Cellule staminali
• Cellule primarie
• Self-renewal: si rinnovano per divisione cellulare
• Unlimeted potency: si differenziano in qualunque tipo cellulare
specializzato
Cellule staminali embrionali
Blastocisti
Cellule staminali adulte
Cordone ombelicale, midollo osseo
Cellule staminali
Totipotenti: morula
Possono formare i tessuti
Embrionali e extraembrionali
Multipotenti: blastocisti
Possono formare i tessuti
embrionali
Multipotenti:adulte
Producono cellule di una famiglia
Correlata. Ex: ematopoietiche
Unipotenti: adulte
producono un solo
tipo cellulare
Le cellule staminali embrionali (ES) di
topo presentano il vantaggio di poter
essere mantenute in coltura e la
totipotenza preservata grazie alla
presenza, nel mezzo di coltura, del fattore
LIF (Leukemia Inhibitor Factor). In queste
condizioni le cellule ES possono essere
manipolate geneticamente e, grazie alla
ricombinazione omologa, un frammento di
DNA esogeno può essere integrato in un
preciso sito del genoma (Jasin et al.,
1996).
Transgenesi
intervento sperimentale volontario di inserimento di un
gene esogeno nel genoma di una specie animale o
vegetale. Knock in
Il gene può appartenere alla stessa
specie o può derivare da specie differenti.
quando il gene esterno è:
• integrato nel suo genoma;
Organismo
transgenico
• espresso correttamente (in genere si usa un gene
che codifica una data proteina)
e selettivamente in uno o più tessuti dell'animale;
• integrato nella linea germinale e per conseguenza
trasmissibile dall’animale fondatore alla progenie.
Jaenisch 1974: topi mutanti, frammenti di DNA di SV40 iniettati nella cavità celomatica di blastocisti murina mantenuti nel topo adulto.
Gordon e Ruddle 1980: topi transgenici. Questi ricercatori sono stati i primi a
mettere a punto la tecnica di microiniezione del DNA ricombinante all'interno
dello zigote (ovulo fertilizzato ) e a dimostrare la trasmissione del transgene alla progenie da parte degli animali ottenuti con questa tecnica.
Palmiter e Brinster nel 1982: ceppo di topi transgenici ottenuti microiniettando il gene dell’ormone della crescita umano. Questo esperimento ha prodotto un
ceppo di topi molto più grandi dei loro omologhi non transgenici, dimostrando
che era possibile modificare non solo il genotipo ma anche il fenotipo degli animali
mutati.
Metodi per ottenere un animale transgenico
• Microiniezione del DNA nell’ovocita fertilizzato
• Microiniezione di cellule staminali nell’ovocita fertilizzato
• Nuclear Transfer di cellule staminali trasformate in vitro
• Mediata da retrovirus
• Mediata da spermatozoi
Microiniezione del DNA
nell’ovocita fertilizzato
•Prelievo dopo 15-20h dalla fecondazione
degli zigoti dalla femmina e microiniezione
del DNA nel pro-nucleo maschile
• Impianto dopo 24h di coltura in una
pseudo-madre
• Analisi sui nati a 3 settimane su DNA
estratto dalla coda
• Efficienza del 10%
Ricombinazione casuale,
raramente omologa
Pronucleo
femminile
Pronucleo
maschile
Ovulo
fertilizzato
Pipetta di
fissaggio
Transgene
Pipetta di
iniezione
Femmina che ha
subito l’impianto
Fondatore
transgenico
Microiniezione di cellule
staminali nell’ovocita fecondato
coltura
Cellule ES
Blastocisti
donatrice
Massa
cellulare
interna
Cellule staminali da blastocisiti
transfettate con il transgene associato
a resistenza antibiotica
Transfezione
Dopo selezione trasferite in blastocisti
riceventi
Arricchimento in
cellule transfettate
Impianto in madri pseudogravide
Microiniezione
nella blastocisti
Transgene
Blastocisti
ricevente
Progenie mosaico (chimere)
Selezione del fondatore transgenico
Impianto
Ricombinazione omologa
Fondatore
transgenico
Selezione delle cellule staminali transgeniche
Ricombinazione omologa
HB1
Neor
TG
HB1
TG
HB2
HB2
TK
transgene
Neor
:Resistenza al G418
TK
:sensibilità al
gancyclovir
cromosoma
ricombinazione omologa
HB1
Neor
TG
HB2
cromosoma
Le cellule sono selezionate in positivo con il G418 e non avendo il gene per la
TK sono resistenti al Gancyclovir
Selezione delle cellule staminali transgeniche
Ricombinazione eterologa
HB1
Neo
r
HB1
TG
HB2
TK
TG
HB2
X
transgene
Neor
