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“Studio dell’infertilità maschile:
dall’esame seminale alle
microdelezioni del cromosoma Y”
Domenico Saverio MATAROZZO – Claretta MARCHI
Anatomia Patologica S. Anna - Torino
Premessa
L’esame seminale è il primo passo nello studio dell’infertilità di coppia,
essendo quello che con meno indagini invasive ci da più informazioni sulla
metà maschile della coppia.
E’ un esame svolto per tutte le patologie a lui relative, dall’ infezione al
varicocele, passando per tutte le nuove problematiche sessuali come deficit
erettili ed astenia, fino alla pianificazione famigliare.
Studio eseguito ponendo riguardo all’anamnesi e sulla raccolta del materiale
seminale da parte del paziente (da cui derivano principalmente i dati falsati),
procedendo con una fase macroscopica per poi finire con la fase
microscopica a fresco e su fissato colorato con la papanicolaou.
Per indagini successive possono essere richiesti test specifici come la
Capacitazione, il Test di Kremer o la ricerca di auto-anticorpi (Mar-Test).
Solo dopo aver appurato l’infertilità grave o la sterilità del paziente si può
consigliare l’esame, più specialistico e diretto a cause genetiche, delle
microdelezioni del cromosoma Y su prelievo di sangue periferico.
STERILITA’
assenza del concepimento dopo
1 anno di rapporti non protetti
Rinvio dei tentativi di concepimento ad età più avanzate
per motivi socioculturali (economici, di carriera, etc.)
Aumentata incidenza di alcune malattie sessualmente
trasmesse,potenzialmente lesive della capacità riproduttiva
(es. Chlamydia)
Aumentati livelli di tossici ambientali in grado di interferire
nei processi riproduttivi e aumentato livello di stress nella vita
quotidiana
•
•
•
•
Raccolta del campione
Esame macroscopico
Esame microscopico a fresco
Esame microscopico su fissato
colorato
• Test specifici
Procedure Standard
Raccolta campione
• Astinenza sessuale (2-7 giorni)
• Raccolta presso ambulatorio o in casi
particolari a casa
• Conservazione a 37° c
Anamnesi
Cognome: ………………………
Nome: ……………………………..
Data di nascita: ………………………………
Età del matrimonio: ……………..
Rapporti non protetti: ………………….
Contraccezione: ……………………….
fumo …………………….
alcool ……..…….…………. lavoro…….………
……….
sport …………..……………
uso di farmaci ……………………….
Altezza: …………………
Peso: ……………….
Altro: ………………………………………………
Erezione:…………………………………………
Anamnesi
Eiaculazione:………………………………………………………………………
Malattie genitali: Varicocele: Dx Sx
Criptorchidismo:
Orchite:
Dx
Epidimite:
Dx
Dx
Sx
Sx
bilaterale
Sx
operato
bilaterale
bilaterale
bilaterale
non operato
operato
operato
operato
non operato
non operato
non operato
Prostatite
Uretrite
Idrocele
Lesioni testicolari
Eventuali esami già eseguiti: ……………………………………………………. Esame Macroscopico
•
•
•
•
Volume (V.N. compreso tra 2 ml e 6 ml)
ph
(V.N. compreso tra 7 e 8)
Aspetto (avorio opalescente)
Fluidificazione (deve essere totale dopo 1h)
• Viscosità (deve scendere goccia a goccia)
Esame Microscopico a fresco
(eseguito su due preparati)
• Valori Normali ≥ 30 milioni/ml di
spermatozoi valutati con camera di
Makler dopo immobilizzazione
degli spermatozoi (non richiede
diluizione).
• Motilità normale gradi A+B ≥ 50 %
valutata in almeno 5 campi.
Gradi A movimento lineare veloce
Gradi B movimento lineare lento
Gradi C movimento in situ
Gradi D immobili
http://danseifunin.com/ttc-mv-sperm-syndrome.html
http://danseifunin.com/ttc-mv-normal-sp
http://danseifunin.com/ttc-mv-sperm-sy
http://danseifunin.com/ttc-mv-sperm-as
Esame microscopico
su fissato colorato
• Il vetrino strisciato viene fissato con
metanolo acidificato al 5% con acido
acetico e colorato con Papanicolau
(oppure May-Gruwald-Giemsa o Diff
Quick).
