APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE UTILIZZO DI ENZIMI LIBERI

APPLICAZIONI
BIOTECNOLOGICHE
UTILIZZO DI ENZIMI LIBERI
Sono molto sensibili ai vari fattori influenzanti l’attività
enzimatica perché non inseriti in una cellula. Possono essere
impiegati in reattori industriali sono facendo la massima
attenzione all’ambiente e impedendo formazione di schiume.
Possono essere presenti in soluzione o fissati su substrato; nel
primo caso l’E si ritroverà nel prodotto o, se necessario, il
prodotto deve essere purificato, nel secondo si potrà riutilizzare
l’E in un secondo ciclo di produzione dopo aver estratto il
prodotto e/o si potranno programmare diversi stadi di
lavorazione con enzimi differenti sequenziali. La fissazione al
substrato richiede un procedimento di stabilizzazione perché
questi possano rimanere attivi in ambiente di lavorazione.
Esempi di stabilizzazione di enzimi:
enzima
sistema
effetto
β-galattosidasi Addizione di etanolo
Maggior termostabilità
α-amilasi
Addizione di Ca2+
Maggior termostabilità
chimiotripsina
Addizione di glicerolo Resistenza alla proteolisi
Le principali tecniche di immobilizzazione sono:
•
Adsorbimento: con supporti solidi scambiatori di ioni. Non si
formano sistemi molto stabili ma di facile attuazione, l’E in
eccesso viene lavato via prima dell’impiego
•
ancoraggio: su ceramica, vetro, carbone, sabbia,… che
viene attivata dotandola di opportuni gruppi leganti a cui
sarà attaccato l’E con legami covalenti
•
inclusione in gel che viene scaldati includendo l’E in un
reticolo spugnoso
•
incapsulazione: l’E è mantenuto in soluzione ma in
microcapsule filtrabili dotate di membrana permeabile a
substrato e prodotto ma non all’E stesso.
la scelta viene effettuata in base al costo complessivo
dell’operazione, all’efficienza e alla possibilità di rigenerazione.
Esempi di applicazioni di enzimi immobilizzati
Reaz.
enzima
processo
catalizzata
idrolisi
α-amilasi
Produzione di glucosio
papaina
Prod. aa da caseina
isomerizzazione
Glucosio isomerasi
Produzione di fruttosio
Trasferimento di Polinucleotide
Produzione di
gruppi
fosforilasi
polinucleotidi
L’utilizzo di E in campo industriale e agroalimentare avviene sia
con E isolati, sia con E inseriti in cellule, di solito batteri e lieviti;
il secondo modo è preferito se la lavorazione è polistadica (come
per es. la fermentazione alcolica) perché l’E non necessita di
rigenerazione.
Possono essere esocellulari o, se endocellulari, estratti dalla
cellula, talvolta utilizzati grezzi ma, specialmente quelli utilizzati
in campo medico, devono essere purificati.
L’impiego degli enzimi ha il vantaggio che non vi sono reazioni
collaterali, comparsa di ceppi competitivi e, rispetto alle sintesi
chimiche, grande specificità, attività catalitica e semplicità
d’impiego.
Esempi di applicazioni di enzimi tratti da cellule
enzima
origine
applicazione
amilasi
Bacillus subtilis
Produzione di glucosio e sciroppi
bromelaina ananas
Coadiuvante digestivo
lipasi
Pancreas, muffe Produzione formaggi e latticini
ureasi
Bacillus sp.
Trattamento acque e usi analitici
catalasi
Aspergillus sp.
Sterilizzazione del latte,
eliminazione H2O2 dai cibi
L’impiego dell’intero microrganismo è invece vantaggioso
quando sono necessari sistemi enzimatici complessi per cui
l’utilizzo del “sistema biochimico batterico” è molto più
conveniente che una sintesi polistadica chimica. Vengono
impiegati i “fermentatori” cioè un sistema che consente la
coltura di microrganismi in ambiente controllato (bioreattori se si
parla di cellule o di organismi superiori)
Gli stadi di lavorazione comportano:
•
allestimento del fermentatore: viene inserito il substrato di
coltura e sterilizzato, il terreno viene quindi inseminato con
l’organismo utilizzato a cui viene fornita la materia da
elaborare
•
produzione: fase delicata che avviene controllando
costantemente l’ambiente e i microrganismi coinvolti per
evitare contaminazione e retromutazioni.
