http://www.nature.com/scitable/ebooks/essentials-of-cell-biology14749010/16433210#bookContentViewAreaDivID
Cenni al controllo
dell’espressione genica
Biotecnologie_2012
Il controllo differenziale della trascrizione e
della traduzione è alla base delle alterazioni
della funzione cellulare (1)
I geni codificano per le proteine e le proteine dettano la funzione delle cellule:
Le migliaia di geni espressi da una cellula determinano quello che la cellula farà.
Ogni passo del flusso di informazioni dal DNA al RNA alla proteina dà alla cellula un potenziale punto di controllo per autoregolare le sue funzioni e aggiustare la quantità e tipo di proteina che sintetizza.
Ad ogni momento, la quantità di una data proteina riflette l’equilibrio fra le vie biochimiche sintetiche e degradative.
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Come viene regolata l’espressione genica? (2)
Il processamento del trascritto fornisce un ulteriore livello di regolazione per gli eucarioti, e la presenza del nucleo rende cià possibile.
Nei procarioti, la traduzione di un trascritto inizia prima che la trascrizione sia completata, a causa della vicinanza dei ribosomi alle nuove molecole di mRNA.
Al contrario, negli eucarioti, i trascritti sono modificati nel nucleo prima di venire esportati nel citoplasma per la traduzione.
Come viene regolata l’espressione genica? (1)
Le quantità e tipo delle molecole di mRNA di una cellula riflettono la funzione di quella cellula:
Ogni secondo vengono prodotti migliaia di trascritti in ogni cellula.
Il principale punto di controllo dell’espressione genica si trova di solito subito all’inizio del processo di produzione della proteina: l’inizio della trascrizione della molecola di mRNA.
La trascrizione del RNA fornisce un un efficiente punto di controllo dato che da una singola molecola di mRNA si possono ottenere molte proteine.
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Degradazione degli mRNA
Le cellule riescono rapidamente ad aggiustare i loro livelli di proteine mediante degradazione enzimatica degli RNA trascritti e delle proteine esistenti.
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1
Trascritti degli eucarioti
I trascritti primari sintetizzati dalla RNA polimerasi contengono sequenze che non faranno parte del mRNA maturo:
Introni: vengono rimossi prima che il mRNA maturo lasci il nucleo.
Le rimanenti regioni del trascritto, che includono le regioni codificanti le proteine, esoni, vengono «spliced» per dare il mRNA maturo.
Negl i eucarioti i trascritti vengono inoltre modificati alle estremità, processi che influenzano la loro stabilità e traduzione. http://www.nature.com/scitable/ebooks/essentials-of-cell-biology-14749010/16433210#bookContentViewAreaDivID
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Come fanno le diverse cellule ad esprimere i
geni di cui hanno bisogno?
Ad ogni momento, soltanto una frazione dei geni viene espressa.
La gran diversità dei profili di espressione genica,
caratteristica dei vari tipi cellulari, si manifesta perchè le cellule hanno diversi insiemi di regolatori della trascrizione.
Alcuni lavorano per aumentare la trascrizione mentre altri per impedirla o sopprimerla.
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Normalmente la trascrizione inizia quando una RNA polimerasi si lega ad una sequenza promotore sulla molecola del DNA.
Questa sequenza è quasi sempre localizzata appena sopra il punto dell’inizio per la trascrizione (verso l’estremità 5’ del DNA), ma può anche essere localizzata a valle (verso l’estremità 3’).
Altre sequenza del DNA, sequenza «enhancer», giocano un importante ruolo nella trascrizione, fornendo siti per il legame di proteine regolatrici che influenzano l’attività della RNA polimerasi.
Il legame delle proteine regolatrici ad una sequenza «enhancer» provoca un’alterazione della struttura della cromatina che o promuove o inibisce il legame della RNA polimerasi e il legame del fattore di trascrizione.
Una struttura della cromatina pià lassa (EUCROMATINA) è associata ad attiva trascrizione genica.
Una struttura più compatta della cromatina (ETEROCROMATINA) è associata ad inattività trascrizionale.
Modulazione della trascrizione.
