Le metilazioni del DNA sono responsabili di

-Regolazione
spaziale e
temporale dei geni
eucariotici
-Regolazione a livello
trascrizionale
-Regolazione a livello
traduzionale
Alcuni elementi per la regolazione
genica negli eucarioti:
•
•
•
•
•
•
•
Promotori:fattori di trascrizione e repressori
Enhancer
Stabilita’ dell’RNA
Splicing alternativo
Risposta ormonale
Rimodulazione della cromatina
Metilazione del DNA
Stabilita’ dell’RNA:piu’ e’ stabile e piu’ cicli di
traduzione effettua
• Assicurata dal CAP5’ e
dalla polyA
• La lunghezza del polyA puo’
determinare la stabilita’
dell’mRNA (mRNA per gli
istoni non hanno il polyA ed
hanno una breve emivita)
•La struttura della regione
3’UTR non tradotta
influenza la stabilita’
dell’mRNA (sequenze
AUUUA ripetute nella
3’UTR determinano breve
emivita dell’mRNA)
Se si trasferisce la
sequenza AUUUA ad un
mRNA stabile, questo
diventa instabile
SPLICING ALTERNATIVO
determinazione del sesso in
Drosophila:gene Sex-lethal
Esone incluso
Proteina non funzionale
Proteina funzionale per lo sviluppo
femminile
Esone rimosso
Risposta ormonale
Ormone steroideo
Ormone peptidico
L’espressione genica indotta da un ormone e’ mediata da specifiche
sequenze sul DNA, chiamate elementi HRE(elementi di risposta all’ormone)
ENHANCER
Enhancer: vi si legano
fattori di trascrizione
speciali, che a loro
volta interagiscono con
i fattori di trascrizione
posti sul promotore e
con la RNA polimerasi
-agiscono a distanze
molto ampie
-agiscono in entrambi gli
orientamenti
-effetti indipendenti dalla
posizione (a monte o a
valle del gene)
L’enhancer UAS di lievito
Attivazione dei
geni del
metabolismo
del galattosio
Gal10
GAL4, fattore di trascrizione che
si lega all’enhancer UAS (Upstream
activating sequence)
Gal4 zincfinger e’
espressa
costitutiva
mente
Struttura Gal4
AD
DBD
TWO-HYBRID SYSTEM
COME DETERMINARE L’INTERAZIONE TRA 2
PROTEINE
E’ BASATO SULLA COSTRUZIONE DI 2 TIPI DI IBRIDI:
1-DBD-BYTE
2-AD-PREY
BYTE (PROTEINA
NOTA)
DBD
AD
PREY (PROTEINA INCOGNITA
LEGANTE)
PROTEINA
NOTA
PROTEINA
INTERAGENTE
La cellula in cui c’e’ interazione tra le 2 proteine sopravvive
su terreno in cui l’aminoacido che viene espresso o esprime
il marcatore LacZ
Saccaromyces Cerevisiae
Attivazione del
reporter
essenziale x la
sopravvivenza
della cellula
L’attivazione di un gene richiede
cambiamenti nello stato della cromatina
per avere accesso al DNA
Geni attivi=> eucromatina
Geni inattivi=> eterocromatina
Alcuni attivatori trascrizionali modificano gli
istoni acetilandoli
Alcuni repressori trascrizionali li deacetilano
Una volta stabiliti, i cambiamenti
cromatinici possono persistere
attraverso le divisioni cellulari,
creando uno stato epigenetico
Eredita’ della condizione di inattivazione
2 tipi di condizioni in cui si trova un
promotore eucariotico
Se si legano
prima gli istoni al
promotore la
trascrizione e’
bloccata; se si
legano prima i
fattori di
trascrizione la
trascrizione e’
attiva
Stato
inattivo del
promotore
Stato attivo
Transcription factors or nucleosomes may form
stable structures that cannot be changed merely
by changing the equilibrium with free components.
Chromatin remodeling
Il complesso SWI/SNF
permette il
rimodellamento della
struttura cromatinica e
lo slittamento dei
nucleosomi lungo il
DNA rendendolo
accessibile da parte
della RNA polimerasi
II e dei fattori di
trascrizione
I cambiamenti cromatinici possono
compromettere la funzionalita’ del
promotore, di un intero gene, o di
un intero cromosoma
I cambiamenti nella struttura della cromatina
iniziano attraverso la modificazione degli
istoni, nella coda N-terminale, soprattutto
degli istoni H3 e H4.