:Resistenza al G418
TK
:sensibilità al
gancyclovir
cromosoma
ricombinazione eterologa
HB1
Neor
TG
HB2
X
TK
cromosoma
Le cellule sono selezionate in positivo con il G418, ma negativamente per la
presenza della timidina chinasi
X, gene normale
X*, transgene
Topo marrone
Colore marrone A/A
ES ricombinanti
Topo nero
Colore nero a/a
Impianto delle ES
Progenie chimerica:
Possibili gameti:
A/X A/X* a/X
Incrocio di un topo chimerico con un
topo nero, a/a, X/X
Si originano topi neri e topi marroni
Analisi dei topi marroni per individuare
gli eterozigoti
Incrocio tra eterozigoti per ottenere
omozigoti
A/A, X/X* x A/A, X/X*
Nuclear transfer di cellule
trasformate in vitro
Clonazione
Cellule staminale trasfettate e selezionte
ICM
Trasfezione
Neo introne esone
Nuclei delle cellule microiniettati in un ovocita
Anucleato
Ovulo
enucleazione
Embrione impiantato nella pseudo-madre
Nati tutti transgenici
Selezione
cellule
Nuclei purificati
nucleo
Efficienza bassa 1/centinaia
Fusione attivazione
Coltura embrione in vitro
Impianto
Topo transgenico
Transgenesi mediata da retrovirus
• Embrioni prelevati a 4-8 cellule
• Infezione con un retrovirus reso non patogeno
con alcune parti sostituite con il gene di interesse
• Impianto nella pseudo-madre
• Alto numero di nati a mosaico
• Possibili danni associati al retrovirus
Transgenesi mediata
da spermatozoi
Interazione spontanea
DNA/spermatozoo
Fecondazione
Selezione della prole sulla
analisi del DNA prelevato
da coda o orecchio
Knock out
Studiare la funzione di un gene e della sua proteina
Riprodurre in un modello animale uno stato di malattia
Eliminazione di un gene o delezione di 1 o + esoni
Eliminazione di una proteina o di un dominio
funzionale
Gene targenting
Ricombinazione omologa
Topo Knock out
Produzione di una proteina mutata
Espressione della proteina abolita
Targeting genico
Topo
Vettore contenente il transgene e i marker
Cellule staminali
Ricombinazione omologa:
Il DNA da inserire contiene parecchie kbasi omologhe al genoma di topo
In lievito la ricombinazione omologa avviene nel corretto locus con
frequenza molto alta
Nei mammiferi la ricombinazione omologa nel corretto locus avviene con
frequenza molto bassa. Southern blot e PCR per lo screening dei cloni.
Knock-out convenzionale
Ricombinazione omologa nelle
cellule staminali embrionali. (topo marrone)
Selezione con G418 e gancyclovir
Iniezione delle cellule transgeniche
in una blastocisiti e impianto in una madre pseudogravida. (topo nero)
Progenie chimerica
Incrocio di eterozigoti per ottenere
omozigote
Knock-out e ricerca di base
Knock-out con fenotipo normale: ipotesi che altre proteine compensino
la perdita della proteina abolita
Knock-out con fenotipo inducibile da stress:la funzione genica è associata
alla comparsa di stress ambientali o a eventi patologici. Ex: knock-out per
il recettore dell’interferone I da fenotipo normale, ma mostra aumentata
suscettibilità alle infezioni virali rispetto ai controlli.
Knock-out con fenotipo letale: geni necessari per lo sviluppo embrionale che
non consentono di ottenere topi adulti
Knock-out condizionale
Transgenesi in cui il knock­out di un gene può essere controllato temporalmente e spazialmente
Transgenesi binaria: transgene effettore e transgene target. Il transgene effettore non influisce sull’espressione dei geni endogeni in quanto agisce solo sul transgene target
Fase 1 Costruzione di knock­in per il transgene target (espresso corret­
tamente sino all’excisione)
Fase 2 Costruzione di knock­in per il transgene effettore
Fase 3 Incrocio tra i due knock­in per ottenere il knock­out condizionale
2 tipi di transgenesi binaria
1, effettore:fattore di trascrizione
Il costrutto del transgene effettore è costituito da un promotore tessuto­specifico
(TSP) che regola la produzione di una proteina chimerica costituita dal repressore della Tetraciclina di E. coli (tetR) e dal dominio di transattivazione di VP16 (herpes simplex). Questa proteina tTA ha due domini uno lega la tetraciclina, l’altro una sequenza di 19bp nell’operone per la tetraciclina nel transgene attivandolo.
