347 AB097348 AY213684 AF280758 DQ379015 Z48935 DQ315458 AB297794 286 461 461 552 519 519 552 487 649 652 652 652 649 555 649 511 529 514 500 468 500 500 500 468 468 562 562 562 549 519 552 519 519 1. 2. 3. 4. 5. American Type Culture Collection, USA Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands Northen Regional Research Laboratory, USA University of Washington Fungal Project, USA Pasteur Institute Collection Fungi, France 38 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro Anamorfismo Telomormismo Monascus ruber Absidia corymbifera Acremonium sp. Acremonium strictum Alternaria alternata Amylomyces rouxii (Mucor rouxii) Arthrinium phaeospermum Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus cleistominutus Aspergillus corrugatus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicus (Aspergillus aculeatus) Aspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzae Aspergillus rugulosus Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Aureobasidium sp. Bipolaris sp. Caldosporium cladosporioides Chaetomium funicola Chaetomium sp. Chrysosporium articulatum Chrysosporium keratinophilum Chrysosporium sp. Chrysosporium sp. Chysosporium sp. Cladosporium sp. Cladosporium sphaerospermum Emericella cleistominuta Emericella corrugata Emericella nidulans Emericella quadrilineata Emericella dentata Emericella rugulosa Discophaerina sp. Cochliobolus sp. Aphanoascus keratinophilus Aphanoascus fulvescens Aphanoascus sp. Aphanoascus reticulisporus 39 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico Anamorfismo Cunninghamella bertholletiae Curvularia lunata Curvularia trifolii Epidermophyton floccosum Exophiala jeanselmei Exophiala oligosperma, ( Melanchlenus oligospermus, Rhinocladiella atrovirens) Exophiala sp. Exophiala spinifera Exophiala xenobiotica Fusarium bulbicola (Fusarium sacchari) Fusarium lactis (Fusarium Moniliforme) Fusarium oxysporum Fusarium solani Fusarium sp. Fusarium subglutinans Fusarium verticillioides Geotrichum candidum Hormographiella aspergillata Malbranchea sp. Malbranchea sp. Microsporum audouinii (Microsporum rivalieri) Microsporum canis (Microsporum distortum) Microsporum ferrugineum Microsporum gypseum Microsporum langeronii Microsporum persicolor Microsporum praecox Mucor sp. Ochroconis sp. Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium Chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium commune Penicillium nalgiovense Penicillium sp. Telomormismo Cochliobolus lunatus Cochliobolus sp. Gibberella sacchari Nectria haematococca Gibberella sp. Nectria sp. Gibberella moniliformis Galactomyces geotrichum Coprinopsis cinerea Auxarthron sp. Auxarthron conjugatum Arthroderma otae Arthroderma gypseum Arthroderma persicolor 40 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico Anamorfismo Penicillium westlingii Rhizopus microsporus Rhizopus oryzae (Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus) Schizophyllum commune Trichoderma citrinoviride Trichoderma koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Trichoderma ovalisporum Trichoderma reesei Trichoderma sp. Trichophyton tonsurans Tricoderma viride 41 Telomormismo Hypocrea schweinitzii Hypocrea koningii Hypocrea sp. Hypocrea jecorina Hypocrea sp. Hypocrea rufa Referenze 1. D. E. Ciardo; Molecular Identification of Fungal Pathogens using the ITS Region; Diss. ETH 16410, 2006 2. G.S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras; Atlas of Clinical fungi; 2° ed., Universitat Rovira i Virgili, 2000 3. NCBI, Taxonomy Browser. http://ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 11.5. Albero 42 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras, delle specie usate in questo lavoro Ascomicota Euascomycetes Eurotiales Trichomaceae Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus cleistominutus Aspergillus corrugatus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicus Aspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzae Aspergillus rugulosus Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium Chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium commune Penicillium nalgiovense Penicillium sp. Penicillium westlingii Epidermophyton floccosum Ascomicota Euascomycetes Onygenales Onygenaceae Chrysosporium articulatum Chrysosporium keratinophilum Chrysosporium sp. Chrysosporium sp. Chysosporium sp. Malbranchea sp. 43 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico Ascomicota Euascomycetes Onygenales Arthrodermataceae Microsporum audouinii Microsporum canis Microsporum ferrugineum Microsporum gypseum Microsporum langeronii Microsporum persicolor Microsporum praecox Epidermophyton floccosum Ascomicota Euascomycetes Sordariales Chaetomiaceae Chaetomium funicola Chaetomium sp. Ascomicota Euascomycetes Hypocreales Hypocreaceae Acremonium sp. Acremonium strictum Trichoderma citrinoviride Trichoderma koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Trichoderma ovalisporum Trichoderma reesei Trichoderma sp. Trichophyton tonsurans Tricoderma viride Fusarium bulbicola Fusarium lactis Fusarium oxysporum Fusarium solani 44 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico Fusarium sp. Fusarium subglutinans Fusarium verticillioides Ascomicota Euascomycetes Chaetothyriales Herpotrichiellaceae Exophiala jeanselmei Exophiala oligosperma, ( Melanchlenus oligospermus, Rhinocladiella atrovirens) Exophiala sp. Exophiala spinifera Ascomicota Euascomycetes Pleosporales Pleosporaceae Curvularia lunata Curvularia trifolii Basidiomycota Hymenemycetes Stereales Schizophyllaceae Schizophyllum commune Zygomicota Mucorales Mucoraceae Absidia corymbifera Rhizopus microsporus Rhizopus oryzae Amylomyces rouxii Rhizopus microsporus Rhizopus oryzae Schizophyllum commune 45 Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 46 Ringraziamenti Ringrazio coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro. In primo luogo ringrazio il direttore dell’Intituto Cantonale di Microbiologia, il Dr. Orlando Petrini, per avermi concesso la possibilità di svolgere il mio lavoro di diploma presso il loro laboratorio di sierologia. Ringrazio la Dr.ssa Gladys martinetti per la fiducia che mi ha concesso in questi mesi e soprattutto per la scelta dell’argomento del lavoro di diploma; un lavoro che mi ha coinvolto pienamente. Ringrazio la Dr ssa Antonella Demarta Aeschbacher e la Dr.ssa. Simona Casati per avermi seguito durante l’elaborazione dei dati Non in minor modo rigrazio i tecnici in analisi biomediche Anna Paola Caminada, Marilena Chiaravalloti, Karin Gervasoni-Bolgiani, Tecla Fondrini per il loro importante supporto tecnico Ed in fine ringrazio il direttore della Scuola Medico Tecnica Andrea Boffini, le docenti Daniela Marcacci, Sonja Marci e Susan Gilbert.