Una proteina attivatrice legata al DNA a livello di una sequenza “enhancer” a monte può attrarre alla regione del promotore delle proteine che attivano la RNA polimerasi (verde) e quindi la trascrizione. Il DNA può fare un ansa su se stesso favorendo l’interazione fra una proteina
attivatrice e altre proteine che mediano l’attività della RNA polimerasi. http://www.nature.com/scitable/ebooks/essentials-of-cell-biology-14749010/16433210#bookContentViewAreaDivID
La struttura a nucleosomi della cromatina: Ogni nucleosoma contiene
8 proteine istoniche (blu) e il DNA si avvolge attorno a queste strutture
istoniche per ottenere una forma avvolta più condensata. Per meglio accomodarsi
all’interno della cellula, lunghe porzioni del DNA a doppio filamento si si
impacchettano strettamente
in strutture dette cromosomi. http://www.nature.com/scitable/ebooks/essentials-of-cell-biology-14749010/16433208#bookContentViewAreaDivID
http://www.nature.com/scitable/ebooks/essentials-of-cell-biology-14749010/16433210#bookContentViewAreaDivID
2
La struttura della cromatina nell’interfase:
L’eterocromatina è più condensata dell’eucromatina. :
• Quanto più condensata è la cromatina tento meno è
accessibile ai fattori di trascrizione e alle polimerasi.
Alcune proteine regolatrici influenzano la trascrizione di geni diversi.
Ciò avviene perchè esistono copie multiple dei siti di legame per le proteine regolatrici all’interno del genoma di una cellula.
Perciò, le proteine regolatrici possono giocare ruoli differenti su geni diversi:
uno dei meccanismi mediante i quali le cellule riescono a coordinare la regolazione di molti geni contemporaneamente.
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Come fa l’espressione genica ad aumentare o diminuire in risposta alle alterazioni ambientali?
Nei procarioti, alcune proteine regolatrici sono spesso controllate dalla disponibilità di nutrienti.
Ciò permette ai batteri di aggiustare i loro quadri di trascrizione in risposta alle condizioni ambientali.
Inoltre, dei siti regolatori sul DNA dei procarioti si trovano vicino ai siti dei promotori della trascrizione.
Esempi
Battere con sovrabbondanza di aminoacidi che segnala l’«accensione» di alcuni geni (es. di proteine che metabolizzano gli AA) e lo «spegnimento» di altri (es. di proteine che sintetizzano gli AA).
Alcuni AA si possono legare a proteine che svolgono una regolazione positiva: attivatori.
Le proteine attivatori si legano a siti regolatori sul DNA vicino alla regione del promotore , che fungono da interrutori on/off.
Questo legame facilita l’attività della RNA polimerasi e la trascrizione dei geni vicini.
Allo stesso tempo, tuttavia, altri AA potrebbero legarsi a proteine di regolazione negativa («repressori»), che a loro volta si legano a siti regolatori sul DNA che di fatto bloccano il legame della RNA polimerasi.
Controllo dell’espressione genica negli eucarioti
Repressione della trascrizione vicino alla regione del promotore. Alcune molecole possono interferire con il legame della RNA polimerasi. Una
proteina repressore inattiva (blu) può diventare attivata da un’altra molecola
(cerchio rosso). Questo repressore inattivo può legarsi ad una regione vicino al promotore detta “operatore” (giallo) e quindi interferire con il legame della RNA polimerasi al promotore, di fatto impedendo la trascrizione. Molto più complesso che nei procarioti.
Di solito è coinvolto un numero molto maggiore di proteine regolatorie, e i siti di legame regolatori possono essere localizzati in posizioni abbastanza lontane dai siti dei promori della trascrizione.
Inoltre, l’espressione genica negli eucarioti è di solito regolata da una combinazione di varie proteine regolatorie che lavorano insieme, il che permette una maggiore flessibilità nel controllo dell’espressione genica.
3
Le sequenze «enhancer» sono sequenze di DNA a cui si lega una proteina attivatrice, e che si possono trovare a migliaia di coppie di basi dal promotore, sia a monte che a valle del gene.
Si pensa che il legame della proteina induca il DNA a formare delle anse, avvicinando la proteina alla RNA polimerasi e ad altre proteine del complesso che promuovono l’inizio della trascrizione.
Tessuti diversi esprimono insiemi caratteristici di regolatori della trascrizione:
Quando gli organismi multicellulari si sviluppano, gruppi diversi di cellule all’interno di questi organismi accendono o spengono combinazioni specifiche di regolatori.
Tali quadri dipendenti dalla fase dello sviluppo sono responsabili della grande diversità di tipi cellulari presenti negli organismi adulti.
La complessità dei regolatori multipli.