Valori Normali prescrivono che siano presenti
come minimo il 30% di forme Tipiche
Morfologia tipica
Morfologie tipiche
Morfologie atipiche
Morfologie atipiche
•
•
•
•
•
Viene inoltre
valutato anche
altro come:
Emazie
Cellule epiteliali
Elementi
germinativi
Granulociti
Cristalli
Flogosi
EMOSPERMIA
CRISTALLI
Cellule
TEST SPECIFICI
• Capacitazione
• Kremer
• Mar Test
Capacitazione
• Riproduce in vitro l’azione capacitante del
muco vaginale.
Centrifugo ▬►
1 ml di terreno
(ricco in albumina umana)
+
1 ml di liquido seminale
Incubo 1 h
▬►
a 37°c e 5% CO2
Al sedimento aggiungo
1 ml di terreno nuovo
Senza risospendere
Prelevo 10 microlitri
dall’interfase e li leggo al
microscopio
KREMER TEST
• Serve a valutare la forza penetrante degli
spermatozoi all’interno di un capillare
riempito di terreno albuminato.
Capillare
Chiuso ad una
estremità
A contatto col
seminale per 1 h
a 37°c
Lettura al microscopio valutando
2. Penetrazione lineare
3. Densità di penetrazione
4. Motilità
MAR TEST
Ricerca diretta anticorpi IgG antispermatozoi per mezzo di agglutinazione
al lattice (richiede una mobilità basale A+B > 20%)
10 microlitri seminale
+
10 microlitri Sperm Mar Latex Particels
Misceliamo su un vetrino le due
quantità
Aggiungiamo e mischiamo
10 microlitri di Sperm Mar Antiserium
Lettura della goccia così ottenuta a 40x dopo 3/10 minuti, valutando la
diminuizione In % della motilità (positivo se > 40%)
Microdelezioni del
Cromosoma Y
Cariotipo umano maschile: 46 XY
X
Y
Sono la seconda causa genetica di fallimento della
spermatogenesi in maschi infertili dopo la
Sindrome di Klinefelter : 47, XXY
'inversione del sesso‘
anomalia cromosomica per la quale si hanno individui maschi XX
http://www.vialattea.net/spaw/image/biologia/regionSRY.
GIF
(sex-determining
Gene SRY
region Y )
sequenza genica specifica del maschio posizionata vicino all'estremità
del braccio corto dell'Y (Yp11.3)
L'analisi molecolare dei
cromosomi sessuali di questi
soggetti ha evidenziato che nei
maschi XX è presente un piccolo
frammento di cromosoma del
braccio corto dell'Y staccatosi
durante la formazione dei gameti
e rimasto adeso ad uno dei
cromosomi X.
• L’incidenza delle microdelezioni del Cromosoma Y (MDY) nei soggetti
infertili varia dal 2 al 10 % in base ai criteri con cui vendono
selezionati i pazienti.
• Essa è più elevata nei soggetti azospermici che negli oligospermici
http://www.sidr.it/repronews/71/images/3.3.jpg
(Krausz et al. 1999a; Krausz et al. 1999b; Krausz et al. 2001).
ICSI
( Intracitoplasmatic Sperm Injection)
I pazienti portatori di microdelezioni sul braccio lungo del cromosoma Y sono caratterizzati
da oligospermia severa o azospermia con possibile presenza di spermatozoi all’interno del
testicolo recuperabili mediante TESE (Testicular Sperm Extraction)
L’analisi delle MDY si avvale di un pannello di
S.T.S. (Sequence Tag Sites)
conforme alle Linee guida
dell’EUROPEAN ACADEMY OF ANDROLOGY
e dell’ EMQN (European Molecular Genetics Quality Network)
La porzione di regione maschio-specifica (MSY) su cui mappano le delezioni è
stata suddivisa in 3 regioni AZF situate sul braccio lungo del Cr. Y che
contengono geni che controllano la spermatogenesi
• AZF a
• AZF b
• AZF c
(AZF= Azospermia Factor)
Le microdelezioni coinvolgono per l’80% AZFc
il 9% AZFb
il 6% AZFbc
il 3% AZFa
il 3% AZFabc (maschi XX)
http://www.sidr.it/repronews/71/images/3.1.jpg
Rappresentazione del meccanismo molecolare di
insorgenza della delezione completa della regione
AZFc del cromosoma Y.
http://www.sidr.it/repronews/71/images/3.4.jpg
La ricombinazione omologa intracromosomica tra le sequenze
"b2" e "b4“ determina la perdita di tutta la regione interposta tra
queste due sequenze.