•
recupero dei prodotti: si separano le cellule dal brodo
contenente il prodotto filtrazione o centrifugazione o, se il
prodotto è endocellulare, si distruggono con trattamenti
meccanici (macinazione), fisici (ultrasuoni) o chimici
(solventi) e poi si filtra per eliminare i frammenti cellulari.
Questi prodotti, ottenuti in modo semplice ed economico, hanno
talvolta lo svantaggio di contenere sostanze indesiderate,
tossiche o allergizzanti.
UTILIZZO DI CELLULE
Nell’industria alimentare è sviluppatissimo l’impiego di
microrganismi vivi aggiunti all’alimento in lavorazione.
Esempi di applicazioni con utilizzo di microrganismo vivi
produzione
microrganismi
pane e prodotti da forno, bevande
Lieviti: prevalentem.
alcoliche quali birra, vino, sakè,
Saccaromices
distillati,…
cerevisiae
yogurt, kefir, gioddu e latti fermentati, Batteri lattici (in
carni fermentate insaccate o no
prevalenza) che
(utilizzati come starter),
attuano la
aromatizzanti, salse di pesce,…
fermentazione lattica
Aceto, produzione di acidi diversi
Batteri acetici (in
(citrico, lattico,…), vegetali fermentati prevalenza), che
(crauti), olive in salamoia, cetrioli,…
attuano l’ossidazione
acetica
formaggi
Batteri lattici, Aspergilli
e Penicilli
oli vegetali quali trigliceridi, ac.
Batteri e miceti diversi
linoleico, burro di cacao,…
enzimi
Batteri, lieviti, tessuti
animali e vegetali
Dolcificanti nutrienti o a basso
Batteri e lieviti ma
contenuto calorico e aromi
spesso enzimi da soli
Applicazione di grande interesse zootecnico è la produzione di
biomasse batteriche (SCP = single cell protein o meglio MBP =
microbial biomass protein), di lieviti e di alghe, utilizzate per
esempio come mangimi. I batteri o lieviti impiegati possono
utilizzare come substrato sottoprodotti della lavorazione della
carta, etanolo e metanolo, resti dell’attività agricola e forestale,
lattosio,…
Questa tecnica ha i vantaggi di elevata rapidità di crescita,
quindi di alta produttività, buone qualità alimentari (es. alta
percentuale proteine ad alto valore biologico), facile separabilità
del prodotto.
I problemi sono invece rischi di allergie, elevato contenuto di
acido urico, costi delle materie prime.
BIOTECNOLOGIE
E PIANTE
Sia applicazioni tradizionali con incroci e selezioni, sia attraverso
l’ingegneria genetica, per ottenere piante con
•
Maggior resistenza a erbicidi e alle malattie
•
Maggior efficienza nel fissare l’azoto e ridurre quindi i
fabbisogni dei fertilizzanti
•
Maggior adattabilità a suoli aridi o salini
•
Maggior resistenza ad agenti atmosferici
•
Migliori caratteristiche nutrizionali
•
Migliori caratteristiche organolettiche
Nella coltura dei vegetali la velocità di crescita dell’organismo è
lenta ma vi è il vantaggio che le cellule sono totipotenti ed é
quindi molto facile generare cloni. Da un tessuto che viene
coltivato in sostanze ricche di nutrimento, si genera una massa
di cellule detta “callo” che viene frammentata e le cellule libere
genereranno l’embrione dell’intera piantina. Anche i calli da soli
possono essere utilizzati per produzioni in vitro di sostanze
vegetali (es. la vanillina) perché si riproducono più velocemente
della pianta e la resa è maggiore.