I regolatori della trascrizione possono avere singolarmente un ruolo diverso. Le combinazioni di uno, due o tre regolatori (forme blu, verde e giallo) possono influenzare la trascrizione in modi diversi, influenzando in modo
differenziale un complesso mediatore (arancione), anche sso composto di proteine. L’effeto è che lo stesso gene può essere trascritto in modi diversi, a seconda della combinazione, presenza o assenza delle diverse proteine
regolatorie della trascrizione. Fattori di trascrizione
Proteine che si legano a sequenza specifiche del DNA così controllando il flusso ( o la trascrizione) dell’informazione genica dal DNA al mRNA.
I fattori di trascrizione svolgono questa funzione da soli oppure associati ad altre proteine di un complesso promuovendo (come attivatori) o bloccando (come repressori) il reclutamento della RNA polimerasi (enzima che svolge la trascrizione dell’informazione genetica dal DNA al mRNA) a geni specifici.
Un fattore caratteristico dei fattori di trascrizione è che essi contengono uno o più domini di legame al DNA («DNA Binding Domains», DBDs) che si legano a sequenze specifiche del DNA adiacenti ai geni che regolano. Proteine aggiuntive quali i co‐attivatori, i rimodllanti della cromatina, le acetilasi o le deacetilasi degli istoni, le chinasi e le metilasi, nonostante giochino anche esse ruoli cruciali nella regolazione genica, mancano di domini di legame al DNA e quindi non vengono classificati come fattori di trascrizione. I regolatori della trascrizione possono determinare I tipi cellulari. La gran varietà di tipi cellulari in un singolo organismo può dipendere dall’attività diversificata dei vari fattori di trascrizione in ogni tipo cellulare. Fattori di trascrizione differenti possono accendersi in momenti diversi
durante le successive generazioni di cellule. Man mano le cellule maturano e proseguono lungo I diversitadi di sviluppo (frecce), dei fattori di trascrizione (cerchi colorati) possono agire sull’espressione genica e modificare
le cellule in modi diversi. Questo cambiamento influenza la generazione successiva di cellule derivate da quella
cellula. Nelle generazioni succesive, è la combinazione dei diversi fattori di trascrizioone che alla fine determina il tipo cellulare. Perchè è necessario regolare
l’espressione genica?
Le cellule possono impedire che le risorse
siano sprecate “spegnendo” i geni quando
non sono necessari.
La selezione naturale dovrebbe favorire la capacità di “accendere” o “spegnere” i geni. 4
I geni possono essere espressi
con efficienza diversa
La produzione di una proteina da parte di una cellula eucariotica.
Il livello finale di ciascuna proteina in una cellula eucariotica dipende dall’efficienza di ciascun passaggio raffigurato.
Il gene A é trascritto e tradotto in modo molto più efficiente del gene B. Ciò fa sì che la quantità di proteina A nella cellula sia molto maggiore di quella della proteina B.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26829/figure
/A1117/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26887/figure/A976/?report=objectonly
Controllo dell’espressione genica negli Eucarioti
Controllo dell’espressione genica (1)
Viene spesso svolto mediante controllo dell’inizio
della trascrizione.
Proteine regolatrici si legano al DNA sia per bloccare oppure per stimolare la trascrizione, a seconda del modo con cui interagiscono con la RNA polimerasi.
Controllo dell’espressione genica (2)
Gli organismi procarioti regolano l’espressione
genica in risposta al loro ambiente. Gli eucarioti regolano l’espressione genica per mantenere l’omeostasi dell’organismo. Proteine regolatrici (1)
L’espressione genica è spesso controllata da proteine regolatrici che si legano a sequenze
specifiche del DNA.
Le proteine regolatrici hanno accesso alle
basi del DNA nel solco maggiore.
Le proteine regolatrici possiedono motivi di legame al DNA. 5
Proteine regolatrici (2)
Motivo “Helix‐Turn‐Helix”
I motivi di legame al DNA sono sequenze
amminoacidiche presenti nelle proteine
regolatrici che si legano al DNA: Motivo “helix‐turn‐helix”
Motivo “homeodomain”
Motivo “zinc finger”
Motivo “leucine zipper”
http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/sf14x14.jpg
Motivo “Homeodomain”
(tipo particolare del dominio “Helix‐turn‐helix”)
Motivo “Zinc Finger”
http://wwwnmr.cabm.rutgers.edu/photogallery/proteins/htm/pa
ge20.htm
http://www.web-books.com/MoBio/Free/Ch4F4.htm
http://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_finger
Motivo “Zinc Finger” (segue)
http://www.nature.com/nri/journal/v9/n2/fig_tab/nri2476_F1.html
Motivo “Leucine Zipper”
http://en.wikipedia.org/wiki/Leucine_zipper
6
Regolazione nei Procarioti (1)
I Procarioti hanno due livelli di controllo genico. I meccanismi
trascrizionali controllano la sintesi del mRNA e i meccanismi
traduzionali controllano la sintesi delle proteine dopo che il
mRNA è stato prodotto. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA
PROCARIOTI
Regolazione nei Procarioti (2)
Le cellule procariotiche spesso rispondono al loro
ambiente mediante altrazioni dell’espressione
genica. I geni coinvolti nella stessa via metabolica sono
organizzati in operoni.