Meccanismo di ricombinazione omologa intracromosomica.
Due sequenze omologhe - con il 99,9% di identità - orientate nella stessa direzione si
appaiano determinando la formazione di un loop; quest'ultimo è costituito dalla regione
interposta tra i due ampliconi. La ricombinazione omologa degli ampliconi determina
l'escissione del loop e quindi la sua rimozione dal cromosoma
http://www.sidr.it/repronews/71/images/3.2.jpg
Ricerca M.D.Y
CAMPIONE
ANALITICO
DNA GENOMICO
estratto da sangue intero
METODO
PCR
MULTIPLEX
tecnica che permette l’amplificazione
simultanea di più loci sulla stessa
regione
CONTROLLI
CONTROLLO INTERNO
Gene ZFX/ZFY
CONTROLLO POSITIVO
DNA di maschio fertile
CONTROLLO NEGATIVO
DNA di femmina
L’analisi prevede l’amplificazione di 2 marcatori (STS) per
locus AZF e 2 geni di controllo
STS
REGIONE
LOCUS
(DNA Y-chromosome Segment)
sY86 – sY84
AZFa
DYS148-273
sY127 – sY134
AZFb
DYS218-224
sY254 – sY255
AZFc
DAZ
(Deleted in azoospermia)
ZFX-ZFY
gene di controllo presente sia nei maschi che nelle femmine
TECNICA DI ANALISI
DNA genomico
MIX A:
3 coppie di primers per STS
•
sY 86
•
sY 127
•
sY 254
+ gene ZFX/ZFY
3
•
•
•
MIX B:
coppie di primers per STS
sY 84
sY 134
sY255
TECNICA DI ANALISI
PCR end point
a ciclo unico
I primers annilano alla
stessa temperatura
TECNICA DI ANALISI
RIVELAZIONE AMPLIFICATI
ELETTROFORESI
Gel agaroso 4%
etidio bromuro
INTERPRETAZIONE RISULTATI
Mix A
Mix B
495 pb
400 pb
320 pb
326 pb
274 pb
301 pb
255 pb
•
•
•
•
ZKX/ZFY
sY 254 – sY 255
sY 86 – sY 84
sY 127 – sY134
INTERPRETAZIONE RISULTATI
Mix A
Mix B
495 pb
400 pb
320 pb
326 pb
274 pb
301 pb
delezione
sY 254 – sY 255
Regione AZFc
Locus DAZ
255 pb
La NON amplificazione di ENTRAMBE i loci evidenzia la delezione sulla
regione corrispondente
del
1
del
2
3 -
+
1
2
- + M
sY 254 – sY 255 Regione AZFc Locus DAZ
Mix A
Mix B
- +
INTERPRETAZIONE RISULTATI
Mix A
Mix B
495 pb
400 pb
320 pb
326 pb
274 pb
301 pb
delezione
sY 86 – sY 84
Regione AZFa
Locus DYS148-273
255 pb
La NON amplificazione di ENTRAMBE i loci evidenzia la delezione sulla
regione corrispondente
INTERPRETAZIONE RISULTATI
Mix A
Mix B
495 pb
400 pb
320 pb
326 pb
274 pb
301 pb
delezione
sY 127 – sY134
Regione AZFb
Locus DYS 218-224
255 pb
La NON amplificazione di ENTRAMBE i loci evidenzia la delezione sulla
regione corrispondente
SEX REVERSAL – maschio 46 XX, SRY positivo
1
2
3 - + M 1
2 3
4 - +
1
1
Delez. Regioni AZFa, AZFb, AZFc
Mix A
Mix B
SRY
-
+