GENEQUALITY
AZF-MX
Cod. 04-23
Kit per la determinazione di microdelezioni
nel locus AZF mediante PCR MULTIPLEX
INTRODUZIONE
L’analisi delle microdelezioni del cromosoma Y viene oggi considerato un approccio diagnostico essenziale
per lo studio dell’infertilità maschile.
Attraverso le ricerche compiute negli ultimi anni è stata stabilita una suddivisione del braccio lungo del
cromosoma Y in tre regioni chiamate AZF (Azoospermia Factors), che risultano frequentemente delete nei
soggetti azoospermici e gravemente oligozoospermici (Vogt PH. et al.,1996). Questi loci (AZFa, AZFb e
AZFc) contengono geni che controllano il corretto svolgimento della spermatogenesi. Alterazioni a carico di
uno o più loci AZF comportano la drastica riduzione delle cellule germinali fino alla loro completa assenza.
SRY
ZFY
AZFa
Marcatori utilizzati per la
determinazione di microdelezioni
nel locus AZF
sY86
sY84
DFFRY, nel gene USP9Y
DBY, nel gene DEAD BOX Y
sY95
AZFb
sY117
sY125
sY127
sY134
AZFc
sY254, nel gene
DAZ
sY255, nel gene
Negli ultimi anni l’amplificazione di brevi tratti di DNA nei loci AZF
si è imposta come tecnica di elezione per la ricerca delle
microdelezioni in tali regioni.
I dati pubblicati mostravano però che i protocolli diagnostici
potevano essere anche molto diversi fra loro e provocare quindi
diagnosi inaccurate o incomplete. La necessità di una
standardizzazione del metodo diagnostico è culminata con una
prima preliminare pubblicazione delle Linee Guida Europee che
proponevano le caratteristiche che reazione di amplificazione e
marcatori dovevano possedere per rendere l’analisi il più completa
e attendibile possibile (Simoni et al., 1999).
A distanza di 4 anni da questa prima pubblicazione e con la
completa conoscenza della sequenza del cromosoma Y
(Skaletsky et al., 2003) e la comprensione dei meccanismi
molecolari alla base delle microdelezioni (Kamp et al., 2000; Sun
et al., 2000; Kuroda-Kawaguchi et al., 2001; Repping et al., 2002),
sono state pubblicate le Nuove Linee Guida Europee (Simoni et
al., 2004).
In particolare, oltre a dare indicazioni riguardanti la selezione dei
pazienti sui quali condurre l’indagine, gli autori suggeriscono:
Il formato multiplex della reazione di amplificazione;
L’utilizzo del gene ZFX/ZFY quale appropriato controllo interno di amplificazione in quanto presente
in unica copia sia nel DNA femminile che maschile;
• Le caratteristiche indispensabili per la scelta dei marcatori da utilizzare (Y-specificità; assenza di
omologhi in altri cromosomi; non polimorficità);
• I marcatori che dovrebbero essere inclusi nell’analisi in numero di almeno due per locus:
AZFa: sY84, sY86
AZFb: sY127, sY134
AZFc: sY254, sY255;
• L’opportunità di amplificare il gene SRY come controllo per la presenza del testis-determining factor
e di sequenze Y specifiche quando sia assente ZFY (per es. in maschi XX).
Sembra inoltre che, per valutare l’integrità della regione eucromatica dell’Y, sia preferibile che tra i marcatori
scelti alcuni siano specifici per i geni attualmente ritenuti implicati, direttamente o indirettamente, nella
fertilità maschile (USP9Y (o DFFRY), DBY, RBMY e DAZ).
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SCH TEC_AZF MX_ A-R_R151210
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 – 35127 PADOVA – ITALIA Tel. 049 761698 - Fax 049 8709510
e-mail: [email protected]
www. abanalitica.it
GENEQUALITY
PROCEDURA
CARATTERISTICHE TECNICHE
NUMERO DI TEST: 12 o 25 test.
STABILITA’: 6 mesi.
DNA
ESTRATTO
CAMPIONE
MATERIALE DI PARTENZA: DNA estratto.
REGIONI AMPLIFICATE:
AZFa: sY84, sY86, DFFRY, DBY
tra AZFa e AZFb: sY95
AZFb: sY117, sY125, sY127, sY134
AZFc: sY254, sY255.
AMPLIFICAZIONE
MULTIPLEX
150 min
MX 1
VISUALIZZAZIONE
SU GEL DI AGROSIO
AMPLIFICAZIONE: PCR MULTIPLEX premixed
(provette monodose pronte all’uso).
1
MX 2
2
MX 3
3 4
DNA DI RIFERIMENTO: incluso.
CONTROLLO INTERNO: Amplificazione del gene
ZFX/ZFY e del gene SRY.
Elettroforesi su gel di agarosio ad
alta risoluzione delle tre
amplificazioni multiplex:
RIVELAZIONE: elettroforesi su gel di agarosio ad
alta risoluzione.
1.
2.
3.
4.
SPECIFICITA’:
• Ciascun marcatore utilizzato è Y-specifico e
non amplifica tratti omologhi su altri
cromosomi;
• Ciascun marcatore è studiato in modo tale da
non amplificare tratti ripetuti del cromosoma o
essere soggetto a differenze nucleotidiche
vistose tra individuo a individuo;
• I marcatori scelti sono uniformemente
distribuiti nei tre loci;
• I marcatori scelti nel locus AZFa ed AZFc
sono gene specifici.
SENSIBILITA’: L’utilizzo del set minimo di STS
suggerite dalle Linee Guida Europee garantisce
l’identificazione di quasi tutte le delezioni
clinicamente rilevanti e di >95% di tutte le
delezioni descritte in letteratura nei 3 loci AZF.
Marcatore di peso molecolare
1° multiplex
2° multiplex
3° multiplex.
MX 1
ZFX/ZFY
SRY
sY254
sY86
sY127
sY255
bp
495
472
380
320
274
120
MX 2
ZFX/ZFY
SRY
sY95
sY117
sY125
bp
495
472
303
262
200
MX 3
DBY
ZFX/ZFY
SRY
sY84
sY134
DFFRY
bp
689
495
472
326
301
155
INFORMAZIONI PER GLI ORDINI
Cod
04-23A
04-23R
Prod
AZF-MX
AZF-MX-amplification reagents
Confez.
12/25 test
12/25 test
REFERENZE
-
Kamp et al., Human Mol Genet 9, 2563-2572,
2000
Kuroda-Kawaguchi et al., Nature Genetics 29,
279-286, 2001
Repping et al., Am J Hum Genet 71, 906-922,
2002
Simoni et al. International Journal of
Andrology, 22: 292-299; 1999.
Simoni et al. International Journal of
Andrology, 27: 240-249, 2004.
Skaletsky et al., Nature, 423, 825-837, 2003
Sun et al., Hum mol Genet, 9, 2291-2296,
2000
Vogt PH. et al., Hum Mol Genet 5, 933-943,
1996
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AB ANALITICA srl
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