Alcuni operoni sono indotti quando tale via metabolica è richiesta.
Alcuni operoni sono repressi quando la via metabolica non è più necessaria. Nella E. coli sono stati identificati 75 diversi operoni
che controllano 250 geni strutturali.
Il controllo della trascrizione può essere:
controllo positivo – aumenta la trascrizione quando degli
attivatori si legano al DNA. controllo negativo – riduce la trascrizione quando dei
repressori si legano a regioni regolatrici del DNA chiamate
operatori
Struttura generale di un operone
Un operone contiene uno o più geni strutturali che di solito sono trascritti in un mRNA policistronico: una singola molecola di mRNA che codifica per più di una proteina.
A monte dei geni strutturali c’è una sequenza promotore che è il sito a cui la RNA polimerasi si lega e inizia la trascrizione.
Vicino al promotore c’è una sequenza di DNA detta un operatore , che è il sito del DNA dove una proteina repressore si lega per bloccare l’inizio della trascrizione dall’adiacente promotore.
Un operone può anche contenere geni regolatori quali un gene repressore che codifica per una proteina regolatoria che si lega all’operatore ed inibisce la trascizione.
– I geni regolatori non hanno bisogno di fare parte dell’operone stesso, ma possono essere localizzati altrove nel genoma.
– La molecola di repressore raggiungerà l’operatore pere bloccare la trascrizione dei geni strutturali.
Operone batterico (1)
Nei batteri i geni che codificano per una via metabolico sono di solito raggruppati insieme nel cromosoma, in un complesso funzionale detto operone.
Tutti i geni di un operone sono controllati in modo coordinato (Jacob & Monod, 1961).
Un tipico operone batterico è costituito da geni strutturali, da un gene regolatore e da due regioni con funzione di promotore e di operatore
Vi sono due tipi di operoni nel DNA della E.coli: l’operone lac e l’operone triptofano:
L’operone lac è un operone inducibile che è sempre spento ma chè è attivato
dall’allactosio, una molecola induttrice. Esso controlla la degradazione del lactosio e produce enzimi inducibili. L’operone triptofano è un operone repressivo che è sempre attivato e I disattiva
soltanto in presenza del suo prodotto finale, l’amminoacido triptofano. Questo
operone produce enzimi per la sintesi del triptofano. I geni strutturali presenti
nell’operone triptofano codificano per gli enzimi che reprimono la sintesi. http://dnainfo.wikispaces.com/Gene+Regulation
7
Operone batterico (2): geni strutturali
Operone batterico (3): Promotore, operatore, gene regolatore
Geni strutturali: codificano per proteine necessarie per le normali operazioni della cellula. Per esempio, possono essere
enzimi necessarie per degradare gli zuccheri o sintetizzare amminoacidi. I geni strutturali di solito sono raggruppati e la RNA polimerasi
si muove da un gene strutturale al successivo, trascrivendoli
tutti in un unico mRNA.
Questo lungo mRNA (mRNA policistronico) viene poi tradotto
in polipeptidi distinti corrispondenti ai diversi enzimi della via metabolica.
Perciò, l’attivazione di un gene attiva anche tutti i geni
codificanti per gli enzimi di un dato operone.
Promotore: sequenza nucleotidica in cui la RNA polimerasi si lega al DNA prima di iniziare la trascrizione.
Operatore: sequenza nucleotidica di solito localizzato in zona sovrapposta al promotore, serve di sito di legame per una proteina chiamata repressore.
Il repressore è un es. di proteina regolatrice di geni, che riconosce una sequenza nucleotidica specifica del DNA e si lega ad essa con elevata affinità.
Gioca un ruolo fondamentale per determinare se un particolare gene debba essere trascritto o meno.