Effettore inducibile
Tet-off: Il transattivatore regolato dalla tetraciclina (tTA) non può legare il DNA quando è presente l’induttore
hCMV1E1: TSP, attivo in numerosi tessuti
Tet-on: nel sistema inverso (rtTA) tTA lega il DNA solo quando è presente l’induttore. L’induttore utilizzato è la doxiciclina (Dox), analogo della tetraciclina, attiva rtTA e inattiva tTA in maniera efficiente a dosi al di sotto dei livelli citotossici. Poiché la Dox può attraversare la placenta nel
topo transgenico e
regolare efficientemente l’espressione genica
durante l’embriogenesi, questi sistemi vengono
impiegati per evitare l’espressione di un
transgene letale nell’embrione.
EFFETTO REVERSIBILE
2, effettore: ricombinasi
Ricombinasi Cre e Flp: enzimi che fanno parte della famiglia delle integrasi ricombinasi sito­
specifiche. La ricombinasi Cre è presente in natura nel batteriofago P1 ed ha un ruolo nel ciclo lisogenico, in quanto serve per l’integrazione del genoma fagico in quello batterico.
La ricombinasi Flp deriva dal lievito Saccharomyces cerevisiae.
Le due ricombinasi sono in grado di riconoscere specifiche sequenze di DNA chiamate rispettivamente sito loxP e sito FRT. Filamenti di DNA fiancheggiati da una coppia di tale siti vengono definiti “floxed” o “fliped”. I siti loxP e FRT sono costituiti da due distinte sequenze palindromiche di 13 nucleotidi ciascuna interrotte da una sequenza asimmetrica di 8 nucleotidi detta “spacer” che conferisce direzionalità al sito. In base alla direzione ed alla posizione dei siti loxP oppure FRT su un filamento di DNA la ricombinasi Cre oppure Flp è in grado di catalizzare reazioni irreversibili di tre diversi tipi: Inversione:i siti loxP/FRT si trovano
sullo stesso filamento di DNA ed hanno direzioni opposte. Traslocazione: i siti loxP/FRT si trovano su due filamenti diversi di DNA. Excisione: i siti loxP/FRT si trovano sullo stesso filamento ed hanno la stessa direzione. EFFETTO IRREVERSIBILE
Analisi di lineage cellulare
La cre o la FLP sono regolate da un promotore tessuto specifico
Il gene reporter è preceduto da uno STOP fiancheggiato da 2 siti lox o FRT
• se il TSP non è attivato non si
ha espressione del reporter
• se il TSP è espresso si ha excisione dello STOP e espres­
sione del reporter • l’irreversibilità della ricombinasi
fa sì che il transgene si esprima nelle cellule figlie dove il TSP non è più attivo
Target
Reporter: GFP, LacZ
TSP: promotore tessuto­
Specifico
Target
UP: promotore ubiquitario
Target
Verifiche per la corretta espressione dei transgeni
• Effetti di posizione nella linea che esprime la ricombinasi Cre/FLP
Inserzione di più copie del transgene floxato/flippato nel genoma: possibili instabilità cromosomiche, aneuploidia.
• Importante: disponibilità di elementi regolatori della trascrizione che siano in grado di attivare l’espressione della ricombinasi cre in tutta una gamma di tessuti e a stadi diversi dello sviluppo. Attivazione temporale e spaziale dell’espressione della ricombinasi Cre
Utilizzo di vettori, cromosomi artificiali:
Derivazione da lievito: YAC si propagano in lievito contengono alcune Mbasi
Derivazione da fago P1: PAC si propagano in E. coli contengono sino a 300Kbasi
Derivazione da batteri: BAC si propagano in E. coli contengono sino a 300kbasi
Molti geni sono essenziali per la vita,
lo sviluppo, la fertilità del topo.