È applicata anche la tecnologia del DNA ricombinante; nella
cellula eucariota il gene da inserire viene codificato a partire
dall’RNA maturo (privo di introni) per opera della transciptasi
inversa, enzima contenuto nei retrovirus, da cui si ottiene una
sequenza nucleotidica priva di introni che verrà poi inserita nelle
cellule. Le tecniche usate più frequentemente sono:
la fusione di protoplasti ottenuti da cellule vegetali differenti con
formazione di cellule ibride che, in coltura produrranno un callo.
Possono essere indotte a fondersi cellule vegetali anche con
cellule animali. La fusione dei protoplasti è stimolata da
esposizioni a scariche elettriche.
Uso di un vettore come un batterio parassita (Agrobatterium
tumefaciens) che in natura induce la formazione di un tumore
nella pianta (il callo del colletto) trasferendo un suo plasmide
nelle cellule vegetali. Manipolando il DNA del plasmide, si
eliminano i geni che determinano la malattia sostituendoli con
l’informazione voluta.
metodo del cannone bombardando le cellule con microscopiche
particelle d’oro o tungsteno (materiale inerte) rivestite di DNA
da introdurre. Quando la cellula si autoripara ingloba nel suo DNA
quello così introdotto.
La selezione finale delle piantine con rDNA è fatta inserendo
anche DNA che conferisca caratteri visibili particolari o
resistenza ad un antibiotico. Si ottengono quindi piante dette
“transgeniche”
Esempi pratici:
•
utilizzo del gene del Bacillus turingensis (Bt) per la
produzione di sostanza insetticida inserito in piante di
cotone, patate, mais, pomodoro,…
•
produzione di pomodori Flavor Savour che non marciscono
velocemente (sono inibiti gli enzimi che attaccano la parete
cellulare)
•
blocco della maturazione dei pomodori con il gene
codificante un enzima che blocca la sintesi di etilene,
sostanza naturale (ma usata anche per la maturazione
indotta) prodotta dai vegetali.
BIOTECNOLOGIE
UOMO E ANIMALI
In zootecnia sia applicazioni tradizionali con incroci,
inseminazioni artificiali e selezioni, somministrazione di ormoni,
sia attraverso l’ingegneria genetica, per ottenere miglioramento
genetico di animali per
controllo delle malattie (es. ricerca di difetti genetici negli
embrioni)
•
migliori caratteristiche nutrizionali (es. produzione di
animali a carne più magra controllando l’ormone della
crescita)
•
maggior resa (es. quantitativo di latte prodotto, controllo
della sintesi proteica per far produrre lana migliore,
composizione del latte con più caseina per miglior resa in
caseificio)
•
produzione di alimenti modificati (es. latte vaccino con l’αlattoalbumina caratteristica del latte umano)
•
produzione di animali transgenici ai fini medici (es.
produzione di farmaci, di sieri en per la ricerca oncologica e
dei geni oncosoppressori , come ad es. “l’oncotopo” che
nasce già con tumore,)
•
terapie geniche allo studio
Le tecniche del rDNA si attuano generalmente sullo zigote, o sui
gameti, o sulle cellule embrionali ai primi stadi perché altrimenti
riguarderebbero un singolo tessuto e non sarebbero trasmissibili
alla prole. La tecnica utilizzata più di frequente é la
microiniezione
Gli studi di clonazione animale sono iniziati negli anni ’80 e nel
1997 è nata la pecora Dolly (per la tecnica usata vedi schema)
•
BIOTECNOLOGIE
E INQUINAMENTO
•
Per ridurre la produzione dei rifiuti liquidi o solidi delle
industrie agroalimentari utilizzando scarti di lavorazione
riciclandoli biologicamente per esempio con produzione di
biomassa batterica o biomassa proteica
•
In impianti di depurazione delle acque di scarico per
degradare composti organici con la contemporanea
produzioni di biogas che può essere impiegato come fonte
energetica alternativa
•
Rimozione biologica dall’ambiente di composti tossici
(utilizzo di nitrobatteri per l’eliminazione di composti
azotati inquinanti – vedi eutrofizzazione)
•
Abbattimento degli odori negli allevamenti zootecnici
(degradazione dei solfuri prodotti da parte di microrganismi
in biofiltri)
•
Sono allo studio microrganismi per la degradazione dei
prodotti di lavorazione dal petrolio (plastiche e oli minerali)