Gene regolatore: codifica per la proteina con funzione di repressore
Due metaboliti fondamentali per la crescita batterica:
Lattosio, triptofano
Operone batterico (4)
La chiave per il controllo dell’espressione dell’operone sta nel repressore.
Quando il repressore (proteina) si lega all’operatore (sequenza nucleotidica) il promotore non è più disponibile per il legame alla RNA polimerasi e la trascrizione dei geni strutturali viene soppressa.
La capacità del repressore di legarsi all’operatore e di inibire la trascrizione dipende dalla conformazione della proteina, regolata allostericamente dal composto chiave della via metabolica (es. lattosio, triptofano).
E’ la concentrazione di tale metabolita chiave che determina se l’operone è attivo o inattivo in un dato momento.
Lattosio: disaccaride, composto di glucosio e galattosio, la cui degradazione ossidativa fornisce intermedi metabolici ed energia.
Il primo passaggio del metabolismo (degradazione) è l’idrolisi del legame β‐galattosidico fra i due zuccheri, catalizzata dall’enzima β‐
galattosidasi.
Quando le cellule batteriche crescono in condizioni minime non hanno bisogno della β‐galattosidasi:
Contiene circa < 5 copie di β‐galattosidasi e 1 singola copia del corrispondente mRNA.
Entro pochi minuti dall’aggiunta di lattosio al terreno di coltura, le cellule contengono approssimativamente un n° 1000 volte maggiore di molecole di β‐galattosidasi:
La presenza di lattosio ha indotto la sintesi dell’enzima
Operone lac (1)
β‐galattosidasi
Enzima che idrolizza il legame glicosidico fra il galattosio e il glucosio del disaccaride lattosio, che poi vengono utilizzati per fornire energia mediante la glicolisi: lattosio
Gruppo di geni che regola la produzione degli enzimi necessari per metabolizzare il lattosio nelle cellule batteriche.
Operone inducibile: operone in cui la presenza di un metabolita chiave (lattosio) induce la trascrizione dei geni strutturali.
Contiene tre geni strutturali in tandem:
lacZ, che codifica per la β‐galattosidasi
lacY, che codifica per la lattosio permeasi, proteine che permette l’ingresso del lattosio nella cellula
lacA, che codifica per la tiogalattoside transacetilasi (ruolo poco chiaro)
8
Lattosio presente
Lattosio entra nella cellula.
Si lega al repressore (proteina)
Cambia la conformazione del repressore
Lo rende incapace di legarsi alle sequenze nucleotidiche dell’operatore nel DNA
I geni strutturali vengono trascritti
Gli enzimi vengono sintetizzati
Le molecole di lattosio vengono catabolizzate
Operone lac (2)
In un operone inducibile conme il lac, la proteina repressore è in grado di legasi al DNA solo in assenza di lattosio, che agisce come induttore.
Man mano che la concentrazione di lattosio nel terreno diminuisce il disaccaride si dissocia dal suo sito di legame sulla proteina repressore.
Il rilascio del lattosio permette al repressore di legarsi all’operatore.
Viene bloccata la polimerasi che non può più raggiungere i geni strutturali e la trascrizione dell’operone viene disattivata.
Triptofano
Aminoacido necessario per la sintesi delle proteine.
La sua assenza richiede un investimento energetico per la sua sintesi.
Le cellule che crescono in assenza di triptofano contengono gli mRNA e gli enzimi necessari per la sintesi del triptofano.
Se l’amminoacido è presente nel mezzo le cellule non hanno più bisogno di sintetizzarlo.
Entro pochi minuti si blocca la produzione degli enzimi responsabili per la sua produzione.
Quindi, in presenza di triptofano, i geni che codificano per tali enzimi sono repressi.
Assenza di lattosio
Presenza di lattosio
Funzionamento dell’operone lac
D. Krogh: Biologia Oggi A (Cellula, Genetica, Evoluzione), Le Monnier, Firenze, 2006
Operone trp (1)
Operone reprimibile: il repressore non è in grado di legare il DNA operatore da solo.
Il repressore è attivo come proteina legante il DNA soltanto quando è complessato con un fattore specifico, come il triptofano, che agisce da co‐
repressore.
9
Operone trp (1)
Contiene 5 geni
strutturali: trp E, trp D, trp C, trp B, e trp A, che codifcano per la triptofano sintasi.