Il knock-out tradizionale di tali geni
non consente la creazione di un topo
knock-out
Knock-out condizionale
Tecnologia Cre/lox
Pharming
Utilizzo di animali per la produzione di farmaci e sostanze utili all’uomo
Nonostamte sia difficile e costoso i benefici possono essere
potenzialmente elevati
Biotech company: soldi e aumento vendite
Persone ordinarie: riduzione del costo dei farmaci
Sostituisce produzione di farmaci in E. coli, lievito, cellule animali:
Monitoraggio e campionamento continuo
Espansione e strumentazione nuova
Modificazione di proteine permesse solo da cellule di mammifero
Animali come bioreattori
Transgenesi utilizzata nella produzione di animali bioreattori
Espressione sperimentale di geni umani in mammiferi:
OVINI
CAPRINI
BOVINI
SUINI
CONIGLI
LATTE (caratteristiche migliori per estrazione)
SANGUE
TESSUTI
Previsto uso di somatotropina bovina per aumentare la produzione nei Paesi estra­UE.
In Europa i trattamenti ormonali sugli animali sono proibiti.
Ex: anti-emorragico antitrombinaIII nella capra (latte)
(08-06-2006 1° farmaco transgenico in commercio)
alfa-1 antitripsina per terapia respiratoria nella pecora (latte)
proteina C-reattiva nei suini
Prove cliniche in corso
Microiniezione nel pronucleo
EX: espressione di un fattore di coagulazione nel latte vaccino
Il gene per il fattore è fuso a un promotore per una proteina del latte
Assicura che li transgene sia espresso
solo nel latte
Molte copie di DNA sono microiniettate
nel pronucleo maschile di un uovo fecon­
dato Impianto in una pseudo­madre
La microiniezione nel pronucleo ha effi­
cenza molto bassa
(1­5 transgenici su 100 nati)
Nuclear transfer
clonazione
Trasfezione di cellule adulte con il transgene e un gene per selezione antibiotica
Selezione delle cellule resistenti
Il nucleo di tali cellule è trasferito in uovo in cui è stato rimosso il proprio nucleo
Impianto
Poiché tutti gli ovuli contengono il DNA transgenico, il 100% degli animali è transgenico
Ri-differenziamento delle cellule adulte
Aspetti negativi della clonazione
Integrazione del transgene nel genoma è:
• rara
• casuale:può inserirsi in regioni che possono essere
deleterie per il gene stesso o per il gene in cui si
inserisce
• molti animali nascono con difetti:
sotto- sovra-peso, organi interni sottosviluppati o
deformati
• nessuna garanzia che i nati transgenici siano sani,
esprimano il transgene in grande quantità e nel
tessuto giusto
Percentuali di successi di clonazioni in diversi animali
Utilizzate cellule adulte
Specie
s
Number of
oocytes used
Number of
live offspring
Notes
Mouse
2468
31 (1.3%)
-
Bovine
440
6 (1.4%)
2 died
Sheep
417
14 (3.4%)
11 died
within 6
months
Pig
977
5 (0.5%)
-
Goat
285
3 (1.1%)
-
Yanagimachi, R. 2002. "Cloning: experience from the mouse and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology. 21 March,
187.
Mammal Cloning Timeline
1984 – A live lamb was cloned from sheep
embryo cells
Megan and Morag
1986 – Early embryo cells were used to clone
a cow
1993 – Calves were produced by transfer of
nuclei from cultured embryonic cells
1995 – Two sheep, named Megan & Morag,
were cloned using embryo cells
Dolly
1996 – Birth of Dolly, the first organism to be
cloned from a fully differentiated adult cell
1997 – Transgenic sheep named Polly was
cloned containing a human gene
http://www.cnn.com/2001/
WORLD/europe/08/06/clo
ne.critics/index.html
From: student presentation Aman Arya, Nancy Chen, Dan Perz, Dave Reichert, Ronnie
Wong
Tetra
1998 – 50 mice were cloned in three
generations from a single mouse
1998 – 8 calves were cloned from a single
adult cow, but only 4 survived to their first
birthday
1999 – A female rhesus monkey named Tetra
was cloned by splitting early embryo cells.