Tipi di modificazione degli istoni
Tutti gli istoni possono essere acetilati:
l’acetilazione e’ incrementata nei geni
trascrizionalmente attivi e la cromatina acetilata e’
piu’ sensibile alla DNA-asi I
L’acetilazione e’ un fenomeno
reversibile
• Enzimi HAT (acetiltransferasi)
• Enzimi HDAC (deacetiltransferasi)
MODULAZIONE DELLA CROMATINA
-La struttura dei nucleosomi influenza la trascrizione
-il dna piu’ trascritto e’ piu’ facilmente attaccato dalle nucleasi
Acetilazione
attivazione
Acetilazione degli istoni
da parte di HAT
Apertura della
cromatina accessibile
alla trascrizione
La metilazione e’ associata ad
inattivita’ trascrizionale
• La metilazione avviene sugli istoni (lisina 9
dell’istone H3) ad opera di metiltransferasi
• Avviene sul DNA a livello delle isole CpG
sia di promotori sia di sequenze geniche
codificanti, ad opera di metilasi
METILAZIONE DEGLI ISTONI
BLOCCO DELLA TRASCRIZIONE
AD OPERA DELLE METILTRASFERASI (DNMT)
L’attivazione del
promotore
richiede il legame
di diversi fattori
La formazione di eterocromatina
non e’ rigorosamente definita dalla
sequenza
Quando un gene e’ trasferito, per traslocazione, trasfezione
o integrazione, in una posizione adiacente
all’eterocromatina, puo’ diventare inattivo,
eterocromatinizzandosi
Effetto epigenetico o variegazione per effetto da
posizione
-L’inattivazione si diffonde dall’eterocromatina alle regioni
adiacenti
per
una
distanza
variabile
-In genere l’inattivazione di un gene avviene durante le
prime fasi dello sviluppo embrionale e successivamente il
gene e’ erediatato come tale dalle cellule discendenti
Fasi
dell’eterocromatinizzazione:
-nucleazione (inizia in
sequenze specifiche)
-propagazione imprecisa
lungo il cromosoma
Le proteine leganti la cromatina
hanno domini comuni
• Cromo-domini
HP1, hanno come target
l’eterocromatina
• Bromo-domini
Presente in una varieta’
di proteine che
interagiscono con la
cromatina aperta, in
particolare con le istone
acetilasi e fattori di
trascrizione
La proteina HP1
H3-> deacetilato
->metilato
->legato ad HP1
Inattivazione del cromosoma X
femminile:compensazione da dosaggio
Si riattiva
durante
l’oogenesi
Inattivazione
Aumenta
I 2 X degli
random di
l’espressione
ermafroditi
un X,
dell’X maschile esprimono in
ereditata
cromosomi
modo ridotto
dalle cellule
politenici
discendenti
iperattivi
Il cromosoma X
•
•
•
•
Elementi LINE
Sequenze Alu ricche di GC
Sequenze ripetute invertite e LTR
Ricco di geni sesso-specifici, come geni espressi
nel muscolo, nel cervello, e geni della prima
spermatogenesi
Inattivazione dell’X nei mammiferi
-Il centro dell’inattivazione di uno
dei 2 cromosomi X e’ il locus XIC
o centro dell’inattivazione dell’X
-Se questo locus viene inserito
in un autosoma, questo viene
inattivato
-Xic e’ un locus cis-agente da cui
parte
l’eterocromatinizzazione
che si estende su tutto il
cromosoma in entrambe le
direzioni
-Di tutto il cromosoma X inattivo
c’e’ il gene Xist (X inactive
specific transcript) che e’
attivo solo nel cromosoma
inattivo
-Xist codifica un trascritto privo di schemi di
lettura, quindi un RNA che non produce
proteina (ncRNA)
-L’Rna di Xist si trova solo sul cromosoma
inattivo
-Studi condotti sulle cellule di topo, hanno
dimostrato
che
Xist
e’
prodotto
precocemente da entrambi i cromosomi, ma
essendo l’RNA molto instabile, viene
facilmente degradato,e solo sul cromosoma
in cui viene stabilizzato, va a ricoprire il
cromosoma poi inattivato
-Il cromosoma inattivo e’ visibile durante
l’interfase come corpuscolo scuro associato
alla membrana nucleare, detto Corpo di
Barr
- Il cromosoma X inattivo si replica piu’
lentamente degli altri a causa della sua
cromatina molto condensata, ricca di istoni
H3 e H4 ipoacetilati
-Il locus XIST da solo non basta, ma servono
elementi che percepiscono il numero dei
cromosomi X e della scelta del cromosoma da
inattivare
- L’elemento della conta sembra essere
localizzato a valle di Xist (3’)
- L’elemento della scelta sembra risiedere nel locus
XIC
- E’ veramente random la scelta dell’X da inattivare?