Contiene inoltre un promotore che si lega
alla RNA polimerasi e un operatore che
blocca la trascrizione
quando legato alla
proteina sintetizzata
dal gene repressore
(trp R) che si lega
all’operatore
Operone trp (2)
Assenza di triptofano :
il sito operatore è disponibile per legare la RNA polimerasi, che trascrive i geni strutturali dell’operone trp consentendo la produzione di enzimi che sintetizzano il triptofano.
Presenza di triptofano: gli enzimi della via biosintetica per questo AA non sono più necessari:
L’aumento della concentrazione di triptofano determina la formazione del complesso triptofano‐repressore che blocca la trascrizione.
http://en.wikipedia.org/wiki/Trp_operon
EUCARIOTI
REGOLAZIONE ESPRESSIONE
GENICA
Controllo dell’espressione genica negli Eucarioti
Decine di migliaia di geni
Molti tipi cellulari differenti
Cellula batterica: quantità di DNA x codificare circa 3000 peptidi, 1/3 dei quali espresso in modo continuo.
Cellula umana: molto + DNA (6 miliardi di coppie di basi), sufficienti x codificare diversi milioni di polipeptidi.
Sebbene la maggior parte del DNA umano non codifichi x proteine, si stima che una tipica cell di mammiefero codfifichi x 5000 differenti polipeptidi in ogni momento.
Molti di questi peptidi – prodotti da «housekeeping genes» – sono sintetizzati praticamente da tutte le cellule.
Inoltre le cellule contengono proteine specifiche del loro stato differenziato.
La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti è quindi estremamente complessa e ancora poco nota.
Tipi di controllo negli Eucarioti
L’espressione genica negli Eucarioti è controllata da una grande
diversità di meccanismi che vanno da quelli che impediscono la trascrizione a quelli che impediscono l’espressione dopo che la proteina è stata prodotta. Il diagramma illustra cinque tipi di meccanismi generali che
possono essere utilizzati.
10
Meccanismi di controllo
dell’espressione genica negli Eucarioti
Trascrizionali: Impediscono la trascrizione.
Post‐trascrizionali: Controllano o regolano il mRNA dopo che è stato prodotto. Traduzionali: Impediscono la traduzione. Spesso
coinvolgono fattori proteici necessari per la traduzione.
Post‐traduzionali: Agiscono dopo che la proteina è stata prodotta.
Regolazione negli Eucarioti (1)
Il controllo dell’espressione dei geni degli eucarioti
richiede la presenza di proteine dette dei fattori di trascrizione.
I fattori di trascrizione generali sono necessari
per l’inizio della trascrizione.
Sono necessari per un giusto legame della RNA polimerasi al DNA.
I fattori di trascrizione specifici aumentano la trascrizione in alcune cellule o in risposta a segnali. Controllo della trascrizione negli Eucarioti (1)
Il controllo agisce a tre livelli:
Modulazione dei livelli e/o attività degli attivatori e repressori
Alterazioni della struttura della cromatina guidata da attivatori e repressori
Influenza diretta degli attivatori e repressori sull’assemblaggio dei complessi di iniziazione
Trascrizione negli Eucarioti
Per il funzionamento dei fattori di trascrizione
sono necessari inoltre co‐attivatori e mediatori. I co‐attivatori e i mediatori si legano ai fattori
di trascrizione e ad altre parti dell’apparato di trascrizione. Regolazione negli Eucarioti (2)
I fattori di trascrizione generali si legano alla
regione detta promotore del gene.
Indi la RNA polimerasi II si lega al promotore
per iniziare la trascrizione nel sito start (+1).
Gli “Enhancers” (intensificatori) sono
sequenze di DNA a cui si legano fattori di trascrizione specifici (attivatori) per aumentare la velocità di trascrizione. Controllo della trascrizione negli Eucarioti (2)
Eterocromatina: regioni condensate della cromatina nelle quali il DNA è relativamente inaccessibile ai fattori di trascrizione e ad altre proteine:
L’espressione genica è repressa.
Repressione mediata dall’eterocromatina ha luogo ad esempio nei telomeri dei cromosomi.
Le interazioni di diverse proteine fra di loro e gli N‐
terminali ipoacetilati degli istoni H3 e H4 sono responsabili per la repressione della struttura della cromatina in queste regioni.