2000 – Pigs and goats reported cloned from
adult cells
2002 – Rabbits and a kitten reported cloned
from adult cells
http://hs.houstonisd.org/h
spva/academic/Science/
Thinkquest/gail/text/bene
fits.html
Dolly with her surrogate mother
Dolly
• Born in July 1996 at the Roslin
Institute in Scotland
• First mammal to be cloned
from an adult mammal using the
nuclear transfer technique
Dolly with her first
newborn, Bonnie
• 277 attempts were made
before the experiment was
successful
•Dolly died in February 14, 2003
of progressive lung disease at
the age of 6; whereas normal
sheep can live up to 12 years of
age.
Mammal Cloning allows propagation of
endangered species
http://www.howstuf
fworks.com/cloning
.htm/printable
January 8, 2001 Noah, a baby bull gaur, became the first
clone of an endangered animal.
Xenotrapianti
Utilizzo di animali transgenici come donatori di organi per trapianti umani Tentativi con scarso successo con cuore, fegato e reni dei primati
Possibile utilizzo degli organi dei suini:
• dimensioni organi simili a quelli dell’uomo
• creazione di transgeni che aboliscano il rigetto iperacuto e tardivo (knock­out dei geni per molecole di superficie cellulari riconosciute come estranee)
• creazione di transgeni che eliminino il rigetto T­mediato
Rischio:
Nel maiale sono presenti i retrovirus (PERV, porcine endogenous retrovirus) e i retrotrasposoni.
Elementi genetici mobili, che costituiscono quasi il 50% del genoma dei mammiferi
Possono staccarsi da un distretto e introdursi in altre zone del genoma con azione mutagena.
Tali elemanti si sono introdotti durante l’evoluzione e sono in equilibrio che evita Danni genetici. In caso di xenotrapianto si potrebbe perdere questo equilibrio
Dimostrato il passaggio di retrovirus endogeni di maiale in cellule umane coltivate
Terapia genica
La terapia genica è quell'intervento tendente a modificare localmente
la condizione del fenotipo, alterato da una mutazione, attraverso la
sostituzione funzionale del gene alterato col corrispondente gene
sano.
Interessa solo la linea somatica
Terapia genica
SCID: severe combined immunodeficiency, causata da mutazioni nella
proteina γ dei recettori per alcune IL necessarie per lo sviluppo dei
linfociti B e T. Gli affetti da SCID sono privi di un sistema immunitario
funzionante.
Il gene γIL è sul cromosoma X, quindi in maschi con la mutazione sono
affetti, le femmine eterozigoti per la mutazione sono sane ma portatrici
Affetto da SCID
Vissuto in “bolla di plastica” in condizioni sterili.
Nel 1980 gli viene trapiantato il midollo osseo,
donatrice la sorella.
Dopo mesi insorgono complicanze, febbre, vomito e
diarrea. È costretto a uscire dalla bolla.
Nel 1984 muore in seguito a molteplici tumori insorti
a causa della presenza di Epstein Bar virus non
segnalato nel midollo della sorella
Il ragazzo della bolla
di plastica. David Phillip Vetter
September 21, 1971 – February 22, 1984
1990: primo caso di cura di SCID con terpaia genica su di una
bambina di 4 anni.
Le cellule del sangue messe in coltura e transfettate con il gene
corretto e reinfuse nella paziente
Da allora pochi i tentativi con successo dal punto di vista clinico.
Le numerose ricerche sono ancora volte alla messa a punto di sistemi
efficienti e sicuri di terapia
In vivo: Viene attuata in tutti quei casi in cui le cellule non possono essere messe in cultura o prelevate o reinfuse come quelle del cervello o del cuore e della maggior parte degli organi interni. In questo caso il gene d’interesse viene inserito, tramite un opportuno vettore, nell’organismo direttamente per via locale o sistemica.
