Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L.Spallanzani IRCCS -Laboratorio di Immunologia Cellulare- Dr. Domenico Viola TSLB Un nuovo standard a supporto della diagnosi dell’infezione da M. tuberculosis Test basati su IFN-γ Test in vitro che misurano l’IFN-γ rilasciato dai linfociti T in risposta ad antigeni tubercolari I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con l’antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo che contiene mitogeno (fitoemoagglutinina) Ricerca dell’IFN-γ dopo opportuna incubazione – assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE – presenza di IFN-γ = INFEZIONE presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO assenza di IFN-γ nel controllo MIT = DEFICIT IMMUNITARIO PRINCIPIO DEL TEST: Nil TBAg MIT QuantiFERON: test brevettato, certificato CE, FDA cleared, che, attraverso la misurazione dell’ IFN-γ prodotto in vitro, Normal altitude tubes a seguito di una stimolazione linfocitaria (T) specifica* in sangue intero, assicura un prezioso supporto alla diagnosi delle infezioni da M. tuberculosis High altitude tubes * Cellestis Limited e lo Statens Serum Institut (SSI) hanno siglato un accordo per l’utilizzo delle proteine M. tuberculosis specifiche nella piattaforma brevettata QFT-TB GOLD In-Tube www.adaweb.it Test basati su IFN-γ QuantiFERON-TB Gold® Metodo ELISA in-tube 1.Raccolta del sangue in provette eparinate (K neg, ESAT6 + CFP10 , mitogeno) 2.Incubazione per 16-24h a 37°C 3.Centrifugazione 4.Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ 1. ELISA ‘sandwich’ incubazione 120 min 2. Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura COLORE 3. Misura della DO e dosaggio dell’IFN-g contro una curva di taratura Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004 I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone-γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT Confronto tra i test per infezione latente Confronto tra i test per infezione latente Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004 Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004 % maximal IFN-gamma response ACCURATEZZA DEL TEST: MIT (mitogeno) 100 75 50 25 Mito g e n C o n ce n tra tio n u se d in Q F T -G o ld PHA 0 C o n c e n tr a tio n o f M ito g e n a concentrazione critica Un controllo della funzionalità immunitaria del Paziente: Risposta al Mit inversamente proporzionale alla immunocompromissione del Paziente www.adaweb.it SPECIFICITA’ DEL TEST: TBAg (ESAT-6, CFP-10, TB 7.7) Antigeni Antigeni BCG substrain Tuberculosis complex ESAT-6* CFP-10* TB7.7 M tuberculosis M africanum M bovis + + + gothenburg moreau tice tokyo danish glaxo montreal pasteur - Ceppi ambientali M abcessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonii M intracellulare M kansasii M malmoense M marinum M oenavense M scrofulaceum M smegmatis M szulgai M terrae M vaccae M xenopi ESAT-6* CFP-10* TB7.7 + + + - Antigeni specifici brevettati (SSI, Denmark) *: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) Cellestis con diritti a livello mondiale *: CFP-10 (culture filtrate protein-10) OPZIONI DEL TEST: 2 Provette (2P) – 3 Provette (3P) Pazienti “Clinici” - Bambini - Pazienti con sintomi specifici - TB non polmonare - Ricerca (monitoraggio terapia, etc.) Screening di comunità - Operatori Sanitari: (Ospedali, Università, etc.) - Militari, Immigrati, Carcerati, etc. - Associazioni assistenziali governative e non, etc. - Personale viaggiante: (linee aeree, linee ferroviarie, trasporto pubblico urbano) 3P - Servizio pubblico: (Polizia, Pompieri, Assistenti ambulanze, etc.) 2P Pazienti “Immunocompromessi” - HIV/AIDS - Reumatologia e Dermatologia - Dialisi - Candidati a Trapianti - Pazienti con morbo di Chron Screening dei contatti - Personale reparti a rischio (pronto soccorso, etc.) - Ambienti familiari, di lavoro, etc. - Controllo sul territorio www.adaweb.it QuantiFERON®: 1° Step: Prelievo Dopo stimolazione: Plasma conservabile a 2-8° per 4 settimane QuantiFERON®: 2° Step: IFN-γ ELISA 50µl Coniugato + 50µl Plasma/Standard 120min. Incubazione TA Lavaggio 100ul TMB 30min. Incubazione TA 50ul Stop Lettura 450nm /620-650nm Completamente automatizzabile, direttamente dal tubo primario Riproducibilità 99.3% QuantiFERON®: 3° Step: Calcolo dei risultati Disponibilità di Software dedicato: Test a 2 Provette Test a 3 Provette (valutazione della funzionalità immunitaria) Risultato Qualitativo: Negativo, Indeterminato, Positivo Risultato Quantitativo: IFN-γγ UI/mL www.adaweb.it Scenario of testing: 1,000 people and say 5% have true MTB infection. If we use the estimates of sensitivity and specificity for QFT, TST and T-Spot from Diel et al, Chest, 2010 which test is the most accurate? TEST PPV (%) NPV (%) Accuracy (%) QFT 84.8% 99.2% 98.5% T-Spot 25.4% 99.3% 86.4% QFT is far more accurate than either the TST or T-Spot.TB, providing the correct answer for 985 of the hypothetical 1,000 people (only 15 people incorrect) GRAZIE PER L’ATTENZIONE Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L.Spallanzani IRCCS -Laboratorio di Immunologia Cellulare-