11
Controllo della trascrizione negli Eucarioti (3)
Alcuni repressori funzionano in parte mediante interazioni
con i complessi delle istone deacetilasi, provocando la deacetilazione degli istoni dei nucleosomi vicino al sito di legame con il repressore. Ciò inibisce l’interazione fra il
promotore nel DNA e fattori di trascrizione generali, così
reprimendo l’inizio della trascrizione. Alcuni attivatori funzionano in parte mediante iinterazione
con I complessi delle istone acetilasi, provocando la iperacetilazione degli istoni dei nucleosomi vicino al sito di legame con l’attivatore. Ciò facilita l’interazione tra il DNA promotore e I fattori di trascizione generali, così stimolando
l’inzio della trascrizione. Modelo del “enhancesome “ che si forma nel “enhancer” del promottore per il β‐
interferone.
La proteina eterodimerica cJun/ATF‐2, IRF‐3, IRF‐7, e NF‐κB (un eterodimero di p50 and p65) si
legano ai quattro lelementi di controllo del” enhancer” che ha ≈70‐bp. Il legame cooperativo di questi fattori di trascrizione è facilitato da HMGI, che si lega al solco minore del DNA. Le proteine cJun, ATF‐2, p50, e p65 sembrano tutte interagire direttamente con un HMGI legato nelle loro adiacenze. Il piegamento della sequenza “enhancer” provocato dal legame con HMGI è fondamentale per la formazione di un “enhancesome”. Diverse proteine che incurvano il
DNA agisco in modo simile su altre sequenze “enhancer”. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21572/figure/A2601/?report=objectonly
Struttura dei cromosomi degli Eucarioti (1)
Il DNA degli eucarioti è impacchettato sotto forma di cromatina.
La struttura della cromatina è direttamente correlata
al controllo dell’espressione genica.
La strutturazione della cromatina inizia con l’organizzazione del DNA in nucleosomi.
I nucleosomi possono impedire alla RNA polimerasi II di avere accesso ai promotori.
Ruolo della deacetilazione e dell’iperacetilazione
sulle code N‐terminali
nel controllo della trascrizione nel lievito (1)
A. Deacetilazione delle code N-terminali degli istoni diretta al repressore. Il
dominio di legame al DNA (DBD) del repressore Ume6 interagisce con un
elemento di controllo specifico a monte (URS1) del gene che regola. Il dominio
di repressione di Ume6 (RD) si lega a Sin3, una subunità di un complesso
multiproteico che include Rpd3, una istone deacetilasi. La deacetilazione delle
code N-terminali in nucleosomi nella regione di legame con Ume6 inibisce il
legame di fattori di trascrizione generali alla “TATA box”, in questo modo
reprimendo l’espressione genica.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/figure/A2636/?report=objectonly
Struttura dei cromosomi degli Eucarioti (2)
• La Metilazione (aggiunta di –CH3) al DNA o alle
proteine istoniche è associata al controllo
dell’espressione genica:
Aggregati di citosine metilate si legano ad una
proteina che impedisce agli attivatori di legarsi al DNA.
Le proteine istoniche metilate sono associate alle
regioni inattive della cromatina. Ruolo della deacetilazione e dell’iperacetilazione
sulle code N‐terminali
nel controllo della trascrizione nel lievito (2)
B. Iperacetilazione delle code N-terminali mirata all’attivatore. Il dominio di
legame al DNA di Gcn4 interagisce con sequenze attivatorie specifiche a monte
(UAS) del gene che regola. Il dominio di attivazione di Gcn4 (AD) a questo
punto interagisce con un complesso multiproteico istone acetilasi che include la
subunità catalitica di Gcn5. La iperacetilazione conseguente delle code Nterminali degli istoni del nucleosoma vicino al sito di legame di Gcn4 facilita
l’accesso dei fattori generali di trascrizione richiesti per l’inzio della trascrizione.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/figure/A2636/?report=objectonly
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Acetilazione degli istoni
A. Gli istoni della zona central del nucleosoma hanno domini «pieghe istoniche «che interagiscono con gli altri istoni e con il DNA del nucleosome, e code N‐terminali che si estendono al di fuori del nucleosoma. Le code N‐aminoterminale degli istoni centrali (ad es. l’istone H3) vengono modificate dall’aggiunta di gruppi acetilici (Ac) alle catene laterali di residui specifici di lisina.
B. Attivatori e repressori trascrizionali sono associati a co‐attivatori e co‐repressori, che hanno attività rispettivamente di istone‐acetiltrasferasi ((HAT) e di istone deacetilasi (HDAC), rispettivamente.