Sembra che nei marsupiali e nei tessuti
extraembrionali di topo l’inattivazione dell’X e’
imprinted (o paterno o materno), Importante un
elemento a valle di Xist, che modifica il rapporto
50:50 dell’inattivazione
Geni che sfuggono all’inattivazione
dell’X
• Sono geni che hanno dei loro omologhi nel
cromosoma Y
• Il loro escape dipende dalla sequenza
genica e non dalla loro posizione
• I geni che sfuggono all’inattivazione dell’X
hanno una regione 5’ meno ricca di CpG
• I geni attivi nell’X inattivo sono circondati
da INSULATORS
Insulator
Sequenza di DNA agente in cis, che
previene il passaggio di effetti attivanti o
inattivanti
Le isole CpG
-Lo 0.7% del genoma umano
contiene
doppietti
CpG
-Il 2-7% delle citosine del DNA dei
mammiferi
sono
metilate
-La maggior parte dei gruppi
metile si trovano nelle isole CpG
- La metilazione avviene ad opera
di Metilasi e demetilasi del DNA
La metilazione ha vari tipi di targets
• CpG di promotori, che sono metilati
quando il gene e’ inattivo o demetilati nel
gene attivo
• CpG di DNA satellite, che, metilato,
stabilizza il DNA centromerico
Le metilazioni del DNA sono responsabili di
-IMPRINTING
-patologie
-espressione tessuto-specifica
-Differenziamento cellulare
-Vecchiaia
-Carcinogenesi (ipometilazione di promotori di
oncogeni o ipermetilazione di promotori di
oncosoppressori-> riprogrammazione dello stato
cromatinico)
-Inattivazione dell’X
IMPRINTING
• Alleli materni o paterni sono ereditati metilati o
no
differente comportamento tra gli alleli
ereditati da ogni genitore
Se l’allele paterno
attivo porta una
mutazione
l’embrione presenta
il fenotipo malato
Se l’embrione e’
femmina il gene
viene metilato nei
gameti durante la
gametogenesi
Se l’embrione e’
maschio il gene
materno deve essere
demetilato
L’IMPRINTING e’ regolato dallo stato di metilazione di una
sequenza cis-agente vicina al gene, chiamata DMD o ICR
(imprinting control region); la sua delezione rimuove
l’imprinting
Geni con opposto
imprinting regolati dallo
stesso ICR, che
funziona da insulator
IL REPRESSORE Kox1 che porta il dominio
KRAB
Proteine che contengono domini zinc-finger e KruppelDomini di
associated boxes
repressione
trascrizionale
Domini di
legame al
DNA
Domini di
repressione
trascrizionale
attivi sulle RNA
polimerasi I,II e II
Come funziona la repressione
trascrizionale operata da Krab?
Condensazione
reversibile della
cromatina
Sistemi ibridi TetR-KRAB
per accendere e spegnere
l’espressione genica eucariotica
La tetraciclina
stacca il
repressore da
TetO e attiva
l’operone
Repressore TetR che
blocca l’espressione
dell’operone Tet
TetO
TetA
TetR
Proteina di
efflusso della
tetraciclina
Proteina
repressore
Proteina di fusione KRAB-TetR
Geni eucariotici inducibili e reprimibili basati
sul repressore procariotico TetR-TetO
Repressore KRAB
KRAB
KRAB
tTR
tTR
Repressore della
tetraciclina tetR
QUALI SONO LE MUTAZIONI
GENICHE RILEVANTI NELLO
SVILUPPO E MANTENIMENTO
DEL TUMORE?
STUDIO DELLA GENESI DEL
MELANOMA DIPENDENTE
DALL’ESPRESSIONE DI
H-RasV12G IN TOPI INK4a -/-,
QUINDI PRIVI DELL’ATTIVITA’
DI SOPPRESSIONE DEL
TUMORE
MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI
ANIMALE
TRANSGENICO-> tutte
le cellule nucleate
contengono il transgene
ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI
a
b
Progenie con
cellule germinali
portatrici del
transgene
Eredita’ mendeliana del
transgene
Cellule germinali aploidi
50% +
50% -
KRA
KRA
B
B
tTR
tTR
TetO
P
RISOMMINISTRAZIONE
DI DOXICICLINA
RasV12G