Ex vivo:
In generale, il protocollo adottato nella terapia genica consiste nel prelevare le
cellule di interesse dal paziente, a metterle in coltura e a transfettarle o infettarle
con un virus ingegnerizzato con il costrutto contenente il gene normale; Tale procedura è sicuramente la più lunga e la più costosa delle due ma permette di selezionare ed amplificare le cellule d’interesse ed inoltre gode d’una maggior efficienza. E’ attualmente la modalità più utilizzata ma è riservata solamente a quei casi in cui sia possibile prelevare, mettere le cellule in cultura e reinserirle nell'organismo Metodologie del trasferimento del DNA
Non virali:
• Microiniezione in singole cellule del DNA nudo
• Liposomi, vescicole sferiche cationiche legano il DNA che a pH neutro è negativo. 0,1% del DNA introdotto è espresso
• Polimeri cationici, azione simile a quella dei liposomi
• Gene gun, inviano nella cellula particelle microscopiche d’oro o di tungsteno ricoperte da DNA (al momento non esistono studi sull’uomo, ma solo su animali)
Virali:
Retrovirus, lentivirus, Adenovirus, herpesvirus attenuati
Virali:
Retrovirus: hanno la capacità di integrare il loro DNA all’interno dei cromosomi delle cellule bersaglio determinando l’inserimento stabile del gene nei cromosomi della cellule infettata e il suo trasferimento a tutte le cellule figlie; i retrovirus infettano solo cellule che stanno proliferando; Lentivirus, come l'HIV: che permettono di trasferire materiale genetico anche in cellule che non proliferano, come le cellule "mature" (es. neuroni, cellule del fegato ) o in cellule particolarmente refrattarie ai retrovirus (es. cellule staminali prelevate del midollo osseo); Virus adenoassociati che integrano il loro DNA nei cromosomi della cellula ospite come i retrovirus, ma hanno rispetto a questi il vantaggio di essere per natura innocui; difficilmente trasportano geni di grandi dimensioni. Adenovirus:che non si integrano nei cromosomi della cellula ospite, ma possono trasportare geni di grosse dimensioni; tuttavia la loro espressione non dura nel tempo. Virus dell’herpes simplex infettano soltanto alcuni tipi di cellule, in particolare i neuroni e sono quindi indicati per la terapia di patologie neurologiche. I limiti della terapia genica
La sicurezza della procedura
Questo è un problema particolarmente evidente per i vettori virali. Alcuni
di questi derivano infatti da virus pericolosi, come l’HIV. E’ quindi
necessario che prima dell’utilizzo questi vettori siano privati della virulenza
originaria del virus e mantengano invece inalterata la capacità di infettare
le cellule bersaglio. Efficienza di trasferimento
Negli studi sulla terapia genica, la maggior parte degli sforzi si concentra
oggi sulla ricerca di vettori in grado di trasferire il DNA in modo efficiente
e di inserirlo stabilmente nelle cellule. Selettività del bersaglio
In questi ultimi anni sono stati messi a punto una varietà di vettori, alcuni
dei quali in grado di fare esprimere il gene estraneo in uno specifico tipo
cellulare (come i globuli bianchi, le cellule del muscolo, delle vie respiratorie
ecc…). Durata dell’espressione del gene trasferito
La terapia genica risulta praticamente inutile se l’espressione del gene "estraneo" non viene mantenuta per un tempo sufficiente. Le ricerche mirano a sviluppare sistemi che permettono un espressione duratura, in modo da sottoporre il paziente ad un unico trattamento, o al limite a trattamenti ripetuti a distanza di qualche anno. La reazione immunitaria
Come ogni altra sostanza estranea, il prodotto del gene nuovo, il gene stesso e soprattutto il vettore possono scatenare una risposta immunitaria da parte dell’organismo ospite. Questa può portare all’eliminazione delle cellule modificate geneticamente, o all’inattivazione della proteina prodotta dal nuovo gene, annullando quindi tutti gli effetti della terapia. Nello sviluppo delle nuove strategie di terapia genica si cerca di evitare per quanto possibile che il vettore o il gene estraneo producano una reazione immunitaria. Nel 1989 è stata approvata la prima sperimentazione sull’uomo di un protocollo di terapia genica. Da allora, di più di mille protocolli sono stati approvati in tutto il mondo; di questi alcuni si sono conclusi, altri sono in corso. Più del 90% delle sperimentazioni sono in fasi molto precoci del protocollo (fase I o II) (vedi figura1). Queste fasi iniziali permettono di valutare l’eventuale tossicità del trattamento, l’efficacia del trasferimento genico e l’espressione a breve/medio termine del materiale genetico introdotto. E’ nelle fasi successive (dalla III) che si valuta invece in modo più approfondito la reale efficacia del trattamento in funzione della cura. Ad oggi, la FDA americana (Food and Drug Administration), l’ente governativo cui spetta l’approvazione di nuovi trattamenti terapeutici affinché possano essere introdotti nella pratica medica corrente, non ha autorizzato la commercializzazione di nessun prodotto di terapia genica. Dal 1998 al 2005
Dal 1998 al 2005