L’acetilazione degli istoni è caratteristica della cromatina attivamente trascritta (eucromatina) e può indebollire il legame degli istoni al DNA o alterare le interazioni con altre proteine.
http://journals.prous.com/journals/dof/20073201/html/df320045/images/image01.jpg
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9904/figure/A1012/
Controllo della trascrizione negli Eucarioti (4)
Fattori che rimodellano la cromatina provocano la dissociazione transitoria del DNA dai complessi istonici in una
reazione dipendente dall’ATP. Questi fattori quindi
promuovono il legame di altre proteine leganti il DNA necessarie per che abbia luogo l’iniziazione in alcuni
promotori. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/
Controllo della trascrizione negli Eucarioti (6)
Alcuni repressori inibiscono competitivamente il legame di attivatori o di fattori di trascrizione generali. Altri interagiscono direttamente con fattori di trascrizione generali o con attivatori.
Le attività della superfamiglia di fattori di trascrizione recettori nucleari sono regolate da ormoni solubili nei lipidi. Il legame degli ormoni a tali fattori di trascrizione induce alterazioni conformazionali che modificano le loro interazioni con altre proteine.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/figure/A2660/?report=objectonly
Controllo della trascrizione negli Eucarioti (5)
L’assemblaggio altamente cooperative dei complessi di iniziazione in vivo di solito richiede diversi attivatori. Una cellula deve produrre l’insieme di attivatori richiesto per la trascrizione di un dato gene se deve esprimere tale gene.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/figure/A2647/?report=objectonly
Controllo della trascrizione negli Eucarioti (7)
Le attività di alcuni fattori di trascrizione sono regulate da fosforilazione indotta dal legamedi ormoni peptidici ai loro recettori sulla superficie cellulare.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21677/figure/A2663/?report=objectonly
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Regolazione post‐traduzionale (1)
Il controllo dell’espressione genica di solito coinvolge il
controllo dell’inzio della trascrizione. Tuttavia l’espressione genica può essere controllata
dopo la trascrizione, con meccanismi quali:
“RNA interference”
“Splicing” alternativo
“RNA editing”
Degradazione del mRNA
Regolazione post‐traduzionale (2)
Il “RNA interference” coinvolge l’uso di piccole
molecole di RNA .
L’enzima Dicer frantuma un RNA a doppio filamento
in piccoli frammenti di RNA:
I micro‐RNAs si legano al RNA complementare per impedire al traduzione. I “small interfering RNAs” degradano alcuni
mRNA particolari prima della traduzione. RNA interference (1)
Controllo dell’espressione genica negli Eucarioti
RNA INTERFERENCE
http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/illpres/4_interference.html
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Regolazione post‐traduzionale (4)
Gli introni sono “spliced” dai pre‐mRNAs per produrre
il mRNA maturo che viene tradotto.
Lo “splicing alternativo” riconosce diversi siti di “splicing” in diversi tipi tissutali.
Gli mRNA maturi in ogni tesuto possiedono esoni
diversi, dando origine a prodotti polipeptidici differenti
a partire dallo stesso gene.
Kim and Rossi Nature Reviews Genetics 8, 173–184 (March 2007) | doi:10.1038/nrg2006
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Regolazione post‐traduzionale (4)
Il “RNA editing” crea degli mRNA maturi che non sono veramente codificati dal genoma.
Ad esempio: L’apolipoproteina B esiste in 2 isoforme
una isoforma è prodotta dall’”editing” del mRNA per creare un codone di stop Questo “RNA editing” è tessuto‐specifico
Regolazione post‐traduzionale (5)
Le molecole mature di mRNA hanno tempi di emi‐
vita diversi a seconda del gene e della localizzazione
tissutale dell’espressione. Le quantià di polipeptidi prodotti a partire da un gene particolare possono essere influenzate dall’emi‐
vita delle molecole di mRNA. Degradazione delle Proteine
Le proteine sono prodotte e degradata
continuamente nella cellula.
Le proteine che devono essere degradate sono
marcate con la proteina ubiquitina.
La degradazione delle proteine marcata con l’ubiquitina ha luogo nel proteasoma. Il machinario per la degradazione delle proteine.
Nella via dell’ubiquitina‐prteasoma l’energia dell’ATP è utilizzata per marcare una proteina alterata con una catena di ubiquitina, marcandola per la distruzione. La proteina
viene allora idrolizzata in piccoli frammenti peptidici dal proteasoma. http://www.weizmann.ac.il/Biological_Chemistry/scientist/MichalSharon/
http://www.bostonbiochem.com/sites/bostonbiochem.com/files/categories/ubiquitin-cycle.gif
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